肺孢子菌肺炎診斷方法研究進(jìn)展

陳杰，彭麗

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，重慶)

0 引言

肺孢子菌肺炎(Pneumocystis pneumonia，PCP)是由耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii，Pj)引起的感染[1]。PCP是艾滋病患者最常見(jiàn)而嚴(yán)重的機(jī)會(huì)性感染。隨著抗病毒治療和預(yù)防治療的推廣，艾滋病患者和PCP的發(fā)病率在歐美出現(xiàn)下降[2,3]。隨著器官移植和免疫抑制藥物使用的增多，PCP在非人類(lèi)免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)感染者中也變得常見(jiàn)。HIV感染的PCP患者通常會(huì)發(fā)展為亞急性病程，非HIV感染的免疫功能低下患者的特征是疾病進(jìn)展迅速，呼吸衰竭的風(fēng)險(xiǎn)更高，死亡率更高[4]。HIV陰性的PCP患者的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，早期影像學(xué)表現(xiàn)不典型，往往容易被忽視。隨著對(duì)PCP認(rèn)識(shí)的加深和檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，目前分子生物學(xué)技術(shù)已逐漸應(yīng)用于PCP診斷，但在我國(guó)暫未廣泛用于診斷。相對(duì)于染色鏡檢，分子生物學(xué)檢測(cè)方法具有更高的敏感度和特異度，但操作相對(duì)復(fù)雜。肺孢子菌體外培養(yǎng)困難，目前無(wú)常規(guī)培養(yǎng)基進(jìn)行Pj體外培養(yǎng)成功的報(bào)道，僅有一個(gè)研究發(fā)現(xiàn)在氣體與液體培養(yǎng)基交界面借助CuFi-8呼吸道上皮細(xì)胞可進(jìn)行Pj培養(yǎng)[5]，但此培養(yǎng)條件要求高，難以在臨床開(kāi)展。本文將對(duì)目前國(guó)內(nèi)外PCP的診斷方法進(jìn)行綜述，為臨床恰當(dāng)使用、評(píng)價(jià)相關(guān)診斷技術(shù)與模式提供參考。

1 臨床診斷

HIV患者中PCP癥狀的典型三聯(lián)征包括：亞急性發(fā)作的勞累性呼吸困難、干咳以及發(fā)熱。部分患者還伴有胸悶、消瘦、納差等表現(xiàn)。其亞急性病程通?？膳c細(xì)菌性肺炎及其他疾病區(qū)分開(kāi)。與HIV-PCP相比較，非HIV感染者PCP的潛伏期更短，且病程進(jìn)展速度較快[4]。肺部聽(tīng)診以干性啰音為主，部分患者無(wú)啰音[6,7]。實(shí)驗(yàn)室檢查以低氧血癥為主，可伴有不同程度貧血。影像檢查對(duì)于PCP的臨床診斷極為重要。PCP患者在病程早期胸部X線片并無(wú)顯著變化。HIV-PCP患者胸部計(jì)算機(jī)斷層掃描(Computed Tomography，CT)特征包括磨玻璃影、月牙征、肺氣囊征以及混合型，其中以磨玻璃影最為常見(jiàn)。磨玻璃影可表現(xiàn)為彌漫分布型和斑片狀融合型，HIV感染者以彌漫分布型多見(jiàn)，非HIV感染者以斑片狀融合型多見(jiàn)[8]。因此，在臨床上發(fā)現(xiàn)患者有呼吸困難、發(fā)熱及干咳等癥狀，且胸部CT提示彌漫性病變存在時(shí)，首先需排除HIV-PCP可能。PCP的臨床診斷應(yīng)綜合患者免疫缺陷狀態(tài)、臨床表現(xiàn)以及典型的影像學(xué)表現(xiàn)來(lái)進(jìn)行分析。

2 病原診斷

2.1 染色鏡檢

肺孢子菌有包囊和滋養(yǎng)體兩種形態(tài)。包囊是重要的診斷形態(tài)，包囊呈圓形，內(nèi)含有囊內(nèi)小體(或稱(chēng)子孢子)。呼吸道標(biāo)本(痰、支氣管肺泡灌洗液或肺組織)檢出肺孢子菌是PCP診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。呼吸道標(biāo)本通過(guò)染色鏡檢發(fā)現(xiàn)特征性的包囊或滋養(yǎng)體為診斷依據(jù)，其中支氣管肺泡灌洗液染色鏡檢陽(yáng)性率最高[9]。常用的染色方法有六胺銀染色(Gomori’s methenamine sliver staining，GMS)、吉姆薩染色和Diff-Quik染色。吉姆薩染色法可使肺孢子菌包囊內(nèi)容物呈現(xiàn)紫紅色，但包囊壁無(wú)法染色，再通過(guò)六胺銀染色可使Pj包囊壁呈現(xiàn)棕褐色，兩種方法聯(lián)合可觀察到特征性的包囊結(jié)構(gòu)以確診[10]。有研究發(fā)現(xiàn)GMS的敏感性和特異性均為100%，目前使用最廣泛的染色方法是GMS[11]，但GMS使用的染色劑保存時(shí)間短，使用時(shí)需要臨時(shí)配置。國(guó)外目前以Diff-Quik染色應(yīng)用較多，是在Wright染色基礎(chǔ)上改良而來(lái)的一種快速染色法，一般在90秒即可完成染色，效果與其他染色相似。用熒光標(biāo)記的單克隆抗體對(duì)呼吸道標(biāo)本熒光染色后檢出率可達(dá)75%-95%，國(guó)外已經(jīng)廣泛用于臨床診斷，但需要精密昂貴的熒光顯微鏡。染色鏡檢雖然操作簡(jiǎn)便，但檢出率較低，且與檢驗(yàn)者經(jīng)驗(yàn)和主觀判斷密切相關(guān)。

2.2 分子生物學(xué)檢測(cè)

近年來(lái)聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerasechainreaction，PCR)技術(shù)逐漸應(yīng)用于PCP的診斷。應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)呼吸道標(biāo)本(痰、支氣管肺泡灌洗液、有創(chuàng)操作獲得的肺組織等)的Pj特異性核酸片段對(duì)于PCP診斷有重要意義。Pj PCR靶基因主要有：內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)、線粒體大亞基rRNA(MitochondriallargesubunitrRAN，mtLSUrRNA)、二氫葉酸還原酶、二氫葉酸合成酶、主要表面糖蛋白和熱休克蛋白70等基因[12-19]。目前一般使用多拷貝的mtLSUrRNA作為靶基因。

目前PCR技術(shù)檢測(cè)肺孢子菌的方法一般分為常規(guī)PCR、巢式PCR以及熒光定量PCR。常規(guī)PCR檢測(cè)是臨床上廣泛使用的方法。Fan等[20]發(fā)現(xiàn)PCR診斷的敏感性和特異性分別為98.3%和91.0%。Gupta等[21]用巢氏PCR對(duì)基因靶位ITS和mtLSUrRNA進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)以mtLSUrRNA作為靶位基因的巢氏PCR敏感性及特異性分別可達(dá)100%和98.7%，高于以MSG作為靶位的常規(guī)PCR。巢氏PCR擴(kuò)增檢測(cè)mtLSUrRNA或許可用于早期診斷肺孢子菌感染。近年來(lái)有研究者將實(shí)時(shí)熒光定量PCR與巢氏PCR和常規(guī)PCR比較，發(fā)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的敏感性和特異性更高[22-24]。

隨著基因測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，二代基因測(cè)序(Next-generation sequencing，NGS)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。PCR依賴(lài)已知核酸序列，特異性識(shí)別靶向基因位點(diǎn)，而NGS不依賴(lài)已知核酸序列和培養(yǎng)技術(shù)，可以直接檢測(cè)各種臨床樣本(血液、支氣管肺泡灌洗液、腦脊液等)中未知致病微生物的基因序列[25,26]。目前已被應(yīng)用于病毒、罕見(jiàn)細(xì)菌和真菌的快速鑒定。近年來(lái)，該方法已應(yīng)用于肺孢子菌檢測(cè)[27]。有研究表明NGS較傳統(tǒng)方法及PCR診斷PCP的敏感性更高[27,28,29]。該方法不僅可以用來(lái)明確肺孢子菌感染，但也用于多位點(diǎn)序列分類(lèi)Pj確定菌株利于PCP的流行病學(xué)調(diào)查[30]。但NGS檢測(cè)的價(jià)格昂貴、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)空間大，目前只在少數(shù)臨床中心開(kāi)展，大多數(shù)在第三方機(jī)構(gòu)進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。

3 血清學(xué)檢測(cè)

3.1 (1,3)-β-D-葡聚糖 ((1,3)-β-D-glucan, BG)

BG是一種多聚糖成分，存在多種真菌的細(xì)胞壁中，也存在于Pj細(xì)胞壁中，可作為PCP輔助診斷的一種血清標(biāo)志物。Salerno等[31]發(fā)現(xiàn)BG升高與HIV-PCP相關(guān)性好，若以300pg/mL為陽(yáng)性閾值，其敏感性為91%，特異性為92%。一項(xiàng)薈萃分析表明BG診斷PCP的敏感性為92%～98%，特異性為83%～86%，可考慮作為臨床診斷PCP的篩選指標(biāo)[32]。Damiani等[33]研究發(fā)現(xiàn)呼吸道標(biāo)本PCR檢測(cè)結(jié)果結(jié)合恰當(dāng)?shù)腂G閾值能區(qū)別Pj定植和PCP。由于其他真菌感染也可引起B(yǎng)G升高，當(dāng)其呈陽(yáng)性時(shí)，仍需結(jié)合其他方法如染色鏡檢法、PCR或NGS進(jìn)一步確診。

3.2 乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)

有研究發(fā)現(xiàn)血清LDH在PCP患者中有不同程度的升高[34,35]。多項(xiàng)研究認(rèn)為血清LDH升高有助于輔助診斷PCP[32,36,37]。Vogel等[38]在HIV感染和非HIV感染人群中進(jìn)行血清LDH敏感性和特異性的分析，結(jié)果表明在HIV-PCP患者中LDH的敏感性和特異性分別為100%、47%，非HIV-PCP感染患者中敏感性和特異性分別為63%、43%，提示在HIV感染人群中，陽(yáng)性結(jié)果支持PCP診斷，在非HIV感染患者中LDH價(jià)值不大。同時(shí)，LDH升高在其他肺部感染、腫瘤等疾病也可見(jiàn)[39]。血清LDH升高僅能作為PCP的一項(xiàng)輔助診斷手段。

綜上所述，PCP已逐漸成為免疫機(jī)能低下人群的常見(jiàn)機(jī)會(huì)性感染，給這一群體的生存質(zhì)量和生命帶來(lái)極大的威脅。在傳統(tǒng)的臨床診斷方法上，建立加入PCR和NGS為主的分子生物學(xué)診斷方法，將減少漏診及誤診，將對(duì)本病的早期診斷和治療以及預(yù)后產(chǎn)生積極的作用。