基于GC-IMS的呼出氣體中三甲胺檢測(cè)方法研究

莫寒以 高曉光 賈 建 何秀麗* 李建平

(1.中國(guó)科學(xué)院空天信息創(chuàng)新研究院 傳感技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 電子電氣與通信工程學(xué)院，北京 100049)

關(guān)鍵字：慢性腎病 呼出氣體 三甲胺 氣相色譜-離子遷移譜

慢性腎病(Chronic Kidney Disease, CKD)發(fā)病率高、預(yù)后差，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。三甲胺(Trimethylamine，TMA)僅在CKD患者呼出氣體中檢出，是一種極有潛力的標(biāo)志物[1]。呼出氣體成分復(fù)雜、水汽含量高，待測(cè)物質(zhì)濃度低，檢測(cè)難度大。開發(fā)一種準(zhǔn)確、快速、便攜、操作簡(jiǎn)單的呼出氣體中TMA檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)CKD早篩、病情監(jiān)測(cè)具有重要意義。

國(guó)內(nèi)外開展了多項(xiàng)針對(duì)呼出氣體檢測(cè)的研究，主要包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法(Gas Chromatography-Mass Spectrometry, GC-MS)[1，2]、電子鼻技術(shù)[3]、多束毛細(xì)管柱/氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用方法(Multi Capillary Column/Gas Chromatography-Ion Mobility Spectrometry, MCC/GC-IMS)[4-6]。GC-MS方法檢測(cè)精確，能得到豐富的樣品信息，但需要富集等預(yù)處理工作，操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)。且MS工作在真空條件下，儀器體積較大，床邊監(jiān)測(cè)與大規(guī)模普及存在困難。電子鼻體積小成本低，可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，但易受環(huán)境影響，難以抵抗?jié)穸雀蓴_[7]。

IMS根據(jù)不同離子在均勻電場(chǎng)中遷移速度的差異來對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離檢測(cè)[8]。IMS靈敏度高，檢出限低至10-3mg/m3量級(jí)，可對(duì)呼出氣體中痕量物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。且其工作在大氣壓下，相對(duì)質(zhì)譜結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于便攜化，操作方便。使用IMS對(duì)呼出氣體進(jìn)行檢測(cè)成為了一個(gè)研究熱點(diǎn)，先后出現(xiàn)了許多相關(guān)報(bào)道。IMS常與MCC或GC聯(lián)用對(duì)呼出氣體中的多種物質(zhì)進(jìn)行分離，減少?gòu)?fù)雜環(huán)境對(duì)檢測(cè)的影響，提高檢測(cè)能力。有報(bào)道采用上述聯(lián)用方法進(jìn)行肺部感染[5]、惡性胸膜間皮瘤[9]、呼吸道感染等疾病的檢測(cè)[10]。

目前已有將IMS技術(shù)用于TMA檢測(cè)的報(bào)道。Gheorghe等人使用IMS檢測(cè)雞肉中揮發(fā)的TMA濃度，判斷肉類的腐敗程度[11]。李海洋等人使用光致電離IMS對(duì)TMA標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出限低至2.64*10-3mg/m3[12]。M?kinen等人研究了濕度對(duì)TMA檢測(cè)的影響，結(jié)果表明，濕度會(huì)對(duì)TMA的IMS譜峰位置及峰的形狀有明顯影響[13]，導(dǎo)致出現(xiàn)定性不準(zhǔn)的現(xiàn)象。呼出氣體中含有大量水汽，受TMA易吸附、易溶于水的特性及復(fù)雜基質(zhì)的影響，基于IMS技術(shù)呼出氣體TMA檢測(cè)的難度較大，相關(guān)報(bào)道較少[14]。前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在空氣作為載氣的情況下，TMA產(chǎn)物離子峰與反應(yīng)物離子峰位置接近，故使用IMS對(duì)呼出氣體中的TMA進(jìn)行檢測(cè)仍然存在困難。本研究針對(duì)目前IMS在TMA檢測(cè)中存在的問題，搭建GC-IMS聯(lián)用系統(tǒng)，研究系統(tǒng)參數(shù)對(duì)檢測(cè)的影響。通過摻雜及GC預(yù)分離消除復(fù)雜基質(zhì)對(duì)TMA檢測(cè)的干擾，實(shí)現(xiàn)TMA高靈敏度、快速檢測(cè)，并探討系統(tǒng)對(duì)實(shí)際樣本中TMA檢測(cè)的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

TMA標(biāo)準(zhǔn)氣體(26.4mg/m3，稀釋氣體為氮?dú)?，光明特種氣體有限公司)；氨基甲酸銨(Fluka，分析純)；四丁基溴化銨(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)。

1.2 GC-IMS系統(tǒng)

GC-IMS系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1所示，系統(tǒng)由GC與IMS兩部分構(gòu)成。GC部分包括長(zhǎng)15m、直徑0.535 mm、膜厚1.5 μm的DB-5氣相色譜柱(安捷倫科技有限公司，美國(guó))，以及恒溫40℃的平面六通切換閥(創(chuàng)導(dǎo)科學(xué)儀器有限公司，中國(guó))。5mL定量環(huán)與氣體導(dǎo)管均為直徑1/16英寸的聚四氟乙烯管。

圖1 GC-IMS系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖

IMS為實(shí)驗(yàn)室自制，主要由漂移管、電離源、外部電路組成。其核心為漂移管，由聚四氟乙烯環(huán)與不銹鋼環(huán)交替堆疊而成，被離子?xùn)砰T分隔為離化區(qū)與漂移區(qū)。IMS前端安裝有圓柱形聚四氟乙烯塞，其上有4個(gè)通孔，3個(gè)通孔用于排出漂移氣，1個(gè)通孔用于固定進(jìn)樣導(dǎo)管，將樣品氣導(dǎo)入離化區(qū)。從法拉第盤后端引入漂移氣，漂移氣與載氣均選用經(jīng)活性炭、硅膠、分子篩過濾后的潔凈空氣，保證漂移管的潔凈。將滲透管放置于過濾器中，摻雜劑隨著漂移氣到達(dá)離化區(qū)，生成反應(yīng)離子。樣品與反應(yīng)離子發(fā)生分子-離子反應(yīng)，生成的產(chǎn)物離子在漂移電場(chǎng)的作用下到達(dá)法拉第盤，該離子流信號(hào)經(jīng)處理后顯示到計(jì)算機(jī)。

電暈放電IMS一般選用金屬針作為放電針，樣品通過單獨(dú)導(dǎo)管送入離化區(qū)。該結(jié)構(gòu)進(jìn)樣流量大，有助于提高檢測(cè)靈敏度。但金屬針容易氧化，長(zhǎng)時(shí)間使用尖端鈍化影響放電特性。實(shí)驗(yàn)對(duì)常用放電和進(jìn)樣結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改進(jìn)：選用內(nèi)徑為0.4mm的空心金屬管做進(jìn)樣導(dǎo)管，在導(dǎo)管前端焊接一細(xì)鉑絲作為電暈放電針，實(shí)現(xiàn)了放電和進(jìn)樣一體化結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)中樣品在導(dǎo)管出口處被電離，減小了漂移氣對(duì)樣品的稀釋作用，更適用于IMS與GC聯(lián)用時(shí)的小流量進(jìn)樣。

GC-IMS系統(tǒng)主要參數(shù)如表1所示。

表1 GC-IMS系統(tǒng)主要參數(shù)

1.3 樣品配制

實(shí)驗(yàn)需要用到低濃度TMA標(biāo)準(zhǔn)樣品以及呼出氣體TMA加標(biāo)樣品。TMA易吸附、易溶解于水，靜態(tài)配氣會(huì)帶來較大的濃度誤差。利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的配氣裝置，采用動(dòng)態(tài)配氣方法配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品[15]。動(dòng)態(tài)配氣裝置如圖2(a)所示，采用兩級(jí)稀釋法配制樣品。流量計(jì)1控制壓縮空氣流量，流量計(jì)2控制標(biāo)準(zhǔn)氣體流量，兩路氣體混合后形成第一級(jí)稀釋氣體。流量計(jì)3控制壓縮空氣流量，流量計(jì)4控制第一級(jí)稀釋氣體流量，背壓閥釋放多余氣體，兩路氣體混合后得到第二級(jí)稀釋氣體。

呼出氣體TMA加標(biāo)樣品配制裝置如圖2(b)所示。恒溫40℃的玻璃注射器采集50 mL呼出氣體，注射泵(哈佛生物科學(xué)有限公司，美國(guó))控制呼出氣體流量。流量計(jì)控制TMA標(biāo)準(zhǔn)氣體流量，兩路氣體混合后形成加標(biāo)樣品。注射泵流量設(shè)定為99.5 mL/min，TMA標(biāo)準(zhǔn)氣體流量設(shè)定為0.5 mL/min，混合后得到TMA濃度為1.32*10-1mg/m3的加標(biāo)樣品。呼出氣體經(jīng)過的所有管道均加熱恒溫40℃。

圖2 配氣裝置示意圖

呼出氣體是由肺泡氣與殘留在呼吸道死區(qū)中的環(huán)境氣體組成，因?yàn)榉闻輾庵袚]發(fā)性有機(jī)物(Volatile Organic Compounds，VOCs)的濃度約為混合呼氣中的3倍[16]，所以選用肺泡氣作為呼出氣體分析的樣品。肺泡氣體采集過程如下：將活塞與針筒分離，手握針筒，深吸氣后從針頭固定端向活塞開口端吹氣，直到完成一次深呼吸。呼出氣體前段排出，呼氣末塞緊活塞，確保采集到肺 泡氣。

2 結(jié)果與討論

GC-IMS系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果為二維譜圖：橫坐標(biāo)為漂移時(shí)間，表示不同物質(zhì)在IMS漂移電場(chǎng)中的飛行時(shí)間；縱坐標(biāo)為保留時(shí)間，表示不同物質(zhì)在GC柱中的停留時(shí)間。選取二維譜圖中產(chǎn)物離子峰強(qiáng)度最大時(shí)保留時(shí)間對(duì)應(yīng)IMS譜圖來做下列討論。

2.1 摻雜對(duì)TMA檢測(cè)的影響

使用上述系統(tǒng)對(duì)濃度為2.64*10-1mg/m3的TMA標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行檢測(cè)。漂移氣為無摻雜劑的潔凈空氣，漂移管工作溫度為180℃，放電電壓為9 kV。系統(tǒng)空白譜圖與TMA譜圖如圖3所示。圖中峰3對(duì)應(yīng)的是反應(yīng)離子H+(H2O)n，峰1與峰2分別對(duì)應(yīng)(NH4)+(H2O)n和(NO)+(H2O)n。TMA譜圖中緊貼H+(H2O)n處出現(xiàn)了離子峰4，推測(cè)該峰為TMA產(chǎn)物離子峰，但由于其與反應(yīng)物離子峰基本重合，因此無法實(shí)現(xiàn)TMA的檢測(cè)。

圖3 未摻雜時(shí)IMS空白譜圖及TMA譜圖

為消除反應(yīng)物離子峰H+(H2O)n對(duì)TMA產(chǎn)物離子峰的干擾，可使用摻雜方式抑制水的電離[12]。TMA和水的質(zhì)子親和勢(shì)分別為948.9 kJ/mol和691 kJ/mol，所以選用質(zhì)子親和勢(shì)為853.6kJ/mol的氨作為摻雜劑[17]，既抑制了水的電離，又不影響TMA的檢測(cè)。氨摻雜下的空白譜與1.32*10-1mg/m3TMA譜圖如圖4所示。空白譜中僅有一個(gè)反應(yīng)物離子峰NH4+(H2O)n，水合質(zhì)子峰消失，水的電離受到抑制。觀察TMA檢測(cè)譜圖，氨摻雜時(shí)譜圖中僅出現(xiàn)一個(gè)產(chǎn)物離子峰，該峰有較高的信號(hào)強(qiáng)度。對(duì)濃度為1.32*10-1mg/m3與2.64*10-1mg/m3標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行檢測(cè)，該峰信號(hào)強(qiáng)度分別為0.207與0.355，證明了其強(qiáng)度隨TMA濃度升高而增強(qiáng)，所以此峰即為TMA特征離子峰。TMA特征離子峰的漂移時(shí)間約為9.2ms，約化遷移率可由公式1計(jì)算得到：

圖4 氨摻雜時(shí)IMS空白譜圖及TMA譜圖

(1)

其中，K與Kstd分別為待測(cè)物和標(biāo)定物的約化遷移率，t與tstd分別為待測(cè)物和標(biāo)定物的漂移時(shí)間。使用四丁基溴化銨作為標(biāo)定物，其約化遷移率為1.33cm2/(V?s)[18]。通過計(jì)算得到TMA約化遷移率約為2.25/(V?s)，與文獻(xiàn)報(bào)道TMA單體約化遷移率相符[13]。

實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證氨摻雜對(duì)呼出氣體檢測(cè)的效果。用注射泵將呼出氣體以40 mL/min送入系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。呼出氣體中含有多種VOC，在無摻雜劑時(shí)，譜圖中出現(xiàn)了多個(gè)高強(qiáng)度的產(chǎn)物離子峰，影響TMA的檢測(cè)。由于摻雜劑的存在，呼出氣體中VOCs電離受到抑制，所以氨摻雜時(shí)得到的譜圖中僅出現(xiàn)少量低強(qiáng)度產(chǎn)物離子峰，有利于實(shí)現(xiàn)呼出氣體中TMA的檢測(cè)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均在氨摻雜情況下進(jìn)行。

圖5 呼出氣體IMS譜圖

2.2 漂移管溫度與放電電壓的選擇

呼出氣體含有豐富的水汽和VOCs，溫度過低水汽易凝結(jié)，其中氨、丙酮等物質(zhì)具有較高的濃度[5,19]，容易在漂移管內(nèi)殘留引入污染，所以IMS需要工作在較高溫度下。IMS系統(tǒng)允許工作溫度低于190℃，在140～190℃范圍內(nèi)，以10℃為間隔對(duì)濃度為1.32*10-1mg/m3的TMA標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行檢測(cè)，以選擇合適的漂移管工作溫度。不同漂移管溫度下的TMA譜圖如圖6所示，其中放電電壓為9 kV。由于遷移率與溫度成正相關(guān)，當(dāng)溫度升高時(shí)，產(chǎn)物離子峰與反應(yīng)物離子峰均左移。

圖6 不同漂移管溫度下的TMA譜圖

圖7是TMA特征離子峰信號(hào)強(qiáng)度與溫度關(guān)系曲線。在漂移管溫度為180℃時(shí)，TMA特征離子峰有最高的信號(hào)強(qiáng)度，所以漂移管溫度設(shè)定為180℃。

圖7 TMA特征離子峰信號(hào)強(qiáng)度-溫度關(guān)系

電暈放電的起始放電電壓約為8.8 kV，在8.8～9.7 kV區(qū)間以100 V為間隔對(duì)濃度為1.32*10-1mg/m3的TMA標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行檢測(cè)。圖8為TMA特征離子峰信號(hào)強(qiáng)度與放電電壓關(guān)系曲線。從圖中可以看到放電電壓越高，信號(hào)強(qiáng)度越小。

圖8 TMA特征離子峰信號(hào)強(qiáng)度-放電電壓關(guān)系曲線

通常情況下，放電電壓越高，放電越劇烈，在一定范圍內(nèi)離子峰信號(hào)強(qiáng)度隨電壓升高而增強(qiáng)。圖8中沒有出現(xiàn)上升趨勢(shì)可能是因?yàn)門MA化學(xué)性質(zhì)活潑，在放電過程中形成TMA碎片。隨著放電電壓升高，會(huì)有更多的TMA碎片形成，因此被電離的TMA分子減少，特征離子峰的信號(hào)強(qiáng)度降低。

為保證放電的穩(wěn)定性，同時(shí)得到較大的信號(hào)強(qiáng)度，選擇放電電壓為9 kV。

2.3 TMA標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測(cè)

選用氨進(jìn)行摻雜，在漂移管溫度為180℃、放電電壓設(shè)定為9 kV時(shí)，對(duì)不同濃度TMA標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行測(cè)試，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)試5次，得到濃度響應(yīng)曲線如圖9所示。TMA理論檢出限(3倍信噪比)1.21*10-3mg/m3，檢測(cè)線性范圍1.32*10-2～2.64*10-1mg/m3，R2=0.9933，RSD最大值2.4%、平均值1.3%。TMA在CKD患者呼出氣體中濃度為4.65*10-3～1.0*10-1mg/m3[1]，系統(tǒng)滿足檢測(cè)要求。

圖9 TMA濃度響應(yīng)曲線

2.4 呼出氣體TMA加標(biāo)檢測(cè)

為驗(yàn)證系統(tǒng)在復(fù)雜基質(zhì)下對(duì)TMA的檢測(cè)能力，進(jìn)行了呼出氣體TMA加標(biāo)檢測(cè)。TMA加標(biāo)濃度為1.32*10-1mg/m3，測(cè)試得到的GC-IMS譜圖如圖10(a)所示。圖中出現(xiàn)了4個(gè)產(chǎn)物離子峰，其中峰1為TMA的特征離子峰。從GC保留時(shí)間上看，峰1-4對(duì)應(yīng)的4種物質(zhì)保留時(shí)間分別約為17.0 s、13.5 s、13.1 s及20.1 s。TMA有拖尾現(xiàn)象，但特征離子峰最高值出現(xiàn)時(shí)間與其他3種物質(zhì)不同，GC在一定程度上實(shí)現(xiàn)了TMA與呼出氣體中其它物質(zhì)的分離。

圖10(b)為加標(biāo)樣品中TMA特征離子峰信號(hào)強(qiáng)度最高時(shí)IMS譜圖與同濃度TMA標(biāo)準(zhǔn)樣品譜圖。兩圖中TMA譜峰位置無變化，3次檢測(cè)計(jì)算呼出氣體TMA加標(biāo)回收率為93.6%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GC-IMS系統(tǒng)中GC的預(yù)分離減小了呼出氣體中其它VOCs對(duì)TMA檢測(cè)的干擾，從一定程度上減小了由于離子競(jìng)爭(zhēng)而導(dǎo)致的IMS定量檢測(cè)不準(zhǔn)的問題，具有較好的呼出氣體檢測(cè)應(yīng)用前景。

圖10 TMA的GC-IMS譜圖

3 結(jié)論

開展了基于氣相色譜-離子遷移譜(GC-IMS)的呼出氣體TMA檢測(cè)方法研究。針對(duì)IMS與GC聯(lián)用的小流量進(jìn)樣需求設(shè)計(jì)了放電進(jìn)樣一體化結(jié)構(gòu)。采用氨摻雜的方法避免了反應(yīng)物離子峰對(duì)TMA特征離子峰的干擾，同時(shí)抑制了呼出氣體復(fù)雜基質(zhì)的影響。系統(tǒng)對(duì)TMA檢測(cè)靈敏度高，檢出限為1.21*10-3mg/m3，在TMA濃度為1.32*10-2～2.64*10-1mg/m3時(shí)具有良好的線性，滿足CKD患者呼出氣體中TMA檢測(cè)需求。通過呼出氣體TMA加標(biāo)檢測(cè)，驗(yàn)證了系統(tǒng)在復(fù)雜基質(zhì)下對(duì)TMA檢測(cè)的抗干擾能力?；贕C-IMS的呼出氣體中TMA檢測(cè)方法靈敏度高、檢測(cè)速度快、抗干擾能力好，在CKD早篩及病情監(jiān)測(cè)方面具有較好的應(yīng)用前景。