三鏈核酸分子探針的穩(wěn)定性及其生物傳感應用

王煥翔，潘松蘭，楊 華，薛 倩，鄧祥熙，孫蕓琳，趙聰慧，鄒 振

（長沙理工大學化學與食品工程學院，細胞化學湖南省重點實驗室，湖南長沙410114）

0 引言

核酸分子探針是一類建立在生物分子相互作用(如DNA/RNA雜交、DNA/蛋白質作用等)基礎上，可特異性識別互補序列的核酸、蛋白質或小分子物質的功能寡聚核苷酸[1]。它具有設計簡便、易合成、易修飾、特異性高、自身結構可預測等優(yōu)點，已被廣泛用于生物傳感領域[2-4]。1957年，F(xiàn)eisenfeld和Davies等[5]發(fā)現(xiàn)某些基因中特定的同聚嘌呤或者同聚嘧啶序列，在一定的條件下由第三條單鏈寡核苷酸 （triplex-forming oligonucleotides,TFOs）插入到雙鏈的大溝之中，通過Watson-Crick與Hoogsteen氫鍵作用形成三螺旋核酸結構。三螺旋核酸結構堿基的構成具有專一性，其基本構型由C·G-C、G·G-C、和T·A-T形成的平行三重鏈結構以及C·G-C、G·G-C、T·A-T、和A·A-T形成的反向平行三鏈結構組成[6]。這為三鏈核酸分子探針的研究以及實際的應用奠定了理論基礎。以三螺旋結構為基礎的三鏈核酸分子探針也隨之被開發(fā)應用于生化傳感等領域。該文主要從影響三鏈核酸穩(wěn)定性的因素以及三鏈核酸在生化傳感中的功能應用進行闡述。

1 影響三鏈核酸穩(wěn)定性的因素

1.1 長度的影響

寡聚脫氧核苷酸(ODN)的長度在三鏈結構形成的過程中是一個重要影響因素。ODN長度太短Hoogesteen氫鍵作用力太弱，不足以形成三鏈結構，ODN長度太長容易形成核酸二級結構，不利于三鏈結構的形成。Brown課題組報道，三鏈核酸第三條核酸鏈的長度影響三鏈結構的形成。當雙鏈長度為30個堿基，第三條鏈長度為22個堿基時，能形成穩(wěn)定的三鏈核酸結構。ODN低于或高于該22個堿基時，三鏈核酸結構難形成[7]。

1.2 堿基序列的影響

三鏈核酸結構各組成單元堿基序列高度匹配，堿基的錯配、缺失會明顯的降低三鏈結構的形成。三鏈核酸結構的某一結合位點堿基發(fā)生改變，會在一定程度上導致第三條鏈的扭曲，無法形成三鏈結構。在相同的條件下，由G、A構成的ODN具有更高的親和力，能快速形成三鏈結構。而由T、C構成的ODN形成較為穩(wěn)定的三鏈核酸結構所需的條件更為苛刻[8]。由此可見，序列的選擇對于三鏈的形成是不容忽視的。

1.3 堿基修飾的影響

近些年來對三鏈核酸的組成鏈進行了大量的化學修飾，以滿足對分析檢測對象的需求。其中甲基化是堿基修飾的手段之一，一般在胞嘧啶的5位點進行甲基化。通過堿基修飾擴大三鏈核酸存在的酸度范圍，而且在一定程度上提高三鏈自身的（Tm）解鏈溫度和親和常數(shù)[9]。提高三鏈自身穩(wěn)定性是甲基化所引起的疏水作用，形成過程中的熵變能證實這一觀點。不是所有的取代基團都能增強三鏈的穩(wěn)定性。比如溴或者丙基在C堿基的5位點進行修飾反而會降低三鏈的穩(wěn)定性，相同情況下在RNA中U的5位點進行修飾，卻會進一步的促進三鏈的形成[10]。造成這種差異的可能是取代反應過程中成鍵的電荷密度發(fā)生改變。溴電負性強，不僅會增強嘧啶鏈3位點電荷密度使氫鍵供體能力得到大大的提升，也會進一步降低1位點電荷密度使受體能力減弱。當這兩種效應不對等便會削弱三鏈核酸的穩(wěn)定性。對磷酸基團進行甲基化修飾形成的三鏈結構穩(wěn)定性與ODN長度密切相關[11]。

1.4 溫度和pH的影響

在酸性條件下，胞嘧啶（C）質子化，增加了C-G·C堿基對的穩(wěn)定性，促使三鏈的形成；而在中性條件下胸腺嘧啶（T）去質子化，增加了T-A·T堿基對的穩(wěn)定，使三鏈結構能穩(wěn)定存在。酸性環(huán)境中，三鏈的穩(wěn)定性取決于第三條鏈中C堿基的比例[12]。一般根據(jù)其C-G·C/T-A·T比例的不同，可以設計不同類型的可切換三鏈核酸分子開關。從解鏈溫度（Tm）對酸度的依賴性和形成的焓變來看，質子在三鏈解離的過程中被釋放，但其數(shù)量要少于第三條鏈中胞嘧啶的數(shù)目。這表明單鏈中胞嘧啶被部分質子化[13]。

1.5 離子濃度的影響

由于分析檢測的多樣性，不同的離子在溶液中既能降低雙鏈和寡聚核苷酸鏈之間的排斥力，又能使核酸鏈之間的親和性發(fā)生顯著的改變。Mg2+嵌到核酸鏈中間降低局部過高的負電荷，促進了三鏈核酸的形成[14]。Volker等[15]通過升高鈉離子濃度明顯提高了三鏈核酸結構的穩(wěn)定，當ODN中富含T堿基時，形成的三鏈結構比相應的富含C所形成的三鏈對于鈉離子的濃度表現(xiàn)出更高的依賴性。這可能是由于電荷的不同所導致的，前者具有較高的負電荷，而后者由于C的質子化作用使負電荷密度下降所造成的。除了鈉離子和鎂離子等陽離子外，多胺質子化在一定程度上影響三鏈的形成。溶液中存在精胺時，有效降低局部負電荷促進了三鏈的形成。同時Ag+通過C-G·C堿基對的絡合促進三鏈的形成[16]。

2 三鏈核酸分子探針在生化傳感中的應用

由于核酸序列的可設計性，三鏈結構在核酸探針信號轉導方面具有巨大的優(yōu)勢。三鏈核酸探針能夠進行熒光、拉曼、電化學生化傳感平臺的設計，用于復雜體系中生物標志物的檢測，具有普適性、靈敏度高，特異性高的特點。

2.1 三鏈分子探針熒光生化傳感應用

熒光傳感具有響應快，檢測限低等優(yōu)點，是核酸探針常用的信號報告方式。傳統(tǒng)核酸探針MB(分子信標)在5’和3’修飾熒光團和猝滅團。遇到靶序列后，兩者分離恢復熒光信號，實現(xiàn)對靶序列的檢測?；诖嗽?，Lu等設計了三鏈核酸分子開關（TMS）結構[17]，它是由5’、3’分別標記了FAM、BHQ 1的ptMB鏈和外加的sfO鏈組裝形成。環(huán)部設計為miRNA的互補序列，莖部設計為可形成三鏈結構的T·A-T、C·G-C堿基對，通過Watson-Crick氫鍵和Hoogsteen氫鍵組成。當遇到靶標miRNA，TMS打開熒光信號恢復。與傳統(tǒng)分子信標相比，TMS檢測限更低，顯著提高信號背景比（圖1）。

圖1 三鏈分子開關用miRNA檢測[17]Fig.1 Classical triplex molecular beacons for microRNA-21 detection[17]

Yang等首次提出三鏈分子探針具有分子識別單元和信號報告單元分離的優(yōu)勢。他們設計了一系列通用型三鏈核酸分子開關（TMS）平臺，用于目標分子的高靈敏檢測和細胞成像。如圖2所示，Yang等設計了一種基于環(huán)莖部型三鏈生物傳感器平臺。Aptamer/待測物的特異性識別作用與環(huán)狀部分露出的腳趾進行堿基配對，使三鏈結構被拆卸，該探針開關被打開，識別單元與信號單元實現(xiàn)分離，裸露出來的第三條鏈兩端的配對堿基重新組合，形成發(fā)夾結構使得兩端被標記的芘分子彼此之間靠近，芘分子熒光強度升高，從而實現(xiàn)了三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）、α-凝血酶（α-thrombin,Tmb）與L-精氨酰胺（Largininamide,L-Arm）的檢測[17]。借助該三鏈核酸分子開關的思路，后續(xù)科研工作者也進行了一系列的參考與改進，用于miRNA的成像等[18]。

圖2 基于適配體三螺旋分子開關的傳感平臺設計[18]Fig.2 Design of sensing platform based on aptamer triple helix molecular switch[18]

基于上述三鏈分子探針分子識別與信號報告單元分離的優(yōu)勢，Zheng等將該策略用于細胞內生物標志物分析，他們設計了一種金納米粒子(AuNPs)集成可編程三螺旋分子開關(THMS)，實現(xiàn)從同質溶液到活細胞的多個目標的生物傳感[19]。三鏈分子探針在沒有遇到mRNA時,標記的熒光被金顆粒猝滅。遇到靶mRNA時，標記熒光團的核酸鏈掉落顯示熒光。結果表明，這種提出的可編程THMS可成功用于對活細胞中的多信使RNA (mRNA)進行成像，并顯著擴展了THMS傳感平臺的范圍（圖3）。

圖3 可編程DNA三螺旋分子開關在生物傳感中的應用[19]Fig.3 Application of programmable DNA triple helix molecular switch in biosensing[19]

三鏈分子探針包含三鏈核酸結構，三鏈核酸結構的穩(wěn)定性受pH值調控。基于此，Zheng等[20]設計了一種基于三鏈核酸結構的DNA四面體納米探針。與傳統(tǒng)的四面體的DNA納米探針略有不同，三鏈核酸結構被用作重要的構象轉換元件。由于腫瘤細胞中較低的胞外pH值，將靶向mRNA的H1和H2通過Hoogsteen氫鍵穩(wěn)定地組裝在DNA四面體的延伸短發(fā)夾形探針上，形成DNA三鏈結構。當細胞內pH值和靶mRNA的同時滿足時，H1和H2之間觸發(fā)了雜交鏈反應（HCR），它們從DNA三鏈體的解離中釋放出來，通過激活生成的長雙鏈DNA上的熒光共振能量轉移（FRET）的信號，實現(xiàn)信號的放大，同時指示了目標mRNA的表達，從而達到監(jiān)測活細胞中的pH和mRNA（圖4）。

圖4 基于三鏈功能化四面體納米探針用于細胞內pH和腫瘤相關mRNA的成像[20]Fig.4 Based on triple-stranded functionalized tetrahedral nanoprobe for imaging of intracellular pH and tumorrelated mRNA[20]

基于三鏈核酸結構受pH調控的原理，Cui等將pH調控策略用于DNAzyme，他們設計了一種酸可切換DNAzyme納米裝置來控制活細胞中的DNAzyme活性，并在原位實現(xiàn)Zn2+、Pb2+同時可視化[21]。這種納米裝置建立在DNAzyme前體(DPs)和酸轉換三鏈DNA(SW-DNA)結構上，在4.5~7.0的pH范圍內精確響應。進入細胞之前，DPs的雜交狀態(tài)成功地使DNAzymes失活。納米裝置進入活細胞中，SW-DNA將在溶酶體強酸環(huán)境中，從單鏈變?yōu)槿溄Y構，然后與SW-DNA雜交的鏈被釋放，隨后與DPs反應形成活性DNAzyme，可進一步實現(xiàn)細胞內Zn2+、Pb2+同時成像。此外，該策略作為構建各種酸可切換納米器件的強大平臺具有廣闊的前景（圖5）。

圖5 用于對活細胞中的多種金屬離子進行成像的酸可切換DNAzyme納米裝置[21]Fig.5 Acid-switchable DNAzyme nanodevice for imaging multiple metal ions in living cells[21]

除了受pH影響，三鏈核酸結構具備催化功能，Cu2+依賴的DNAzyme需要形成三鏈核酸結構才具備切割功能。基于此，Kuang課題組[22]構建了一種依賴于手性的圓偏振光（CPL）活化納米組件，該組件由DNAzyme響應的核酸分子探針和金納米棒改性的尖晶狀鉑上轉換修飾形成復合型納米顆粒（UCNPs）修飾而成，該納米結構不僅具有良好的穩(wěn)定性，并且能同時定量分析活細胞中的多種二價金屬離子。細胞內Zn2+，Mg2+通過DNAzyme形成的雙鏈結構進行響應，而Cu2+通過第三條單鏈的配對形成三鏈結構進行響應，從而實現(xiàn)了對細胞內低豐度的三種金屬離子的高靈敏檢測分析。該檢測策略的聯(lián)合使用不僅拓展了納米技術的藥物遞送以及成像研究，而且進一步拓展了三鏈核酸分子探針與其他技術聯(lián)用的思路（圖6）。

圖6 用于細胞內三重離子檢測的AuNR@Pt二聚體-UCNP納米平臺[22]Fig.6 AuNR@Pt dimer for intracellular triple ion detection-UCNP nano platform[22]

基于三鏈核酸的催化功能，Yang等開發(fā)設計了一種基于DNA四面體的三維3D捕獲器，用于活細胞中長非編碼RNA MEG3成像[23]，通過三鏈結構的引入大大加速反應進程。其中3D捕獲器由形成三螺旋的dsDNA，能夠結合長非編碼RNA MEG3的5'端富含GA的結構域和四個針對MEG3上連續(xù)結構域的發(fā)夾形反義序列組成。一旦被細胞攝取，3D捕獲器形成DNA-RNADNA三螺旋結構并觸發(fā)捕獲器的基于雜交的字符串分解來快速捕獲長非編碼RNA MEG3。由于三螺旋誘導的“多米諾效應”，分解反應時間比無法形成三螺旋的反應要短得多。3D捕捉器可檢測長達129個核苷酸的長鏈靶標，檢測限為0.36 nmol/L，為監(jiān)測內源性RNA提供了可靠的策略（圖7）。

圖7 三鏈核酸驅動的3d納米捕獲器用于細胞內長鏈非編碼RNA MEG3的成像[23]Fig.7 Visualization of long noncoding RNA MEG3 in living cells by a triple-helix-powered 3d catcher[23]

2.2 三鏈分子探針拉曼生化傳感應用

C.V.Raman和他的學生發(fā)現(xiàn)，單色光照射到物質上發(fā)生散射，散射光頻率會發(fā)生改變的現(xiàn)象[24]，其中非彈性散射叫拉曼散射。Jeanmaire等發(fā)現(xiàn)分子數(shù)量相同時，電極表面的拉曼信號比溶液中的拉曼信號增強了6個數(shù)量級，他們指出了增強效應與粗糙的表面有關，稱為表明增強拉曼效應[25]。經典的表明增強拉曼平臺包括貴金屬基底、拉曼報告基團、保護層、目標分子捕獲。拉曼信號作為信號輸出方式最大的特點就是高靈敏度、對樣品無影響。

結合三鏈分子探針識別單元與信號報告單元分離的優(yōu)勢，利用DNA開關設計用于制造可逆和可再生的拉曼活性底物，出現(xiàn)了以拉曼信號為報告信號的三鏈分子探針生化傳感。如圖8所示，基底由Au膜和發(fā)夾狀DNA鏈（熱點生成探針，HSGP）組成，并用染料官能化的銀納米顆粒（AgNPs）標記。識別特定觸發(fā)的另一個ss-DNA用作天線。HSGP固定在Au膜上，將染料官能化的AgNP吸引到Au表面附近，并產生強的拉曼信號（SERS）。利用目標物與天線環(huán)狀區(qū)域的特異性親和，誘導DNA三鏈結構變化。當HSGP與天線的兩個臂段的雜交形成三鏈核酸結構，染料官能化的AgNP從Au表面分離出來，實現(xiàn)SERS信號分子在Au膜表面的距離發(fā)生改變，產生SERS信號傳感響應。與其觸發(fā)器的相互作用將天線從三鏈結構中釋放出來，實現(xiàn)識別單元與信號單元的分離，并恢復HSGP的發(fā)夾結構，創(chuàng)建了有效的“關-開”拉曼信號可切換開關[26]。該設計表現(xiàn)出出色的可逆性，以及優(yōu)良的重現(xiàn)性和表面增強拉曼散射（SERS）效果的可控性，進一步拓展了三鏈核酸探針在SERS傳感方面的實際應用。

圖8 DNA納米機器導向可逆SERS活性基板的工作原理[26]Fig.8 Working principle of the DNA nanomachinedirected reversible SERS-active substrate[26]

Zheng等利用表面增強拉曼散射現(xiàn)象設計了一種基于適體通用放大信號檢測多個目標分析物的方法。該方法使用ss-DNA作為通用觸發(fā)（UT）來誘導SERS活性熱點的形成[27]。SERS活性熱點是通過4個氨基苯硫醇（4-ABT）編碼的金納米粒子與DNA聚合物通過特定的Au-S鍵結合而形成的。適體探針與其靶標之間的相互作用激活自組裝從而形成DNA聚合物，三個短DNA探針通過雜交鏈反應（HCR）的方式干擾三螺旋適體/UT結構。從而實現(xiàn)了對輸出信號的放大，同時構建了對包括凝血酶，腺苷和CEM癌細胞的檢測成像相應的三鏈核酸分子探針，該模型的構建及響應的模式進一步激發(fā)了SERS的新設計和在生物傳感等領域中的應用（圖9）。

圖9 用于檢測多個目標分析物的具有放大信號的通用SERS檢測器[27]Fig.9 Universal SERS detector with amplified signal for detecting multiple target analytes[27]

2.3 三鏈分子探針電化學生化傳感應用

電化學生物傳感器是快速地感應目標物質并將這些物質的濃度與電流/電壓關聯(lián)起來的傳感器。具有成本低，靈敏度高，操作簡單等優(yōu)點。在過去幾十年里，構建了許多種分析平臺實現(xiàn)目標物的檢測。傳統(tǒng)的電化學傳感器使用單一電流信號輸出，易受到背景干擾。為避免干擾，發(fā)展了比率型電化學傳感器。Xiong等開發(fā)了電化學EDNA生化傳感器用于目標DNA(T-DNA)檢測[28]。用亞甲基藍(MB-DNA)標記的發(fā)夾DNA捕獲探針通過Au-S鍵錨定在金電極上。接著用兩端標記了二茂鐵(Fc-DNA)的單鏈DNA形成三螺旋構象。當T-DNA存在時，F(xiàn)c-DNA與T-DNA雜交，三螺旋結構解開并使MB-DNA恢復到其發(fā)夾結構。Fc標記物從GE電極表面擴散開，而MB標記物仍然貼在它附近，導致Fc峰值電流降低和MB峰值電流增加。IMB/IFc值與T-DNA在0.5至80 pmol/L呈線性關系，檢測限低至0.12 pmol/L。該生化傳感器在電化學檢測多種分析物方面具有巨大潛力，可作為早期臨床診斷和生物醫(yī)學研究的生物傳感平臺（圖10）。

圖10 用于核酸超靈敏檢測的三螺旋分子開關電化學比例生物傳感器[28]Fig.10 Triple-helix molecular switch Electrochemical Ratiometric Biosensor for Ultrasensitive[28]

相比于傳統(tǒng)的電化學傳感策略，Yang等結合三鏈分子探針分子識別單元和信號報告單元分離的優(yōu)勢，利用納米孔技術設計了三鏈分子探針（TMS）用于阿爾茲海默癥生物標志物分析[29]。實驗中設計并合成了中間鏈長度不同的三個鉗形TMS，三個TMS環(huán)部序列分別為靶標檢測物Tau 381、AAT、BACE 1的核酸適配體序列，莖部設計為三鏈核酸序列。在沒有遇到靶標檢測物時，TMS體積較大，不能穿過納米孔。遇到靶標檢測物TMS解開，釋放中間的單鏈DNA。單鏈DNA體積小可以穿過納米孔，當不同穿過納米孔的單鏈DNA序列長度不一致時，產生不同的阻斷電流用來分析靶標物。利用三鏈核酸分子開關分子識別單元與信號報告單元分離的優(yōu)勢，實現(xiàn)了Tau 381、AAT、BACE1三種物質的同步正交分析（圖11）。

圖11 基于長度編碼的三鏈分子開關納米孔的阿爾茲海默癥生物標志物同步分析[29]Fig.11 Synchronous analysis of alzheimer's disease biomarkers based on length-encoded triple-stranded molecular switch nanopores[29]

3 結論與展望

與傳統(tǒng)的核酸探針相比，三鏈核酸探針具有特殊的穩(wěn)定性。三鏈核酸探針自身穩(wěn)定性受第三條鏈長度、堿基序列、堿基修飾、溫度和pH值、離子濃度的影響。三鏈核酸探針具有探針識別單元與信號報告單元分離、受pH調控、催化功能等優(yōu)勢。結構可調控，有效避免了實際體系中出現(xiàn)的假信號。在實際體系疾病相關標志物檢測中，三鏈核酸探針提供新的生物傳感方法。近年來診療一體化的理念被提出來，國內外研究人員構建了用于生物標志物成像、治療的核酸分子探針。但在生物體系應用過程中，核酸分子探針被核酸酶切割出現(xiàn)假信號，出現(xiàn)了一系列核酸分子探針穩(wěn)定性增強策略。三鏈分子探針具有超螺旋結構，相比于普通分子探針可能具有更好的生物穩(wěn)定性。隨著研究的深入，三鏈核酸探針將成為生物傳感領域不可缺少的一部分。