基于金納米顆粒/共價有機(jī)骨架COF-TpPa-1無標(biāo)記型C-反應(yīng)蛋白免疫傳感器的研制

白茹燕，張坤蕾，胡 蓉，楊云慧*

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)海源學(xué)院，云南昆明650000)

(2.云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，云南昆明650500)

0 引言

C-反應(yīng)球蛋白（C-reactive protein,CRP）是由5個相同亞基以非共價形式結(jié)合而成的五聚體，屬于肝細(xì)胞合成的急性期蛋白之一[1]。正常人體CRP水平在機(jī)體受到感染或損傷時急劇上升,因此CRP可作為炎癥指標(biāo)，輔助診斷炎癥相關(guān)性疾病[2]。是目前臨床上所公認(rèn)的炎癥標(biāo)記物以及血清膽固醇的高度特征的急性期蛋白質(zhì)[3]。它已成為監(jiān)測自身免疫和感染性疾病的重要指標(biāo)[4]，如在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和動脈粥樣硬化等疾病中的監(jiān)測[5]。 正常人體內(nèi)CRP的含量一般小于2 mg/L，在急性組織損傷后或在感染性和非感染性疾病過程中由肝臟產(chǎn)生的CRP急劇升高[6]。 例如，病毒感染時CRP含量為10～40 mg/L，細(xì)菌感染時CRP質(zhì)量濃度為40～200 mg/L[7]。因此CRP的測定對于腫瘤疾病的檢測、治療和預(yù)后有重要意義，急需發(fā)展準(zhǔn)確、快速、靈敏的檢測方法來進(jìn)行檢測[8]。近年來，電化學(xué)檢測法由于自身特有的優(yōu)點(diǎn)已被廣泛地應(yīng)用于各種生物分子的檢測。然而，通常采用辣根過氧化物酶做標(biāo)記物來研制的電化學(xué)免疫傳感器存在酶不穩(wěn)定，容易失活的缺點(diǎn)。因此，需要尋找新型穩(wěn)定的抗體標(biāo)記材料來代替辣根過氧化物酶，制備新型的電化學(xué)傳感器來檢測CRP[9]。

共價有機(jī)框架 （covalent organic framework，COF）材料，是近年來新興起的一類有機(jī)多孔材料，由于該材料具有高的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性與化學(xué)穩(wěn)定性）、較大的比表面積及較大的孔容等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。如在氣體存儲，非均相催化、光電方面、電化學(xué)傳感器方面都有廣泛的應(yīng)用。盡管COF的良好有序的周期性和高表面積促進(jìn)了這些材料作為催化劑載體的使用，但是在酸性-堿性水溶液反應(yīng)介質(zhì)中主體COF載體的穩(wěn)定性仍然是在多個循環(huán)中使用相同催化劑的關(guān)鍵方面[10],雖然COF材料的表面積有限，但是納米顆粒負(fù)載的COF已經(jīng)被用在了Suzuki偶聯(lián)反應(yīng)、C-H活化、Knoevenagel縮合反應(yīng)、硝基還原等反應(yīng)中[11-12]。由于修飾了金屬納米顆粒的COF基載體在水性和大多數(shù)有機(jī)溶劑中不穩(wěn)定，對于合成在水性和大多數(shù)有機(jī)溶劑中穩(wěn)定的材料相對復(fù)雜，因此,需要找到簡單的快速的方法來合成穩(wěn)定的遇水和有機(jī)溶劑不易坍塌的COF材料[13]。

該文采用1,4-對苯二胺、1,4-二氧六環(huán)、2,3,5-三甲苯、三甲酰基間苯三酚等材料合成了COF-TpPa-1材料，然后通過在該材料上負(fù)載Au納米顆粒用來固定CRP抗體，制備成了無標(biāo)記型C-反應(yīng)蛋白電化學(xué)免疫傳感器。修飾在電極上的Au NPs/COF-TpPa-1可直接催化對硝基苯酚的還原，利用抗體與抗原特異性結(jié)合后阻礙電子傳遞的原理實(shí)現(xiàn)對CRP抗原的定量檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

透射電鏡圖是在透射電鏡儀（TEM）JEM-2100（日本電子株式會社）所得；掃描電鏡圖是在掃描電子顯微鏡(SEM)S-3000N（Hitachiscience systemsltd,日本）所得；X射線粉末衍射圖是在X射線粉末衍射儀DX-2700（丹東方圓儀器有限公司）上測量；循環(huán)伏安法（CV）、差分脈沖伏安（DPV）和電化學(xué)交流阻抗是在CHI660D電化學(xué)工作站（中國上海辰華公司）測量，實(shí)驗(yàn)中采用三電極體系。

2，3，5-三甲苯（mesitylene）；三甲酰基間苯三酚（triformylphloroglucinol）購于北京百靈威科技有限公司；甲醇（CH3OH）購于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；丙酮（CH3COCH3)購于云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司，硼氫化鈉（NaBH4）購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；對硝基苯酚（C6H5NO3）購于麥克靈試劑有限公司，牛血清蛋白（BSA）、殼聚糖(CHIT)和磷酸緩沖溶液（PBS，pH7.40）均購于美國Sigma公司,C-反應(yīng)蛋白抗體(anti-CRP)、C-反應(yīng)蛋白（CRP）購于上海領(lǐng)潮生物科技有限公司。

1.2 材料的制備

1.2.1 COF-TpPa-1材料的合成

參照文獻(xiàn)[14]合成COF-TpPa-1材料，稱取三甲基間苯三酚(Tp)63 mg（0.3 mmol），對苯二胺(Pa-1)48 mg（0.45 mmol)，于反應(yīng)管中，抽真空，然后加入1.5 mL均三甲苯和1.5 mL 1,4-二氧六環(huán)和1.5 mL 3 mol/L的醋酸；混合超聲10 min，液氮冷凍下抽真空，連續(xù)三次真空凍融循環(huán)后，冷卻至室溫，然后轉(zhuǎn)移到120℃下反應(yīng)三天，通過無水丙酮過濾或者離心洗滌5～6次，然后在180℃下真空干燥24 h，得到產(chǎn)物。

1.2.2 Au NPs/COF-TpPa-1材料的合成

將上述合成的COF-TpPa-1材料（98.5 mg）溶解在5 mL甲醇溶液中，在劇烈攪拌下，將溶有1.5 mg,0.005 mmol HAuCl43H2O的甲醇溶液2 mL加入上述溶液中，然后將混合物蒸發(fā)至糊狀，然后再加入2 mL甲醇溶液和0.5 mmol NaBH4，攪拌30 min,將上述所得溶液用甲醇溶液離心洗滌，50℃下真空干燥，即制得Au NPs/COF-TpPa-1材料。

1.3 C-反應(yīng)蛋白免疫傳感器的研制

用金相砂紙將玻碳電極(Φ=3mm)打磨干凈，將電極表面在不同粒徑大小的Al2O3粉末下拋光，再把電極分別用硝酸水溶液(1∶1)、無水乙醇、蒸餾水各超聲洗滌5 min。將0.5%殼聚糖與1 mg/mL的Au NPs/COF-TpPa-1材料的1∶1（v∶v）混合均勻，修飾于經(jīng)過處理的玻碳電極上，自然晾干。滴加10μL 30μg/mL的CRP抗體，于4℃過夜干燥。用PBS緩沖溶液洗滌，晾干，滴加10 μL 1%的BSA滴加10μL 1%的BSA，37℃培育1 h，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，用PBS緩沖溶液洗滌并晾干。接著滴加不同濃度的CRP，37℃培育60 min，用PBS緩沖溶液洗去未結(jié)合的CRP然后進(jìn)行檢測。免疫傳感器的制備過程如圖1所示。

圖1 免疫傳感器的制備流程Fig.1 Fabrication steps of the immunosensor

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

將培育好的傳感器放入10 mL含有100μL 0.01 mol/mL對硝基苯酚的HAc-NaAc緩沖溶液（0.2 mol/mL,pH4.5）中進(jìn)行檢測。檢測方法為示差脈沖伏安法（DPV)，振幅50 mV,脈沖時間0.05 s,脈沖周期0.2 s。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用0.01 mol/L PBS洗干凈，置于4 mol/L的尿素溶液中攪拌浸泡30 min,洗脫電極上結(jié)合的抗原，以使電極再生。當(dāng)電極不用時，置于冰箱中4℃保存。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料表征

2.1.1 COF-TpPa-1固體核磁表征

圖2為COF-TpPa-1固體核磁圖譜，圖中出現(xiàn)中等強(qiáng)度峰的C=N鍵峰，說明材料中有C=N鍵的生成；而136.8 ppm、130.2 ppm、148.5 ppm和122 ppm處為苯環(huán)碳的特征峰，說明合成的COFTpPa-1材料由C=N鍵連接而成。

圖2 COF-TpPa-1的固體核磁譜圖Fig.2 MAS NMP spectrum of COF-TpPa-1

2.1.2 COF-TpPa-1材料的XRD圖

實(shí)驗(yàn)采用X射線衍射（XRD）對COF-TpPa-1材料進(jìn)行表征（如圖3所示），與文獻(xiàn)[14]對比，在2θ4.7°處出現(xiàn)明顯的特征峰，但是由于實(shí)驗(yàn)條件限制，所合成的COF-TpPa-1材料與文獻(xiàn)相比，晶型相對差一些，但催化效果較好。

圖3 COF-TpPa-1材料的XRD圖(a:該文合成的;b:標(biāo)準(zhǔn)的）[14]Fig.3 PXRD patterns of COF-TpPa-1(a:Synthesized;b:Simulated)[14]

2.1.3 COF-TpPa-1材料的孔徑

實(shí)驗(yàn)考察了COF-TpPa-1的孔徑(如圖4所示)。根據(jù)測定知道該材料的孔體積為0.087 cc/g（Pore Volume=0.087 cc/g），孔徑為3.789 nm（Pore Diameter Dv(d)=3.789 nm），與一般COF材料相比，COF-TpPa-1的孔徑相對較大。

圖4 COF-TpPa-1的孔徑圖Fig.4 Pore Diameter of COF-TpPa-1

2.1.4 COF-TpPa-1材料的觀形貌表征

實(shí)驗(yàn)采用SEM（掃描電鏡）、TEM（透射電鏡）表征了COF-TpPa-1材料的微觀形貌結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出COF-TpPa-1材料的形貌呈細(xì)小簇狀。

圖5 COF-TpPa-1材料的透射電鏡圖(a)和掃描電鏡圖(b)Fig.5 TEM(a)and SEM(b)images of COF-TpPa-1

2.1.5 Au NPs/COF-TpPa-1-材料的微觀形貌圖

采用TEM對Au NPs/COF-TpPa材料進(jìn)行了微觀形貌表征（見圖6），從圖中可看出，Au NPs顆粒被均勻的負(fù)載到COF-TpPa-1材料上。

圖6 Au NPs/COF-TpPa-1-材料的透射電鏡圖Fig.6 TEM images of Au NPs/COF-TpPa-1

2.2 COF-TpPa-1材料和Au NPs/COF-TpPa-1材料的催化性能

為了研究COF-TpPa-1材料和Au NPs/COF-TpPa-1材料對C6H5NO3的催化性能，將COF-TpPa-1材料和Au NPs/COF-TpPa-1材料通過殼聚糖修飾在電極上，采用示差脈沖伏安法（DPV）進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖7所示，其中a為裸電極在含有0.01 mol/L的對硝基苯酚的緩沖溶液中的DPV響應(yīng)曲線，b為修飾了COF-TpPa-1材料的電極對對硝基苯酚的響應(yīng)曲線；c是修飾了Au NPs/COF-TpPa-1材料對對硝基苯酚的DPV響應(yīng)曲線。由圖可看出Au NPs/COF-TpPa-1材料比COF-TpPa-1材料對對硝基苯酚的催化電流更大,說明負(fù)載了Au納米顆粒的COF-TpPa-1材料對C6H5NO3的催化具有更好的催化效果。

圖7 不同修飾材料對對硝基苯酚的還原峰電流a:裸電極;b:COF-TpPa-1/GCE;c:Au NPs/COF-TpPa-1/GCE Fig.7 The catalytic effect of different modified electrode to the reduction current of C6H5NO3;a:bare GCE;b:COFTpPa-1/GCE;c:Au NPs/COF-TpPa-1/GCE

2.3 免疫傳感器的電化學(xué)行為

為了進(jìn)一步了解CRP/anti-CRP/CHIT+Au NPs/COFs-TpPa-1/GCE免疫傳感器的電化學(xué)行為，實(shí)驗(yàn)還考察了掃描速度對CRP/anti-CRP/CHIT+Au NPs/COFs-TpPa-1/GCE免疫傳感器的峰電流的影響，當(dāng)掃描速度在10～100 mV/s范圍內(nèi)變化時，傳感器在含有0.01mol/L C6H5NO3的HAc-NaAc緩沖溶液（0.2 mol/mL，pH4.5）中的循環(huán)伏安行為，如圖8所示。由圖可看出，陰極峰電流隨著掃描速度的增加而升高，且還原峰電流與掃描速度的平方根成正比，而陽極峰電流幾乎不變。說明此過程中C6H5NO3被還原為對氨基苯酚，此電化學(xué)過程不可逆。

圖8 不同掃描速度下免疫傳感器的循環(huán)伏安圖（內(nèi)置圖為還原峰電流對掃描速率平方根的曲線）Fig.8 Cyclic voltammetry of immunosensors at different scan rates(Inset shows the reduced peak current versus the square root of the scan rate)

2.4 不同修飾電極界面的交流阻抗行為

為了驗(yàn)證電極是否修飾成功，實(shí)驗(yàn)通過交流阻抗法對不同修飾電極界面進(jìn)行了表征，結(jié)果如圖9所示。曲線a為裸玻碳電極的阻抗圖，阻抗較?。籦為修飾了Au NPs/COF-TpPa-1材料的電極的交流阻抗圖，阻抗有所增加（Ret=300Ω）；c為修飾了anti-CRP/CHIT+Au NPs/COF-TpPa-1材料的電極的交流阻抗圖，與曲線b相比，阻抗進(jìn)一步增加（Ret=625Ω）因CRP抗體不導(dǎo)電；d為CRP/anti-CRP/CHIT+Au NPs/COF-TpPa-1/GCE傳感器的交流阻抗圖，與c曲線相比，半圓直徑顯著增大（Ret=1200Ω），這是由于抗體和抗原的特異性結(jié)合形成的絕緣免疫復(fù)合物阻礙了電子的傳遞，以上結(jié)果說明電極修飾成功。

圖9 不同修飾電極的交流阻抗行為Fig.9 Electrochemical impedance spectroscopy(EIS)by using different modified electrodes

2.5 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.5.1 C-反應(yīng)蛋白抗體（anti-CRP）濃度對免疫傳感器的影響

為了提高傳感器的靈敏度和檢測范圍，實(shí)驗(yàn)在濃度5-50μg/mL范圍內(nèi)進(jìn)行了固定抗體濃度的優(yōu)化，如圖10，響應(yīng)電流隨固定抗體濃度的變化發(fā)生改變，當(dāng)抗體濃度為30μg/mL時響應(yīng)電流最小，繼續(xù)增大濃度電流趨于平穩(wěn)。這是由于當(dāng)anti-CRP為30μg/mL時，其與CRP結(jié)合的量最多，從而阻礙了Au NPs/COF-TpPa-1對C6H5NO3的催化。由于所研制的傳感器是信號減小型的，因此選擇30μg/mL為該實(shí)驗(yàn)最優(yōu)固定抗體濃度。

圖10 不同固定抗體濃度對免疫傳感器響應(yīng)電流的影響Fig.10 Effects of the concentration of anti-CRP on the response current of CRP immunosensor

2.5.2 抗原培育時間對免疫傳感器響應(yīng)電流的影響

在最佳固定抗體濃度下，實(shí)驗(yàn)考察了抗原培育時間與傳感器響應(yīng)電流的關(guān)系。如圖11，從圖中可以看出培育時間到達(dá)60 min以后響應(yīng)電流近似不變，因此選擇60 min作為最佳抗原培育時間。

圖11 抗原培育時間對傳感器響應(yīng)電流的影響Fig.11 Effects of incubation time of CRP on the response current of CRP immunosensor

2.5.3 溶液pH對免疫傳感器的影響

pH值也會對傳感器峰電流有一定的影響，實(shí) 驗(yàn) 考 察 了pH值 為3.5、4、4.5、5、5.5、6.0的HAc-NaAc緩沖溶液對傳感器峰電流響應(yīng)△I的影響（△I=I0-Ix，I0表示空白電流值，Ix表示含有目標(biāo)物的電流值），如圖12。由圖可知，當(dāng)抗原抗體濃度、培育時間均確定時，在pH為4.5的HAc-NaAc緩沖溶液中，傳感器峰電流信號最大，所以該實(shí)驗(yàn)選擇的最佳pH值為4.5。

圖12 pH對免疫傳感器的影響Fig.12 Effects of pH on the response current of CRP immunosensor

2.6 傳感器的校正曲線

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，得到了傳感器的校正曲線圖（如圖13）。隨著CRP濃度的增大，傳感器響應(yīng)電流值△I增大（△I=I0-Ix，I0表示空白電流值，Ix表示含有目標(biāo)物的電流值），且在0.01~150 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，線性方程為△I=0.269c+3.39，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9971，CRP的檢測下限為3 pg/mL，所以該文研制的CRP免疫傳感器靈敏度較高。

圖13 免疫傳感器的校正曲線(內(nèi)置圖為不同濃度的CRP差分脈沖伏安曲線圖）Fig.13 Calibration curve for the CRP immunosensor（Inset shows the differential pulse voltammetry response ofimmunosensor to different concentration of CRP)

表1比較了幾種檢測CRP方法的性能。從表1可知，該文所研制的傳感器具有較高的靈敏度，良好的線性范圍和較低的檢測下限。

表1 幾種檢測CRP的方法對比Tab.1 Comparison of several methods for detecting CRP

2.7 傳感器的選擇性

實(shí)驗(yàn)在相同的測試環(huán)境下考察了傳感器的選擇性。分別將1%牛血清蛋白（BSA）、200 ng/mL丙氨酸（Ala）、200 ng/mL前列腺抗原（PSA）、200 ng/mL癌胚抗原(CEA)與50 ng/mL的CRP抗原按體積比1∶1混合，進(jìn)行干擾試驗(yàn)。結(jié)果見表2，結(jié)果顯示在相同條件下，BSA（1%）、丙氨酸（Ala）、前列腺抗原（PSA）和癌胚抗原（CEA）的濃度遠(yuǎn)大于CRP的濃度，但干擾物對響應(yīng)電流的影響較小。說明BSA（1%）、丙氨酸、人前列腺抗原（PSA）和癌胚抗原（CEA）對CRP的檢測基本不造成干擾，說明傳感器選擇性較好。

表2 電化學(xué)免疫傳感器的選擇性Tab.2 Selective of the CRP electrochemical immunosensors

2.8 回收率的測定

先對稀釋血清進(jìn)行測定，計算出血清中含有的CRP濃度，然后采用加標(biāo)回收法，進(jìn)行CRP回收率的測定，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，三次檢測平均回收率為102.1%（如表3所示），結(jié)果令人滿意，說明該傳感器對檢測CRP有一定的可行性。

2.9 免疫傳感器的穩(wěn)定性

將所制免疫傳感器檢測一次后置于冰箱中4℃保存，分別過7天、15天、30天后再次培育相同濃度的CRP抗原進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖14所示。圖中I/I0為放置一定天數(shù)后測得的電流I與初始電流I0的比值。 由圖可見，該傳感器的穩(wěn)定性良好。

圖14 CRP電化學(xué)免疫傳感器的穩(wěn)定性Fig.14 Stability of CRP electrochemical immunosensor

3 結(jié)論

該實(shí)驗(yàn)采用Au NPs/COF-TpPa-1材料作為免疫傳感器的固定基底，制備了無標(biāo)記型CRP免疫傳感器。修飾在電極上的Au NPs/COF-TpPa-1可直接催化對硝基苯酚，當(dāng)CRP抗體與CRP抗原免疫結(jié)合后，阻礙電子傳遞，電流信號減小，通過使用DPV法檢測電流響應(yīng)信號與抗原濃度之間的線性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對CRP抗原的檢測。結(jié)果表明該傳感器具有一定可行性。