高效液相色譜法測(cè)定食用油中9種抗氧化劑

晁桂梅

(上海市崇明食品藥品檢驗(yàn)所/崇明食品安全檢測(cè)中心，上海 202150)

食用油是我們生活中的必需品之一，但油脂極易被氧化，不宜長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存。氧化不僅會(huì)使食用油退色、變色，而且還會(huì)破壞食用油中的維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而降低食用油的感官品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，使其變質(zhì)，甚至產(chǎn)生有害物質(zhì)，引起食物中毒等現(xiàn)象。食品抗氧化劑是能阻止或延緩食品氧化變質(zhì)、提高食品穩(wěn)定性和延長(zhǎng)貯存期的食品添加劑[1]。目前，食品抗氧化劑在食用油中的使用極為廣泛，常用的食品抗氧化劑種類包括有人工合成的叔丁基對(duì)羥基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基對(duì)甲基苯酚(BHT)、沒(méi)食子酸丙酯(PG)、叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)等物質(zhì)。這些抗氧化劑都是有效的自由基吸收劑，能吸收氧化產(chǎn)生的自由基，阻斷自由基鏈鎖反應(yīng)，將油脂被氧化產(chǎn)生的自由基轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的產(chǎn)物，消除脂類氧化的自由基反應(yīng)，進(jìn)而中止脂類的氧化反應(yīng)[2]?，F(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[3]及文獻(xiàn)報(bào)道多采用氣相色譜法[4，5]、氣相色譜-質(zhì)譜法[6，7]、高效液相色譜法[8-11]以及液相色譜-質(zhì)譜法[12，13]測(cè)定食品中抗氧化劑含量，本研究選擇高效液相色譜法，與現(xiàn)有報(bào)道相比[14-15]，可以同時(shí)測(cè)定食用油中9種抗氧化劑，且具有操作簡(jiǎn)便、分析速度較快、檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)勢(shì)。

本研究以食用油為試驗(yàn)材料，用正己烷溶解，乙腈提取，固相萃取柱凈化后，通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定，外標(biāo)法定量，得到同時(shí)測(cè)定食用油中9種抗氧化劑的色譜條件，并進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，以驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確度和精密度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜(美國(guó)安捷倫公司)；渦旋振蕩器、離心機(jī)、氮吹儀(美國(guó)Thermo Scientific)；電子天平(美國(guó)梅特勒-托利多國(guó)際有限公司)；乙腈、正己烷、甲醇(色譜純，上海安普科技股份有限公司)；無(wú)水硫酸鈉(分析純，天津化工有限公司)；C18固相萃取柱 2000 mg/12mL、0.22 μm微孔有機(jī)系濾膜(上海安普科技股份有限公司)；食用油(市售)。

9種抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的信息如表1所示?？寡趸瘎?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取0.1 g(精確至0.1 mg)固體抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成濃度為1000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液，0℃～4℃避光保存。移取適量體積的濃度為1000 mg/L的抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合儲(chǔ)備液分別稀釋至濃度為5、10、20、50、100、200、400 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。

表1 9種抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息

1.2 試驗(yàn)方法

稱取1 g(精確至0.01 g)試樣于50 mL離心管中，加入400 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液500 μL，加入5 mL乙腈飽和的正己烷溶液溶解樣品，渦旋1 min，靜置10 min，用5 mL正己烷飽和的乙腈溶液渦旋提取2 min，3000 r/min離心5 min，收集乙腈層于試管中，再重復(fù)使用5mL正己烷飽和的乙腈溶液提取2次，合并3次提取液，待凈化。在C18固相萃取柱中裝入約2 g的無(wú)水硫酸鈉，用5 mL甲醇活化萃取柱，再以5 mL乙腈平衡萃取柱，棄去流出液。將所有提取液傾入柱中，棄去流出液，再以5 mL乙腈和甲醇的混合溶液洗脫，收集所有洗脫液于試管中，40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加2 mL乙腈定容，過(guò)0.22 μm 有機(jī)系濾膜，供液相色譜測(cè)定。

1.3 色譜條件

色譜柱：XDB C18(Agilent，5 μm，0.46×25 cm)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：35℃；流動(dòng)相A：0.5%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：甲醇，流動(dòng)相C：乙腈，洗脫程序如表2所示；檢測(cè)器：VWD；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；定量方法：外標(biāo)法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Agilent 1260自帶化學(xué)工作站C.01.07.[27]及Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相比例及洗脫程序優(yōu)化

在保持色譜柱、流速、進(jìn)樣量、柱溫、檢測(cè)器及檢測(cè)波長(zhǎng)不變的條件下，通過(guò)不斷調(diào)整流動(dòng)相比例及洗脫程序，改善了9種抗氧化劑的分離度和靈敏度，優(yōu)化洗脫程序后得到的具體參數(shù)如表2所示。該洗脫程序條件下，9種抗氧化劑的分離度均大于1.5，且靈敏度較高。在此洗脫程序的基礎(chǔ)上，若繼續(xù)增加21～29 min時(shí)間段甲醇和乙腈流動(dòng)相的比例，會(huì)導(dǎo)致分離效果不佳，其中BHT與DG的分離度小于1.5，達(dá)不到分離要求；若繼續(xù)增加21～29 min時(shí)間段甲醇和乙腈流動(dòng)相的比例，雖然分離度有所改善，但部分目標(biāo)物的響應(yīng)值明顯有所下降，其中同等濃度下TBHQ的峰面積降至原來(lái)的90%，且BHT及DG目標(biāo)峰的半峰寬變大，峰高變小，峰型變差。比較得出，采用表2中的參數(shù)作為本試驗(yàn)的色譜條件，得到9種抗氧化劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示。

圖1 9種抗氧化劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

表2 流動(dòng)相比例及洗脫程序

2.2 線性方程、檢出限、定量限

采用1.3及表2中洗脫程序作為色譜條件，依次測(cè)定濃度為5、10、20、50、100、200、400 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，以相應(yīng)目標(biāo)化合物的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制9種抗氧化劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各項(xiàng)目的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，并參照GB 5009.32-2016[3]，以各目標(biāo)峰的信噪比S/N≥3和S/N≥10分別確認(rèn)9種抗氧化劑的檢出限和定量限(見(jiàn)表3)。

表3 9種抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程、檢出限和定量限

2.3 加標(biāo)回收率和精密度

選擇不含上述9種抗氧化劑的空白食用油樣品，準(zhǔn)確添加質(zhì)量濃度分別為20和200 mg/kg 兩個(gè)濃度點(diǎn)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各做6份平行試樣，按1.2樣品處理方法進(jìn)行處理，測(cè)定2個(gè)濃度、6個(gè)平行的加標(biāo)回收試驗(yàn)，表4為計(jì)算得到的加標(biāo)回收率和精密度。

表4 食用油中9種抗氧化劑加標(biāo)試驗(yàn)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

表4可知，兩種基質(zhì)中9種抗氧化劑兩個(gè)濃度點(diǎn)6個(gè)平行的加標(biāo)回收率平均值在 92.4%～110.0% 之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.1%～4.8%之間，其準(zhǔn)確度和精密度均滿足實(shí)驗(yàn)室及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.32-2016[3]測(cè)定要求。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立的同時(shí)檢測(cè)食用油中9種抗氧化劑的高效液相色譜法，與GB 5009.32-2016國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法相比，改變了流動(dòng)相洗脫梯度，降低了除PG外的8種抗氧化劑的檢出限，及9種抗氧化劑的定量限，提高了檢測(cè)的靈敏度。該方法能有效去除基質(zhì)干擾，在線性范圍、分離度、準(zhǔn)確度和精密度等方面均滿足日常檢測(cè)要求。