間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移和歸巢以及提高其治療效率的方法

甘鳳山，趙嫻

( 昆明醫(yī)科大學(xué)附屬附屬第一醫(yī)院整形外科，云南 昆明)

0 引言

充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是一種來(lái)源于骨髓的非造血細(xì)胞。40年前Friedenstein[1]等人首先提出間充質(zhì)干細(xì)胞的概念。2006年，國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)定義人間充質(zhì)干細(xì)胞的最低標(biāo)準(zhǔn)。它們必須有粘附特性，且能分化成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞以及脂肪細(xì)胞。同時(shí)，它們必須能夠表達(dá)CD105，CD90 和CD7，但對(duì)于CD45，CD34，CD14，CD11b，CD79α，CD19 以及HLA-DR 表面分子的表達(dá)卻是缺失的[2]。人們?cè)谂R床多個(gè)領(lǐng)域嘗試應(yīng)用這些細(xì)胞，比如神經(jīng)內(nèi)科、心血管內(nèi)科及骨科，用于修復(fù)大塊骨缺損。MSC 的歸巢屬特性和在靶器官的持久性，使其擁有以上諸多用途。目前，造血干細(xì)胞移植多通過(guò)靜脈注射完成。為治療需要而全身輸注細(xì)胞意味著需要有高效的遷移和歸巢到靶部位的能力。在本篇綜述中，我們討論了關(guān)于MSC 歸巢的現(xiàn)有知識(shí)，特別是著重于骨髓歸巢，總結(jié)了目前提高M(jìn)SC歸巢效率的方法。

1 MSC 歸歸巢和遷移到骨髓和其他組織

MSC 遷移和歸巢到組織的確切機(jī)制尚未完全闡明。一般認(rèn)為，這些干細(xì)胞遵循與白細(xì)胞歸巢相同的步驟。第一步，這些細(xì)胞通過(guò)粘附和滾動(dòng)與內(nèi)皮細(xì)胞接觸，導(dǎo)致血液流動(dòng)速度減慢；第二步，細(xì)胞被G 蛋白偶聯(lián)受體激活，緊接著被整合素介導(dǎo)的激活依賴性阻滯激活；最后，細(xì)胞通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞和底層基底膜進(jìn)行遷移。

在動(dòng)物模型和患者身上已經(jīng)證明，MSC 具有遷移并歸巢到各種組織的能力。早期在動(dòng)物模型中進(jìn)行的子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植研究表明，供體來(lái)源的非造血細(xì)胞存在于骨髓、胸腺、脾臟和肝臟中。Devine 等人的[3]和Chapel 等人的[4]在非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物中進(jìn)行了MSC 移植，并在多種組織中觀察到MSC，在胃腸道中數(shù)量最多。MSCs 在不同組織中的百分比為估計(jì)介于0.1%和2.7%之間。Erices 等人的[5]描述了人臍帶血來(lái)源的MSCs 經(jīng)全身輸注后在免疫缺陷(裸)小鼠骨髓中的歸巢和存活。幾項(xiàng)對(duì)患者的研究中也顯示MSC 具有歸巢能力。

有研究小組使用不同的技術(shù)手段分析了系統(tǒng)灌注骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后的遷移動(dòng)力學(xué)。輸注后，MSCs 立即聚集在肺內(nèi)，隨后，細(xì)胞被從肺中清除并分布到其他組織。這些細(xì)胞可通過(guò)靜脈或動(dòng)脈內(nèi)注射進(jìn)行全身灌注。前者是侵入性最小、操作最簡(jiǎn)便的方法;然而，相對(duì)于靜脈，動(dòng)脈注射因?yàn)樾枰獎(jiǎng)用}穿刺風(fēng)險(xiǎn)較高，也可能導(dǎo)致微血管閉塞癥的發(fā)生。

Kyriakou 等人研究了影響MSCs 短期骨髓歸巢的因素。靜脈注射后24 小時(shí)，分別在骨髓、脾臟、肝臟和骨髓中觀察到干細(xì)胞。并且注意到，放射線對(duì)幼齡動(dòng)物的歸巢作用明顯增強(qiáng)并隨細(xì)胞的傳代次數(shù)的增加而減少[6]。

2 MSC 歸巢到骨髓的相關(guān)分子

在歸巢的過(guò)程中不同的分子參與不同的步驟。內(nèi)皮細(xì)胞上的選擇素主要參與第一步。特別是對(duì)于骨髓歸巢，造血細(xì)胞E-/ l -選擇素配體(HCELL)的表達(dá)是非常重要的，HCELL是CD44 在遷移細(xì)胞上的一種特殊的糖型。雖然MSCs 表達(dá)CD44，但它們不表達(dá)HCELL。

參與活化步驟的G 蛋白偶聯(lián)受體通常是趨化因子受體。已經(jīng)廣泛證明CXCR4-基質(zhì)衍生因子-1 (SDF-1)軸對(duì)骨髓歸巢[7]至關(guān)重要。

整合素在第三步的穩(wěn)定激活依賴性阻滯中起重要作用。有研究表明，抑制整合素β1 可以抑制MSC 歸巢。整合素形成二聚體，與內(nèi)皮細(xì)胞上的粘附分子結(jié)合。整合素α4 和β1相結(jié)合，形成遲發(fā)性抗原4 (VLA-4)并與血管細(xì)胞粘附分子1 (VCAM-1)相互作用。已有研究表明，VCAM-1-VLA4 相互作用在MSC 歸巢中起作用。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等溶解酶裂解基底膜的組分是通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞層和基底膜進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)的最后一步。特別是，明膠酶MMP-2 和MMP-9 在這一步中起重要作用，因?yàn)樗鼈儍?yōu)先降解膠原和明膠，這是基底膜的兩個(gè)主要成分。我們發(fā)現(xiàn)MSC 的遷移受MMP-2 和組織抑制金屬蛋白酶3 (TIMP-3)的調(diào)控。MT1-MMP 在MSC 遷移中起作用?；|(zhì)金屬蛋白酶是作為前酶分泌的。ProMMP-2 通過(guò)與MT1-MMP 和TIMP-2的相互作用被激活，并被TIMP-1 抑制。這解釋了為什么MMP-2、MT1-MMP 或TIMP-2 敲除降低了MSCs 的侵襲能力，以及Ries 等人發(fā)現(xiàn)的TIMP-1 敲除導(dǎo)致了的侵襲增加[8]。

除了經(jīng)典的歸巢表達(dá)外，不同的研究小組也描述了MSCs上生長(zhǎng)因子受體的表達(dá)。多項(xiàng)研究表明，生長(zhǎng)因子也可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞遷移。例如，血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF) AB和BB 可在體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞遷移[9]。另一個(gè)參與間充質(zhì)干細(xì)胞遷移的生長(zhǎng)因子是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，它與c-met 結(jié)合。PDGF-BB 和HGF 均已作為一種改善MSCs 體外遷移的手段復(fù)合于凝膠或支架上[10,11]。

3 如何增加MSC 的歸巢效率

MSC 歸巢效率與幾個(gè)因素被認(rèn)為是有關(guān)的。首先，MSCs上的歸巢分子表達(dá)有限。另一個(gè)值得關(guān)注的問(wèn)題是，MSCs 在體外擴(kuò)增過(guò)程中似乎失去了歸巢分子的表達(dá)。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)和來(lái)自不同組織的間充質(zhì)干細(xì)胞中也存在歸巢分子的異質(zhì)表達(dá)，其歸巢分子表達(dá)譜不同[12]。

由于提高M(jìn)SCs 在全身給藥后的歸巢效率和在靶組織中的保留將提高它們的治療效果，許多研究小組正在研究實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的方法。主要通過(guò)一下策略來(lái)實(shí)現(xiàn)。

3.1 聯(lián)合藥物輸注

體內(nèi)研究反復(fù)表明，經(jīng)靜脈注射后，間充質(zhì)干細(xì)胞被困在肺內(nèi)。在給小鼠輸注骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞之前，給小鼠輸注血管擴(kuò)張劑，可以明顯減少在肺部截留的間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量，并顯著增加間充質(zhì)干細(xì)胞向長(zhǎng)骨骨髓的回流。湯川等[13]將MSCs 移植聯(lián)合肝素治療這一策略也顯著減少了MSC 在肺部的滯留。

3.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)前的處理，或改變培養(yǎng)條件

增加膜上CXCR4 的表達(dá)是目前研究的重點(diǎn)。實(shí)現(xiàn)這一目的的一種方法是在擴(kuò)增過(guò)程中向培養(yǎng)基中添加細(xì)胞因子或細(xì)胞因子混合物。有研究表明，flt3 配體、干細(xì)胞因子(SCF)、IL 3、IL 6 和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)聯(lián)合作用可增加培養(yǎng)的msc 上細(xì)胞內(nèi)和膜上CXCR4 的表達(dá)。預(yù)處理后的細(xì)胞更多地向SDF-1 梯度遷移，預(yù)處理對(duì)MSCs 支持造血的功能沒(méi)有影響。在體內(nèi)歸巢實(shí)驗(yàn)中，MSCs 被靜脈注射到亞致死照射的小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子治療后骨髓歸巢顯著增加。其他分子，已經(jīng)被證明可以增加趨化因子受體CXCR4 表達(dá)，比如胰島素樣生長(zhǎng)因子1 (IGF - 1)、腫瘤壞死因子α(TNFα)，IL 1β，干擾素γ(IFNγ)[14]。BMS 培養(yǎng)時(shí)經(jīng)糖原合成酶激酶3β(GSK - 3β)抑制劑處理后，可以上調(diào)趨化因子受體CXCR4 表達(dá)，使其體外遷移能力增強(qiáng)，而不影響細(xì)胞的生存能力[15]。經(jīng)證實(shí)，BMS 暴露于補(bǔ)體1q (C1q)，雖然CXCR4 表達(dá)沒(méi)有顯著增加，但可增加MSC 向SDF-1 的遷移。

經(jīng)GSK-3β 抑制劑和C1q 處理后，增加BMS 的MMP 表達(dá)，而MMP 在遷移過(guò)程中對(duì)基底膜的降解至關(guān)重要。造血生長(zhǎng)因子促紅細(xì)胞生成素(EPO)和粒細(xì)胞的結(jié)合集落刺激因子(G-CSF)也被報(bào)道可增加MMP-2 在MSCs 中的表達(dá)并改善其運(yùn)動(dòng)能力[16]。

也有證據(jù)表明，短期暴露于丙戊酸誘導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)制導(dǎo)致培養(yǎng)的BMS 中CXCR4 和MMP-2 的表達(dá)增加，并向SDF-1 的遷移增加。并且對(duì)細(xì)胞的分化能力沒(méi)有影響[17]。

另一種正在研究的方法是在缺氧條件下培養(yǎng)MSCs。幾組研究表明，這些條件導(dǎo)致CXCR4 表達(dá)增加，并改善了MSC在體內(nèi)和體外的遷移。據(jù)報(bào)道，趨化因子受體CXCR4 表達(dá)的增加是因?yàn)槿毖跽T導(dǎo)因子(HIF) 1α 增加。缺氧還導(dǎo)致MMPs的差異表達(dá)。比如，在缺氧條件下培養(yǎng)的MSCs 中，MMP-2的分泌減少，MT1-MMP 的分泌和活性增加。

對(duì)培養(yǎng)條件的一種較簡(jiǎn)單的改變是保持較低細(xì)胞融合度。有的課題組發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)至完全融合的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移能力低于維持在低融合狀態(tài)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。與低融合培養(yǎng)的MSCs 相比，高融合培養(yǎng)的細(xì)胞分泌更多的MMPs抑制劑TIMP-3，限制了MSCs 的遷移。

3.3 基因改造

由于CXCR4-SDF1 軸對(duì)骨髓歸巢很重要[18]，許多研究小組設(shè)計(jì)了轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)中，CXCR4 表達(dá)質(zhì)?；蛞苑遣《痉绞交虿《痉绞竭M(jìn)入細(xì)胞。在NOD/SCID 移植模型心內(nèi)注射后，CXCR4 過(guò)表達(dá)可改善MSC 向骨髓的歸巢。在類似的模型中，整聯(lián)蛋白α4(VLA4 的一個(gè)亞基)的過(guò)表達(dá)與VCAM-1 相互作用，也促進(jìn)了BMS 向骨髓歸巢。然而，這種技術(shù)也有一些缺點(diǎn)。最重要的是，人們擔(dān)心使用病毒載體引入質(zhì)粒DNA 會(huì)帶來(lái)插入性腫瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)。

不同的質(zhì)粒DNA 非病毒轉(zhuǎn)染模式已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)。有究小組使用mRNA 核轉(zhuǎn)染的方法使MSC 中的CXCR4 過(guò)表達(dá)。他們獲得了表面受體90%的表達(dá)，但細(xì)胞存活率僅為62%，未觀察到間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢的增加[19]。另一組研究了利用超聲和微泡在msc 中插入短干擾RNA 以提高存活率的可行性?？梢垣@得顯著的靶基因敲除(PTEN)，但操作后細(xì)胞受到損傷。

3.4 細(xì)胞表面工程

近年來(lái)引起人們興趣的一種提高M(jìn)SCs 歸巢效率的方法是細(xì)胞表面工程，即細(xì)胞表面的時(shí)的修飾。已有研究表明，這些修飾不影響細(xì)胞的活力、增殖、粘附或分化[20-22]。

2008 年，Sackstein 等人發(fā)表了一篇關(guān)于這一領(lǐng)域的開(kāi)創(chuàng)性論文，他們報(bào)告說(shuō)，他們已經(jīng)將在MSC 上表達(dá)的天然CD44在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為造血細(xì)胞E-選擇素/ L-選擇素配體(HCELL)的糖苷形式。E -選擇素在造血干細(xì)胞(HSC)向骨髓定向過(guò)程中起關(guān)鍵作用，然而，MSC 不表達(dá)HSC 骨髓歸巢所需的兩種E -選擇素配體P -選擇素糖蛋白配體-1 (PSGL-1)或HCELL，從而削弱了它們對(duì)骨髓的歸巢能力[23]。MSC 本身表達(dá)CD44。Sackstein 等人能夠?qū)D44 轉(zhuǎn)化為HCELL 糖體。這種處理對(duì)細(xì)胞的活力和表型沒(méi)有影響。在NOD/SCID小鼠尾靜脈注射間充質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)歸巢實(shí)驗(yàn)表明，即使在CXCR4 缺失的情況下，HCELL+間充質(zhì)干細(xì)胞仍歸巢至骨髓。

Sialyl Lewis X (SLE X)是PSGL-1 的活性位點(diǎn)。因此，將這種分子引入間充質(zhì)干細(xì)胞膜中也可以改善間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢。Sarkar 等[24]使用生物素化微囊泡修飾MSCs。當(dāng)囊泡與間充質(zhì)干細(xì)胞接觸時(shí)，它們?nèi)诤系郊?xì)胞膜中，從而產(chǎn)生生物素化的間充質(zhì)干細(xì)胞。利用鏈霉親和素連接劑，生物素化的SLE X 可以固定在細(xì)胞表面。體外實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)照組的MSCs相比，表達(dá)SLE X 的MSCs 在剪切應(yīng)力作用下表現(xiàn)出更好的黏附性。

Lo 等人[25]描述了另一種工程方法來(lái)改善MSC 與選擇素的結(jié)合并促進(jìn)吸附和轉(zhuǎn)移。將PSGL-1 (Fc19)的前19 個(gè)氨基酸與IgG 尾巴和SLEX 糖鏈結(jié)合，形成泛選擇結(jié)合配體。這些MSC 在剪切應(yīng)力作用下確實(shí)具有粘附能力。

3.5 目標(biāo)組織的修飾

最后，MSC 的遷移和歸巢可以通過(guò)修飾靶組織來(lái)影響。在早期的歸巢研究中，已經(jīng)證明了通過(guò)輻射改變目標(biāo)組織來(lái)增加MSC 歸巢。化療和放療后，骨髓中SDF-1 水平升高，對(duì)造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的吸引力增強(qiáng)。

4 結(jié)論

間充質(zhì)干細(xì)胞可用于多種治療，具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。問(wèn)題在于其歸巢效率低，達(dá)不到理想的治療效果?，F(xiàn)有研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞幾乎不表達(dá)或很少表達(dá)歸巢相關(guān)受體，因此限制了其遷移能力，從而減少了其歸巢效率及治療效果。而造成這種分子的低水平表達(dá)的原因和MSCs 在培養(yǎng)、擴(kuò)增過(guò)程中培養(yǎng)方式和方法的不同導(dǎo)致了這種歸巢相關(guān)因子的丟失有關(guān)。本文總結(jié)了改進(jìn)MSC 歸巢的策略和方法。這些方法都表現(xiàn)出有利于MSC 歸巢到目標(biāo)組織，但是其中有許多尚未在體內(nèi)得到驗(yàn)證。在將這些技術(shù)應(yīng)用于臨床之前，應(yīng)該首先在體內(nèi)歸巢模型中對(duì)這些技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。目前MSC 的分離和擴(kuò)增方法存在很大的差異。分離和擴(kuò)增方法的不同可能對(duì)MSC 功能、遷移和歸巢產(chǎn)生重大影響，未來(lái)應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)化的MSC 分離和擴(kuò)增方法，這也將更容易評(píng)估MSCs 在臨床環(huán)境中的治療效果。另外，間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢的機(jī)制尚未完全闡明，仍有大量研究針對(duì)其進(jìn)行。更好的理解間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢機(jī)制以及影響這一過(guò)程的因素，將使研究人員能夠優(yōu)化這些干細(xì)胞的遷移能力及其在靶組織中的治療效果，也將有利于其更好的應(yīng)用于臨床，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮更大的治療作用具有重要意義。