多菌靈殘留測(cè)定方法的研究進(jìn)展

王婷婷，陽明輝*，盧麗敏

（1.中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南長沙410083）

（2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，江西南昌330045）

0 引言

多菌靈（CBZ）是一種苯并咪唑類殺菌劑，其有效成分為O-甲基-N-2-苯并咪唑氨基甲酸甲酯，結(jié)構(gòu)如圖1所示。該藥劑系1960年由HampelH.發(fā)現(xiàn)其殺菌 活性，中國于1973年進(jìn)行研制并投放市場(chǎng)。純品為白色結(jié)晶粉末，216～217℃開始升華，熔點(diǎn)307～312℃，工業(yè)原料為淺棕色粉末。其作用機(jī)理是通過干擾細(xì)胞紡錘體的形成，從而干擾細(xì)胞分裂，對(duì)植物具有良好的保護(hù)和治療作用[1]。 CBZ可用來專門防治各種如子囊菌、半知菌類真菌病原體，因其具有高效、低毒、廣譜、成本低的特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于水果、堅(jiān)果、蔬菜和草皮的種植過程中。雖然CBZ毒性不高，但是其苯并咪唑環(huán)不易被破壞，并且隨著其使用時(shí)間和量的增多，也會(huì)在自然環(huán)境中積累，并對(duì)動(dòng)植物和人類產(chǎn)生毒害作用。經(jīng)研究表明CBZ已造成了地表水的污染，進(jìn)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)后容易因代謝不良而殘留在它們的性腺、肝臟、腎上腺和內(nèi)分泌腺中，影響這些器官的正常功能，尤其對(duì)生殖系統(tǒng)的影響最大[2-7]。因此，隨著人們和社會(huì)對(duì)環(huán)境污染和生態(tài)健康的持續(xù)關(guān)注，研究高效、快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)環(huán)境中CBZ的方法具有較大的意義。

圖1 多菌靈的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure diagram of imidacloprid

目前,傳統(tǒng)用于檢測(cè)CBZ含量的方法主要有色譜法[8]、分光光度法[9]、毛細(xì)管電泳法[10]、免疫分析法[11]等，這些檢測(cè)方法雖然在一定程度上對(duì)多菌靈檢測(cè)具有較好的分析效果，但分別具有操作繁瑣，成本和樣品純度要求高、專業(yè)操作技術(shù)嚴(yán)格、穩(wěn)定性低、耗時(shí)長等缺點(diǎn)。分光光度法雖然曾經(jīng)多用于果蔬中多菌靈殘留的測(cè)定，但有研究表明在采用分光光度法測(cè)定果蔬中農(nóng)藥殘留時(shí)前處理方法操作步驟較多，會(huì)直接或間接影響該方法的靈敏度[12]。免疫分析技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是取樣量小、前處理簡(jiǎn)單、儀器配置需求低，但是該方法經(jīng)常會(huì)遇見假陽性結(jié)果，在應(yīng)用于食品農(nóng)藥殘留檢測(cè)上尚存在一定的局限性[13]。因此，能夠開發(fā)高效、快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)多菌靈殘留的方法必不可缺。

電化學(xué)分析方法具有分析靈敏度高、成本低、分析速度快、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[14]，研究者們發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)對(duì)比，電化學(xué)分析方法對(duì)于實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥殘留的高效靈敏的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)具有極大潛力。該文綜述了多菌靈殘留測(cè)定的研究進(jìn)展，并對(duì)電化學(xué)方法的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

1 多菌靈殘留檢測(cè)的常用方法

該文主要從高效液相色譜法、液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用、熒光光譜分析法、免疫分析法和電化學(xué)分析法幾個(gè)方面來介紹多菌靈殘留測(cè)定的研究進(jìn)展。

1.1 色譜法

隨著研究技術(shù)的發(fā)展，色譜法在多個(gè)學(xué)科都發(fā)揮著非常重要的作用。在如多菌靈氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面，使用最廣泛的主要是高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。

1.1.1 高效液相色譜法(HPLC)

在食品農(nóng)藥殘留分析中，高效液相色譜分析法已成為一種廣泛應(yīng)用的儀器分析方法，國家標(biāo)準(zhǔn)中便是采用反相高效液相色譜法實(shí)現(xiàn)對(duì)多菌靈檢測(cè)分析[15]。

廖濤等建立了蘋果汁中多菌靈殘留量的高效液相色譜（HPLC）分析方法[16]，該方法對(duì)蘋果汁中多菌靈的檢出限為0.02 mg/kg，可以滿足蘋果汁中多菌靈的殘留限量檢測(cè)要求。劉云云建立了一種液液萃取-反相高效液相色譜同時(shí)測(cè)定農(nóng)作物中吡蟲啉和多菌靈殘留量的實(shí)驗(yàn)方法[17]。實(shí)驗(yàn)中以丙酮為提取溶劑，最佳色譜條件為：流動(dòng)相：甲醇：0.02 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.4）=25:75，紫外檢測(cè)波長為278 nm。最佳固相萃取條件為：采用CN固相萃取柱，以20%甲醇水為上樣溶劑，8 mL A液作為淋洗液，2 mL 60%甲醇水溶液為洗脫液。然后在所確立的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，選取煙草和香煙樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得煙草樣品中多菌靈的含量為0.584 mg/kg，香煙樣品中多菌靈的含量分別為1.19 mg/kg。

所測(cè)得的高效液相色譜圖如圖2-1、2-2所示。

圖2 -2 香煙樣品色譜圖Fig.2-2 The chromatogram of cigarette sample

圖2 -1 煙草樣品色譜圖Fig.2-1 The chromatogram of tobacco sample

1.1.2 液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是將液相色譜儀與質(zhì)譜儀串聯(lián)起來的分離檢測(cè)技術(shù)，不僅發(fā)揮了液相色譜的高分離性能，而且發(fā)揮了質(zhì)譜檢測(cè)髙靈敏度、結(jié)構(gòu)分析與鑒別的優(yōu)勢(shì)，用于分析檢測(cè)對(duì)熱不穩(wěn)定、分子量較大、低揮發(fā)性的化合物，具有檢測(cè)靈敏度高、選擇性好、定性定量同時(shí)進(jìn)行、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)[18]。程樸等介紹了一種適用于番茄、黃瓜樣品中多菌靈殘留量測(cè)定的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析方法[8]。測(cè)定結(jié)果及線性相關(guān)圖如下圖3-1、3-2、3-3所示。結(jié)果表明，樣品添加回收率在92.6%～118.5%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.20%～10.32%,方法的檢測(cè)限為0.05 mg/kg。然而LCMS/MS前處理方法仍需要液液萃取、固相萃取等復(fù)雜的前處理過程以降低基質(zhì)效應(yīng)。鄭香平[19]建立了同時(shí)測(cè)定濃縮果汁中噻菌靈和多菌靈殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測(cè)法。結(jié)果表明：在試驗(yàn)條件下,噻菌靈和多菌靈在0.510 μg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.99，不同基質(zhì)中的檢出限（S/N=3）范圍為0.12～0.23 μg/kg。在0.5、1.0和5.0μg/kg 3個(gè)水平下、多菌靈的加標(biāo)回收率為76.98%～108.7%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.95%～9.99%，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)物快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、高效、耐用、安全分析。

圖3 -1 多菌靈總離子流圖Fig.3-1 Total ion current diagram of carbendazim

圖3 -2 多菌靈質(zhì)譜圖Fig.3-2 The mass spectrum of carbendazim

圖3 -3 多菌靈濃度-響應(yīng)值線性關(guān)系曲線圖Fig.3-3 Curve of linear response value of carbendazim concentration

1.2 分光光度法

分光光度法是利用物質(zhì)的光學(xué)性質(zhì)，根據(jù)物質(zhì)對(duì)特定波長光的選擇性吸收，進(jìn)行定性定量分析的檢測(cè)方法，適用于鑒定具有芳香環(huán)或共軛雙鍵結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物，根據(jù)在特定吸收波長處所得的吸收度，來進(jìn)行定量分析。分光光度法具有儀器操作簡(jiǎn)單，分析費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，但樣品前處理繁瑣，凈化步驟繁瑣且回收率不穩(wěn)定[20]，使其在多菌靈農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面的應(yīng)用受到一定的限制。范寧云等[21]采用分光光度法檢測(cè)測(cè)定三種蔬菜（菜花、胡蘿卜和西芹）中的多菌靈含量，其樣品的加標(biāo)平均回收率可達(dá)到92.8%～96.6%，檢出限達(dá)0.026 mg/kg，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9998，在線性范圍0～50 mg內(nèi)測(cè)定結(jié)果滿意。楊立武[12]簡(jiǎn)化了國標(biāo)方法[22]中的樣品前處理過程，得到的樣品加標(biāo)回收率為86.5%～91.4%，變異系數(shù)為1.7%～3.2%。華孝成等[23]利用自制裝置濃縮提取液，經(jīng)多次液液分配萃取，用紫外可見光分光三波長法測(cè)取吸收波長，方法的檢出限為0.074 mg/kg，對(duì)不同蔬菜及水果樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，1.00 mg/kg添加水平下的不同水果蔬菜的平均回收率為85%～103%,測(cè)定結(jié)果如圖4-1、4-2所示。該方法縮短了檢測(cè)周期，提高了數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，改進(jìn)了國標(biāo)中分光光度法對(duì)水果蔬菜中多菌靈殘留量檢測(cè)的方法，為分光光度法對(duì)水果蔬菜中多菌靈殘留量檢測(cè)提供了參考。

圖4 -1 多菌靈標(biāo)準(zhǔn)紫外吸收光譜圖Fig.4-1 Standard ultraviolet absorption spectrum of carbendazim

圖4 -2 多菌靈標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.4-2 Standard working curve of carbendazim

1.3 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis，CE)，又稱為高效毛細(xì)管電泳（HPCE）,是20世紀(jì)80年代興起并且迅速發(fā)展起來的一種新型液相分離分析方法,是現(xiàn)代分析化學(xué)中繼高效液相色譜之后的又一重大發(fā)展。毛細(xì)管電泳是以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力,以毛細(xì)管為分離通道,依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)[24]。毛細(xì)管電泳因具有強(qiáng)大的分離效率而應(yīng)用于農(nóng)藥殘留分析，并在近年來得到了迅速的發(fā)展。

Tejada-Casado等[25]開發(fā)了采用毛細(xì)管電泳法-紫外檢測(cè)（290 nm）技術(shù)測(cè)定水中多菌靈、苯菌靈等7種苯并咪唑殺菌劑殘留的方法，檢出限為2.8 mg/L，定量限為9.3 mg/L。Liu等[26]應(yīng)用高效毛細(xì)管電泳同時(shí)測(cè)定葡萄、番茄及黃瓜等果蔬3種苯并咪唑類殺菌劑即甲基硫菌靈、多菌靈和苯菌靈的殘留量。以細(xì)菌纖維素為電泳緩沖液添加劑來提高毛細(xì)管電泳的分離效率，并探究了最佳的細(xì)菌纖維素的添加量條件，如圖5所示。實(shí)驗(yàn)檢出限為5.0μg/L～10.0μg/L，加標(biāo)回收率為93.5%～103%，RSD＜8.0%。

圖5 細(xì)胞纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)3種苯并咪唑類殺菌劑分離效果的影響Fig.5 Effects of mass fraction of BC on separation of the three benzimidazole fungicides

毛細(xì)管電泳具有快速分析多種分離模式，檢測(cè)成本低，分析速度快，進(jìn)樣量少，幾乎沒有廢液等優(yōu)點(diǎn)。然而毛細(xì)管電泳尚缺乏靈敏度很高的檢測(cè)器，所用樣品濃度被限制在10-6mg/L，目前其靈敏度不如液相色譜。因此只有研究開發(fā)出靈敏度更高的檢測(cè)系統(tǒng)，毛細(xì)管區(qū)帶電泳的優(yōu)勢(shì)才能充分發(fā)揮出來[27]。

1.4 免疫分析法

免疫分析方法中能用于農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)的主要有熒光免疫測(cè)定技術(shù)、放射免疫測(cè)定技術(shù)以及酶免疫測(cè)定技術(shù)等。目前在農(nóng)殘快速檢測(cè)中應(yīng)用最多的是酶聯(lián)免疫測(cè)定技術(shù)。

酶聯(lián)免疫分析技術(shù)具有靈敏度高、簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)，適用于水、土壤、食品及農(nóng)產(chǎn)品中的殺菌劑殘留檢測(cè)。研究者根據(jù)多菌靈分子結(jié)構(gòu)和特異基團(tuán)設(shè)計(jì)并合成多菌靈的半抗原，制備人工抗原及抗體，建立并優(yōu)化多菌靈定量檢測(cè)的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的方法，為研制試劑盒提供基礎(chǔ)，適用于果蔬中農(nóng)藥殘留的快速、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[28]。Christos等[29]通過使用2-(2-氨基乙基)苯丙酸、2-苯并咪唑及2-巰基苯并咪唑作為免疫半抗原制備多克隆抗體，抗體可以識(shí)別多菌靈以及其它苯并咪唑類殺菌劑，而與結(jié)構(gòu)不同的農(nóng)藥不發(fā)生交叉反應(yīng)，可用于免疫檢測(cè)殺菌劑殘留。

酶聯(lián)免疫技術(shù)具有樣品前處理簡(jiǎn)單、純化步驟少、大樣本分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，既適合于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，又可用于現(xiàn)場(chǎng)篩選的優(yōu)點(diǎn)。但要制備多菌靈的特異性抗體存在一定的困難，而且不能完成多種農(nóng)藥同時(shí)檢測(cè)，成本高，穩(wěn)定性低，從而限制了該技術(shù)的應(yīng)用。

1.5 電化學(xué)分析法

電化學(xué)分析法是利用電化學(xué)原理，通過物質(zhì)在溶液中的電化學(xué)特性來實(shí)現(xiàn)測(cè)量的一類儀器分析方法。電化學(xué)特性包括所構(gòu)成電池的電學(xué)性質(zhì)（包括電流、電導(dǎo)、電位、電量等）及化學(xué)性質(zhì)（包括溶液的成分、濃度等）。利用這些性質(zhì)，通過傳感器（電極）獲得被測(cè)物的相關(guān)信息并將之轉(zhuǎn)化為電學(xué)參數(shù)即可實(shí)現(xiàn)測(cè)量。電化學(xué)方法由于其靈敏度較高，成本低，分析時(shí)間短，易于攜帶等優(yōu)勢(shì)而可應(yīng)用于苯并咪唑類殺菌劑如多菌靈的測(cè)定，尤其適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。目前基于電化學(xué)分析技術(shù)的食品、農(nóng)產(chǎn)品的多菌靈殘留檢測(cè)大多都是利用分子自身的氧化還原特性,使其在電極上發(fā)生氧化或者還原反應(yīng)產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào),從而實(shí)現(xiàn)多菌靈殘留的直接、快速檢測(cè)。

目前應(yīng)用最為廣泛的電化學(xué)分析方法便是以三電極系統(tǒng)為主要檢測(cè)體系，通過對(duì)玻碳電極表面進(jìn)行材料修飾，從而提高電化學(xué)傳感器檢測(cè)的選擇性和靈敏性。

Petroni等[30]首次報(bào)告了使用多壁碳納米管，在陰離子表面活性劑存在下，利用伏安法測(cè)定CBZ，檢測(cè)限為14 pmol/L。Li等[31]制備了多壁碳納米管-聚合甲基紅膜修飾電極，峰值電流與多菌靈濃度在2.0×10-7～1.0×10-5mol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R=-0.9953，檢出限為9.0×10-9mol/L?；厥章试?0.3%和94.7%之間。Dong等[32]研究了一種新型納米雜化材料修飾電極的電化學(xué)方法同時(shí)檢測(cè)多菌靈和噻菌靈，檢測(cè)多菌靈的濃度范圍為1.0μmol/L～100μmol/L，檢出限為0.09μmol/L。王天鶴等[33]制備了多壁碳納米管-聚4-（2-吡啶偶氮）間苯二酚膜修飾電極，檢測(cè)結(jié)果相關(guān)系數(shù)為0.997，檢出限為2.5×10-7mol/L（S/N=3），表明該修飾電極對(duì)多菌靈具有良好的電催化作用。

2 結(jié)語

隨著人們和社會(huì)對(duì)環(huán)境污染和生態(tài)健康的持續(xù)關(guān)注，研究者們也在不斷尋找和研發(fā)能夠高效、快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)環(huán)境和食品中CBZ的方法。該文分別從色譜法、分光光度法、毛細(xì)管電泳法、免疫分析法和電化學(xué)分析法概括了近年來測(cè)定多菌靈的常規(guī)方法。而電化學(xué)分析法與其他檢測(cè)方法相比具有分析靈敏度高、成本低、分析速度快、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，這些優(yōu)點(diǎn)都十分符合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。但是，要充分發(fā)揮其在多菌靈檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)，還需要解決較多問題。第一，電極使用之后，表面會(huì)殘留少量的被測(cè)物或其它雜質(zhì)，引發(fā)交叉污染和電極鈍化等問題，影響后續(xù)檢測(cè)。而電極通常需要反復(fù)打磨和超聲清洗才能再次用于檢測(cè)，這一過程會(huì)耗去大量時(shí)間，嚴(yán)重影響檢測(cè)速度。第二，電極通常需要經(jīng)過修飾處理，從而提高檢測(cè)選擇性，滿足特定檢測(cè)的需求。這些修飾過程會(huì)使電極的使用和再生過程更加繁瑣、費(fèi)時(shí)，同時(shí)一些如酶蛋白質(zhì)的生物活性的保持程度也會(huì)影響電化學(xué)檢測(cè)方法的穩(wěn)定性和靈敏度。第三，樣品預(yù)處理。電化學(xué)分析方法在樣品預(yù)處理方面也具有優(yōu)勢(shì)。因此，如果能讓電化學(xué)分析方法在檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品時(shí)實(shí)現(xiàn)無需或僅需極少的預(yù)處理即可進(jìn)行檢測(cè)，就能極大的提高檢測(cè)效率，實(shí)現(xiàn)更加簡(jiǎn)便快速的檢測(cè)。未來電化學(xué)分析技術(shù)必將朝著檢測(cè)限更低、檢測(cè)范圍更廣、靈敏度和特異性更高，適合多組分快速檢測(cè)和易于商品化的方向不斷完善發(fā)展，解決環(huán)境和食品中CBZ殘留的快速檢測(cè)問題。