線粒體靶向型熒光探針研究進展

賀麗蓓，潘松蘭，閆 奇，薛 倩，鄧翔熙，孫蕓琳，趙聰慧，鄒 振

（長沙理工大學化學與食品工程學院，細胞化學湖南省重點實驗室，湖南長沙410114）

0 前言

線粒體作為真核細胞中最重要的細胞器之一，它通過β-氧化反應，三羧酸循環(huán)，氧化磷酸化產生ATP（廣泛存在于包括合成代謝在內的大量代謝化學反應中的能量分子），為各種細胞活動提供能量[1-3]。線粒體除了參與細胞能量代謝外，通過產生活性氧(reactive oxygen species,ROS)、氧化還原分子和代謝物，廣泛參與細胞信號轉導、細胞周期、增殖分化和死亡等生命活動[4-6]，在多種生理和病理過程中扮演著重要角色。

研究監(jiān)測線粒體中生物化學物質/微環(huán)境因素能夠獲得線粒體的生物信息，有助于深入了解線粒體狀態(tài)對健康和疾病狀態(tài)的影響，在線粒體生理病理學中的作用至關重要[7]。在過去的幾年中，發(fā)展了線粒體中生物分子濃度或微環(huán)境變化的探針，例如線粒體靶向的過氧化氫選擇性探針，定位于線粒體的鋅離子傳感器等。該文對線粒體靶向型熒光探針用于線粒體活性物質、微環(huán)境以及線粒體自噬的成像應用研究進行了綜述，并列舉了近年來這類探針的研究成果和開發(fā)進展。

1 線粒體靶向型探針的成像應用研究

為維持細胞的正常功能，線粒體內的各種活性物質如ROS和金屬離子等，以及微環(huán)境如pH值、溫度、極性、缺氧以及粘度等發(fā)揮了重要作用。實時原位、動態(tài)準確和可逆的監(jiān)測線粒體內的活性物質與微環(huán)境對探索細胞器與細胞生理學的復雜聯(lián)系以及生理和病理功能具有重要意義。因此，研究人員設計了很多線粒體靶向型熒光探針用于細胞中線粒體微環(huán)境等成像，這些熒光探針提供了大量重要的時空信息[8-9]。線粒體靶向性熒光探針的設計已經成為化學、生物學和醫(yī)學領域中最熱門的方向之一。

1.1 線粒體活性物質成像

線粒體的氧化應激和能量代謝是至關重要的生物學事件，并參與各種生理和病理過程，例如細胞凋亡和壞死。線粒體是活性物質如ROS和活性硫(Reactive Sulfur Species,RSS)的主要生產者，線粒體中的ROS和RSS處于動態(tài)平衡狀態(tài)。一方面，某些抗腫瘤藥物的作用機理尚不明確，一般認為它可能引起氧化應激，進而迫切需要開發(fā)雙功能探針以研究藥物作用期間ROS和RSS的動態(tài)水平。另一方面，腫瘤細胞中ROS和RSS的水平高于正常細胞。因此，線粒體中活性物質的檢測與成像對相關的生物、醫(yī)學領域研究具有重要意義。

Zhao等[10]開發(fā)了一種對SO2/HOCl的雙位響應的雙光子熒光探針NPCl A，用于對線粒體應力進行成像，通過雙位點識別和三通道熒光中的線粒體應激成像來說明SO2/ClO-的動態(tài)平衡（圖1）。

圖1 NPClA檢測HSO3-和ClO-的機制[10]Fig.1 The proposed mechanism of NPClA for detecting both HSO3-and ClO-

Fang等[11]開發(fā)了一種新型線粒體靶向型近紅外熒光探針MI-H2S，可在純水溶液中實現(xiàn)對H2S的快速檢測，并在663 nm處產生具有高選擇性和高靈敏度的熒光“on”信號。生物成像實驗顯示，該探針具有良好的線粒體靶向能力和高對比度成像性能，可在生命系統(tǒng)中檢測H2S（圖2）。

圖2 線粒體靶向型近紅外熒光探針MI-H2S用于H2S的檢測和成像[11]Fig.2 Near-infrared mitochondria-targetable fluorescence probe MI-H2S for detection and imaging of H2S[11]

為了研究線粒體過氧化氫（H2O2）和三磷酸腺苷（ATP）的動態(tài)模式，Tian等[12]開發(fā)了一種基于雙光子熒光壽命探針（TFP），研究了線粒體中H2O2和ATP之間的關系，通過實時成像并同時測定兩個單獨的熒光通道中線粒體H2O2和ATP的變化，而不會發(fā)生光譜串擾，可揭示線粒體中氧化應激誘導的與H2O2和ATP相關的細胞內功能（圖3）。

圖3 探針(TFP)用于檢測H2O2和ATP的示意圖[12]Fig.3 Schematic diagram of the TFP for detecting the H2O2 and ATP[12]

Zhang等[13]通過將不溶于水的新型固態(tài)熒光團HQPQ對探針進行修飾，設計并合成了一種可用于H2O2檢測的探針（HQPQ-B）。由于喹啉鹽和喹諾酮類藥物靶向線粒體的能力不同，HQPQ在與線粒體外的分析物發(fā)生反應后會失去靶向線粒體的能力，而當探針靶向線粒體并與被分析物反應后，HQPQ會沉淀并保留在線粒體中而不會擴散到其他位點，進而可以對線粒體分析物進行準確檢測（圖4）。

圖4 HQPQ-B檢測H2O2的示意圖[13]Fig.4 Schematic diagram of the HQPQ-B for detecting H2O2[13]

1.2 線粒體微環(huán)境成像

1.2.1 pH成像

線粒體內pH呈弱堿性，這是其維持正常生理功能的必要條件。因此，可快速、準確、靈敏的監(jiān)測和成像活細胞中線粒體pH，對于線粒體相關的信號傳導和病理研究具有重要價值。2017年，Sun等設計了一種基于剛果紅（CR）修飾的雙發(fā)射半導體聚合物點（Pdots）比率型熒光探針[14]。該探針通過競爭性熒光共振能量轉移的機制用于活細胞線粒體pH的監(jiān)測和成像。其由作為熒光供體的PFO和PF-DBT5、作為能量受體的CR和作為線粒體靶向基團的TPP所組成。該探針具有良好的生物相容性、較寬的pH值檢測范圍（2.57~8.96）、高選擇性、良好的可逆性和光穩(wěn)定性，成功應用于活細胞線粒體pH的監(jiān)測和成像（圖5）。

圖5 線粒體靶向Pdots對pH響應示意圖[14]Fig.5 Schematic diagram of mitochondrial targeted Pdots response to pH[14]

Kim等報告了線粒體靶向的pH敏感探針，用于定量測量線粒體pH的變化，以及實時監(jiān)測活細胞中與pH有關的生理效應[15]。其中哌嗪連接的萘二甲酰亞胺作為熒光信號單元，陽離子三苯基膦基團用于線粒體靶向，芐基氯亞基用于固定于線粒體中。該探針對線粒體酸化有良好的熒光響應，而且，能夠監(jiān)測由營養(yǎng)饑餓引起的線粒體所消除的受損線粒體（圖6）。

圖6 pH敏感探針的示意圖[15]Fig.6 Schematic diagram of the pH sensitive probe[15]

正常狀態(tài)的線粒體保持著堿性環(huán)境（pH~8.0），細胞核中的DNA也表現(xiàn)出嗜堿特性。基于線粒體和細胞核pH的差異，Yu等[16]將帶有羥基的菁染料結構與苯并噻唑結合，設計合成了pH敏感的熒光探針（HMBI），該探針在酸性環(huán)境中發(fā)射綠色熒光，在堿性環(huán)境中發(fā)射紅色熒光。在細胞成像實驗中，該探針可以雙色成像線粒體和細胞核（圖7）。

圖7 探針pH響應機制和雙色成像細胞核和線粒體的模式圖[16]Fig.7 Mode diagram of probe pH response mechanism and two-color imaging cell nucleus and mitochondria[16]

1.2.2 極性成像

極性是化學和化學技術中的一個重要參數(shù)，在很大程度上控制著反應過程。在生物系統(tǒng)中，特別是在細胞水平上，極性決定了蛋白質和酶的相互作用活性或反映了膜室的滲透性。此外，極性的異常變化與疾病(如糖尿病、肝硬化)密切相關。然而，極性是一個復雜的因素，它包含了一系列非共價的相互作用，包括雙極性/極化率和氫鍵，其在不同細胞器中局部極性差異很大。因此，檢測線粒體內極性的變化對于監(jiān)測不同的細胞狀態(tài)至關重要，可以幫助人們深入了解生理過程和病理過程。

Tang等開發(fā)了新型的線粒體靶向熒光探針MCY-BF2，對線粒體極性非常敏感[17]。通過與心磷脂結合，MCY-BF2優(yōu)先在線粒體中積累。由于熒光發(fā)射波長隨介質極性的增加呈現(xiàn)明顯的紅移，因此兩個不同波長的熒光強度比與溶劑介電常數(shù)可以量化線粒體極性。MCY-BF2作為首個近紅外和最靈敏的極性熒光成像探針，可定位于不同細胞的線粒體中，識別正常細胞和癌細胞的極性差異。此外，體內成像結果顯示，小鼠腫瘤組織的極性明顯低于正常組織。近紅外特性、高靈敏度和中斯托克斯位移等優(yōu)點大大提高了成像的精度（圖8）。

圖8 探針的化學式及對應的功能單元[17]Fig.8 Chemical formula of probe and the corresponding function unit[17]

目前對于線粒體的定位的研究主要用的是三苯基鏻（TPP）陽離子，這很難與許多官能團聯(lián)合實現(xiàn)對線粒體多種功能的成像與測量。Lei等[18]設計和發(fā)展了一種新型的探針MMP，該探針是以多肽為骨架的傳輸系統(tǒng)，其具有可穿透細胞的線粒體特異性載體，且不具有膜破壞活性。并將苯基喹喔啉衍生小分子熒光基團和香豆素343基團連接到線粒體穿透肽的兩端，從而實現(xiàn)對線粒體的粘度和極性的實時監(jiān)控（圖9）。

1.2.3 溫度成像

線粒體熱力學是細胞內穩(wěn)態(tài)和能量平衡相關活動的關鍵，其局部溫度是反映線粒體狀態(tài)和功能的重要指標，而異常的溫度可能反映疾病引起的線粒體功能障礙。因此，從生物學研究和臨床診斷的角度實時監(jiān)測線粒體溫度變化具有非常重要的生物學意義。Takeoka等報告了第一個比率熒光分子探針(Mito-RTP)，由兩種羅丹明染料組成，即羅丹明B和CS NIR染料[19]。該探針選擇性定位于線粒體并可視化溫度，并證實Mito-RTP可以在活細胞中作為比率溫度計使用。

同時，線粒體溫度也是正常生理和細胞病理的潛在指標。2018年，Xiao等設計了一種可固定的分子溫度計（Mito-TEM）以實時顯示線粒體溫度[20]。Mito-TEM是由羅丹明B和苯甲醛所構成。其中羅丹明B通過與蛋白質的氨基結合，使其固定在線粒體中，從而實現(xiàn)長期的溫度監(jiān)測。Xiao等繪制出了線粒體溫度與熒光強度的標準曲線。因此，在類似的染色實驗下，它們可以將線粒體中探針的熒光強度轉換為溫度，從而作為區(qū)分細胞正常生理或病理狀態(tài)的手段（圖10）。

圖10 Mito-TEM的(A)工作原理和(B)設計思路[20]Fig.10 Work principles and synthesis of the Mito-TEM[20]

為實現(xiàn)線粒體溫度精準定量，Xiao等[21]進一步從“開-關”探針Mito-TEM擴展到基于F?rster共振能量轉移機制的比例式探針Mito-TEM 2.0，將熒光比率成像和醛基固定的策略相結合，開發(fā)了溫度探針Mito-TEM 2.0。Mito-TEM 2.0通過兩個發(fā)射波段的比率值變化定量指示線粒體內溫度變化，能可視化熒光比率成像定量監(jiān)測活體斑馬魚在炎癥過程中溫度的變化（圖11）。

圖11 (A)探針分子的設計和(B)在外源刺激下炎癥細胞與斑馬魚模型線粒體溫度的熒光比率成像[21]Fig.11 (A)The design of the probe molecule and(B)fluorescence ratio imaging of inflammatory cell and mitochondria model under external stimulation[21]

1.2.4 粘度成像

細胞內粘度在信號傳遞、生物大分子相互作用、電子傳遞、代謝物擴散等過程中均起著重要作用。粘度的異常變化會導致代謝紊亂及各種疾病，比如阿爾茨海默病、糖尿病、動脈粥樣硬化、細胞惡性腫瘤、高血壓、帕金森病和神經退行性疾病等。因此，對活細胞理化參數(shù)的測定，可以提供特定于單個細胞器的信息，幫助人們了解細胞器在健康和疾病中的作用。

Yoon等設計了一種粘度敏感的熒光染料，即噻吩二半花菁（TDHC），可以特異性靶向線粒體，并對線粒體膜電位和線粒體內粘度變化具有高度敏感[22]。該染料被用于實時監(jiān)測原代皮層神經元中線粒體的運輸（圖12）。

圖12 粘度敏感熒光探針實時監(jiān)測原代皮層神經元線粒體轉運[22]Fig.12 Real-time monitoring of mitochondrial transport of primary cortical neurons by a viscosity-sensitive fluorescence probe[22]

2020年，Guo等[23]設計了一種黏度響應的小分子有機探針（Coupa），用于監(jiān)測線粒體和溶酶體在活細胞中的相互作用。通過功能性熒光轉換，Coupa可以同時用藍色熒光標記線粒體和用紅色熒光標記溶酶體，并且紅藍色熒光強度之間的相關性表明線粒體在線粒體與溶酶體相互作用中的進展。此外，由于其熒光對粘度敏感，Coupa能夠精確定位線粒體-溶酶體接觸的部位，并揭示與線粒體-溶酶體接觸相關的線粒體局部粘度增加（圖13）。

圖13 雙重標記粘度探針的設計[23]Fig.13 Design of a dual-labeling viscosity probe[23]

2021年，Zhou等[24]設計了一個線粒體靶向的近紅外熒光探針NIR-V，其具有700 nm的近紅外光發(fā)射和良好的深層組織滲透性，對粘度具有高度的選擇性和靈敏度。由于其獨特的特性，被成功用于成像于活細胞及糖尿病小鼠模型中胰腺組織內粘度的變化，在糖尿病診斷中顯示出潛力（圖14）。

圖14 探針NIR-V的粘度響應[24]Fig.14 The viscosity response of the probe NIR-V[24]

1.3 線粒體自噬成像

當線粒體發(fā)生突變或局部損傷時，細胞常常發(fā)生線粒體自噬現(xiàn)象，通過溶酶體清除功能失調或多余的線粒體，從而微調線粒體數(shù)和保持能量代謝。研究表明，線粒體自噬一種進化上保守的細胞過程，異常的線粒體自噬與諸多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，如阿爾茲海默癥、糖尿病、腫瘤、感染類疾病等。因此，深入研究線粒體自噬過程中的分子機制和微環(huán)境變化，討論了線粒體自噬在生理和病理條件下的關鍵作用對于深入了解線粒體疾病的致病機制具有重大意義，也為相關藥物的篩選提供理論基礎。近幾年，線粒體自噬的研究一直處于學科前沿，熱度也在逐年增加。線粒體自噬的傳統(tǒng)研究工具包括透射電子顯微鏡、Western Blot、MDC染色等，這些方法無法獲取活細胞內線粒體自噬的相關信息。為解決這一問題，熒光分子探針技術陸續(xù)被開發(fā)并用于活細胞中線粒體自噬過程的監(jiān)測。

2018年，Zhang等報道了一種近紅外熒光探針（NIR-HMA），用于實時可視化低氧微環(huán)境和隨后的活細胞中線粒體自噬過程[25]。NIR-HMA以NIR-MAO（710 nm處發(fā)射）的形式選擇性聚集在缺氧的線粒體，然后在酸化的含線粒體的自溶酶體中轉化為NIR-MAOH（675 nm處發(fā)射）。通過將缺氧反應性基團與NIR熒光染料的羥基結合（顯示比例pH值變化），NIR-HMA可以區(qū)分低氧微環(huán)境和線粒體自噬的不同水平。此外，使用NIR-HMA可以跟蹤從線粒體到自溶酶體的完整線粒體自噬過程，并可視化癌細胞和正常細胞中僅由低氧引起的線粒體自噬。該工作為低氧微環(huán)境中相關生理過程的實時可視化提供有力的方法（圖15）。

圖15 NIR-HMA的示意圖，用于缺氧誘導的線粒體自噬的可視化[25]Fig.15 Schematic diagram of the NIR-HMA and visualization for hypoxia-induced mitochondrial autophagy[25]

Yang等報道了一種通過包裹陽離子螺并吡喃烷衍生物（Mito-rHP）來實現(xiàn)缺氧條件下活細胞線粒體成像的一種偶氮還原酶響應納米探針（Micelle@Mito-rHP@TATp，MCM@TATp）[26]。實驗結果表明，MCM@TATp可以在低氧下以高特異性成像線粒體，這種新策略為與缺氧相關的基礎和臨床研究提供了有力工具（圖16）。

圖16 探針在缺氧條件下成像活細胞的線粒體自噬過程[26]Fig.16 Probe for mitochondrial autophagy process of imaging living cells under hypoxic conditions[26]

Tan等[27]報告了以花菁為母體的新型近紅外熒光探針分子（HQO），它可以通過表現(xiàn)出不同的熒光特性用來同時探測活細胞中的線粒體和自溶酶體。HQO選擇性地在線粒體中積累，但當功能失調的線粒體變成自溶酶體時，隨著pH降低，HQO會轉化為質子化的HQOH+。由于HQO和HQOH+在530/650和710/750 nm處的Ex/Em表現(xiàn)出不同的吸收和發(fā)射，因此通過顯示不同的熒光可以同時區(qū)分活細胞中的線粒體和自溶酶體，準確示蹤線粒體自噬過程（圖17）。

圖17 HQO成像線粒體自噬過程的示意圖[27]Fig.17 Schematic representation of the mitophagy process probed by HQO[27]

為了探究在線粒體自噬過程中，溶酶體基質降解與線粒體的粘度變化之間的關系，該文課題組利用靶向線粒體的分子轉子，乙基-4-[3,6-雙(1-甲基-4-乙烯基吡啶)-9H-咔唑-9-基)]丁酸酯（BMVC）作為分子粘度轉子，通過構建饑餓條件下線粒體自噬模型，在活細胞的線粒體自噬過程中實時觀察線粒體粘度變化[28]，發(fā)現(xiàn)了線粒體自噬過程中粘度逐漸增加的現(xiàn)象。此探針可以為線粒體病變過程的原位和實時監(jiān)測研究提供良好的平臺（圖18）

圖18 BMVC在活細胞中監(jiān)測線粒體自噬的示意圖[28]Fig.18 The mechanism of monitoring mitophagy using BMVC in living cells[28]

2 結論與展望

線粒體作為細胞中重要的細胞器之一，其決定了細胞的穩(wěn)態(tài)、信號傳導、免疫和代謝等過程，因此線粒體靶向型熒光探針對于研究線粒體功能信息具有重要意義。然而，目前最常用的熒光染料探針仍存在易光漂白、高背景信號、易產生假陽性信號與假陰性信號以及會影響線粒體功能等缺點。在未來的相關研究中，可以設計高特異性、抗光漂白性好、能克服假陽性和假陰性信號等性能優(yōu)良的探針，以獲得高保真信號進而提高檢測結果的準確性，幫助人們了解線粒體在健康和疾病中的更多作用。