氧化三甲胺致動(dòng)脈粥樣硬化作用與膽固醇代謝有關(guān)

郝祥宇，郭建強(qiáng)

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特)

心血管疾病(CVD)是目前人類(lèi)面臨的主要死亡原因之一，而動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是許多心血管疾病的常見(jiàn)病理基礎(chǔ)。近年來(lái)，腸道微生物在動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中的作用得到越來(lái)越多的重視。人類(lèi)腸道微生物代表著超過(guò)100萬(wàn)億個(gè)微生物和5000個(gè)不同的物種，總共包含大約500萬(wàn)個(gè)基因[1]。這些基因?qū)ξ覀冋Ｉ砉δ艿木S持及新陳代謝具有重要意義[2]。一旦腸道微生物的生態(tài)環(huán)境出現(xiàn)失衡，會(huì)導(dǎo)致多種疾病。例如，心血管疾病，肥胖，2型糖尿病等。另外，腸道微生物對(duì)血脂水平的代謝也有重要影響。

動(dòng)脈粥樣硬化起始于低密度脂蛋白(LDL)的氧化修飾，單核細(xì)胞吞噬被修飾的低密度脂蛋白進(jìn)一步分化為巨噬細(xì)胞，更多的被修飾的LDL通過(guò)巨噬細(xì)胞表達(dá)的清道夫受體被攝取，發(fā)育成為泡沫細(xì)胞，沉積于動(dòng)脈血管壁。動(dòng)脈粥樣硬化是動(dòng)脈壁上的一種慢性炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為動(dòng)脈壁斑塊形成，管腔狹窄。在旨在改善動(dòng)脈粥樣硬化的靶點(diǎn)中，消除體內(nèi)過(guò)量的膽固醇沉積為一個(gè)有效的途徑[3]。

通過(guò)代謝組學(xué)及液相色譜質(zhì)譜分析(LC / MS)發(fā)現(xiàn)腸道微生物代謝產(chǎn)物氧化三甲胺(TMAO)與心血管疾病相關(guān)[4]。為了驗(yàn)證TMAO的致動(dòng)脈粥樣硬化作用，將斷奶C57BL/6J.Apoe-/-小鼠分為普通飼料(總膽堿含量為0.08～0.09%)、普通飼料中添加中量膽堿(0.5%)、添加高濃度膽堿(1.0%)或TMAO(0.12%)喂養(yǎng)組，在20周齡時(shí)，雄性和雌性小鼠在補(bǔ)充膽堿或TMAO的飲食中都發(fā)現(xiàn)了增強(qiáng)的主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，對(duì)每組膳食中血漿TMAO進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TMAO水平顯著增加，并且所有飲食組小鼠的血漿TMAO水平與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊大小呈顯著正相關(guān)。在兩個(gè)不同的人群研究隊(duì)列中，發(fā)現(xiàn)氧化三甲胺血漿水平與增加主要心血管不良事件(MACE)和死亡率的風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[5]。有研究[6]證實(shí)，TMAO獨(dú)立且比傳統(tǒng)心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)因子在更早的階段提示心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，可將其作為新型心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)因子。

氧化三甲胺(TMAO)是主要來(lái)源于膽堿、左旋肉堿以及其他含膽堿的化合物為前體的產(chǎn)物，它們來(lái)自富含磷脂酰膽堿的食物，包括紅肉、家禽、魚(yú)和雞蛋[7]，由腸道微生物通過(guò)三甲胺裂解酶(分別為CutC/D、CntA/B及YeaW/X)代謝為三甲胺(TMA)。TMA可以在腸道中吸收并通過(guò)門(mén)脈循環(huán)傳遞到肝臟，被肝臟黃素單加氧酶3 (FMO3)轉(zhuǎn)化為T(mén)MAO[8]，F(xiàn)MOs家族包含5種FMO基因，在TMA向TMAO轉(zhuǎn)化中，F(xiàn)MO3效率最高。當(dāng)FMO3發(fā)生基因突變時(shí)，TMA轉(zhuǎn)化為T(mén)MAO過(guò)程不能正常進(jìn)行，體內(nèi)過(guò)多的TMA由尿液、汗液等排出體外，散發(fā)出魚(yú)腥臭味，稱(chēng)為“魚(yú)腥味綜合癥”[9]。除了在肝臟中表達(dá)外，F(xiàn)MO3還在肺、腎上腺和主動(dòng)脈中表達(dá)。有趣的是，在老鼠和人類(lèi)身上都觀察到了女性比男性表現(xiàn)出更高的表達(dá)[10,11]。

TMAO可能通過(guò)以下途徑促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展：

(1)TMAO上調(diào)清道夫受體CD36、SR-A1，促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成

在斷奶時(shí)給予C57BL/6J.Apoe-/-小鼠添加TMAO的飲食(＞3周)，與正常飲食相比，補(bǔ)充TMAO飲食的小鼠其腹腔巨噬細(xì)胞清道夫受體CD36和SR-A1的mRNA和表面蛋白水平升高[4]，這說(shuō)明TMAO可上調(diào)巨噬細(xì)胞清道夫受體，促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成。進(jìn)一步研究了膳食膽堿和腸道菌群對(duì)高膽固醇巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞形成的影響，將C57BL/6J.Apoe-/-小鼠分為對(duì)照組(飼料膽堿含量0.07-0.08%)，高膽堿組(飼料膽堿含量(1.0%)。同時(shí)，半數(shù)小鼠給予廣譜抗生素治療3周，以抑制腸道微生物。結(jié)果表明，半數(shù)小鼠服用廣譜抗生素3周后，腸道微生物受到抑制，血漿TMAO水平降低了100倍以上。腹腔巨噬細(xì)胞的油紅O染色顯示，對(duì)照組小鼠有少量的內(nèi)源性巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞形成，而補(bǔ)充1%膽堿的小鼠則顯著促進(jìn)了富含脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞的發(fā)育，而對(duì)照組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的油紅O染色表明，添加1%膽堿的小鼠顯著促進(jìn)了高脂巨噬細(xì)胞的發(fā)育(圖5A)。相反，抑制腸道微生物顯著抑制了膳食膽堿誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞的形成。

(2)TMAO改變膽汁酸代謝、減小膽汁酸池

現(xiàn)已證明TMAO可改變膽汁酸代謝來(lái)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化[12]。膽汁酸是膽固醇分解代謝的最終產(chǎn)物，膽汁酸在肝臟中合成，釋放到近端腸道，再在遠(yuǎn)端腸道重吸收[13]。由膽固醇合成膽汁酸的限速步驟是由膽固醇7α羥化酶(CYP7A1)催化的[14]。通過(guò)對(duì)飲食中添加TMAO的小鼠研究發(fā)現(xiàn)，TMAO可通過(guò)下調(diào)CYP7A1表達(dá)來(lái)減少膽汁酸合成。同時(shí)，通過(guò)測(cè)量發(fā)現(xiàn)小鼠的總膽汁酸池減小，多種肝臟膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如Oatp1、Oatp4、Mrp2、Ntcp的表達(dá)減少[15]。法尼酯X受體(FXR)是一種主要的膽汁酸感受器，在調(diào)節(jié)膽汁酸穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮作用，也可通過(guò)調(diào)節(jié)膽汁酸穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，保護(hù)肝臟免受膽汁酸的毒性。FXR缺陷的小鼠不能適應(yīng)飲食中的膽酸超載，并表現(xiàn)出血脂異常，血清膽固醇和甘油三酯濃度升高[16,17]。FXR可通過(guò)FGF15/19依賴(lài)的機(jī)制[18]，抑制CYP7A1，減少膽汁酸合成。另外，BA池也可通過(guò)法尼醇X受體(FXR)介導(dǎo)的途徑上調(diào)FMO3的表達(dá)。

(3)TMAO影響膽固醇代謝

Koeth等[12]研究發(fā)現(xiàn)，給予小鼠TMAO飲食，可抑制小鼠腸道NPC1-L1及ABCG5/8(NPC1-L1：促進(jìn)膽固醇由腸腔內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到腸細(xì)胞內(nèi)吸收，ABCG5/8：促進(jìn)膽固醇由腸細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)入腸腔內(nèi)排泄)的表達(dá)，使膽固醇排泄減少，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。

抑制膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)：外周游離膽固醇(包括泡沫細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中的膽固醇)由HDL負(fù)載，被酯化為膽固醇酯(CE)，經(jīng)HDL的轉(zhuǎn)運(yùn)到達(dá)肝細(xì)胞后代謝成為膽汁，隨糞便排出體外，這一過(guò)程被稱(chēng)為高密度脂蛋白(HDL)的膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)[19]，通過(guò)受體(ABCA1，ABCG1，SR-B1)來(lái)介導(dǎo)。膽固醇可經(jīng)肝膽途徑排泄，即肝臟合成的HDL分泌無(wú)脂載脂蛋白(lipid-free apolipoprotein ，(apo) A-1)，ABCA1 調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇到ApoA1的轉(zhuǎn)運(yùn)，形成新生HDL，在膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)等參與下，最終被酯化為成熟HDL。在肝臟中，SR-B1選擇性攝取HDL上的CE，轉(zhuǎn)化為膽汁酸，通過(guò)腸道經(jīng)糞便排出體外。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給予TMAO飲食的小鼠，RCT降低了35%，這表明TMAO可通過(guò)抑制HDL介導(dǎo)的RCT來(lái)加重動(dòng)脈粥樣硬化。除了上述主要的肝膽膽固醇清除途徑外，近年來(lái)，另一種稱(chēng)為非膽道腸內(nèi)膽固醇輸出(TICE)途徑也被發(fā)現(xiàn)，其可促進(jìn)膽固醇從血液通過(guò)腸細(xì)胞直接轉(zhuǎn)移到腸腔[20]。TICE流失的膽固醇占總膽固醇排泄的30%[21]，基于對(duì)FMO3基因敲除小鼠進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)FMO3損害膽固醇流入TICE途徑[22]。

TMAO改變膽汁酸譜：膽汁酸可以分為初級(jí)膽汁酸和次級(jí)膽汁酸。在肝臟中合成初級(jí)膽汁酸，如膽酸(CA)、脫氧膽酸(TDCA)、鵝脫氧膽酸(CDCA)，進(jìn)入腸道后由腸道微生物進(jìn)一步代謝為次級(jí)膽汁酸，如去氧膽酸(DCA)、?；撬狴Z去氧膽酸(TCDCA)、?；撬嶝i去氧膽酸(THDCA)。其中幾種膽汁酸種類(lèi)，如CDCA及其結(jié)合形式，已經(jīng)被確認(rèn)為FXR激動(dòng)劑[23]，研究證明，給予apoE-/-小鼠TMAO喂養(yǎng)8周后，通過(guò)LC-MS測(cè)定了肝臟、膽汁和血清中的膽汁酸分布，膽汁中THDCA和TCDCA的百分比增加，而TDCA和CA的百分比降低，這可能與FXR的激活有關(guān)，進(jìn)而抑制膽汁酸的合成[3]。與膽汁相對(duì)應(yīng)，TMAO可誘導(dǎo)肝臟高THDCA率和低TDCA率。血清標(biāo)本中，TMAO組THDCA和DCA的檢出率均高于對(duì)照組。并且與膽汁一樣，TMAO也顯著降低了血清中CA的比例。TMAO組血清中THDCA的比例增加，TMCA的比例降低，表明飼料中的TMAO容易促進(jìn)腸道內(nèi)MCA(FXR的拮抗劑)形成HDCA。據(jù)報(bào)道，降低TMCAs水平可以促進(jìn)回腸FXR依賴(lài)性FGF15的表達(dá)，進(jìn)而抑制肝臟CYP7A1的表達(dá)[24]。因此，膽汁酸組成的改變可能是FXR活化的主要原因，進(jìn)而通過(guò)抑制Cyp7a1的表達(dá)而抑制膽汁酸的合成。

已報(bào)道的腸道微生物參與形成的代謝產(chǎn)物有上百種，每種代謝產(chǎn)物都可與某種生理功能、病理反應(yīng)相關(guān)聯(lián)。隨著研究的深入，腸道微生物與心血管疾病之間的關(guān)系關(guān)系越來(lái)越明確，腸道微生物代謝產(chǎn)物TMAO可通過(guò)多種方式加重動(dòng)脈粥樣硬化。體內(nèi)TMAO的濃度是由幾個(gè)主要因素決定的，包括飲食習(xí)慣、腸道微生物、FMO3活性、腎功能以及脂質(zhì)代謝等。其中，TMAO影響膽固醇正常代謝，加重體內(nèi)膽固醇沉積是一個(gè)重要的機(jī)制。因此調(diào)節(jié)飲食結(jié)構(gòu)，減少含膽堿食物攝入、抑制TMA產(chǎn)生、抑制FMO3活性等均可以成為干預(yù)策略，也為今后心血管疾病研究提供了新的思路。