細(xì)胞與組織凍存技術(shù)在女性生殖功能保存中的應(yīng)用

王鳳偉，陳巖，覃舒婷

（廣西柳州市人民醫(yī)院，廣西 柳州）

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多癌癥實(shí)現(xiàn)早期診斷，逐漸呈現(xiàn)出年輕化趨勢。同時(shí)隨著早期診斷、手術(shù)、放化療等綜合措施的跟進(jìn)，癌癥的生存率和治愈率有顯著提高，很多癌癥，比如乳腺癌等，在化療、內(nèi)分泌治療過程中，會(huì)對女性生殖系統(tǒng)造成不可逆的損害，尤其乳腺癌患者如果對內(nèi)分泌藥物治療不敏感，還需要做卵巢去勢可能。利用胚胎、卵母細(xì)胞或卵巢組織的冷凍保存技術(shù)，可以保持這些癌癥患者的生殖潛能。本文就細(xì)胞與組織凍存技術(shù)在女性生殖功能保存中的應(yīng)用進(jìn)行分析。

胚胎冷凍保存是全世界體外受精臨床上公認(rèn)的常規(guī)程序，是女性癌癥患者未來獲得生殖成功的最佳選擇。然而，由于它需要精子來源，許多年輕的單身女性如不接受供精，則不能選擇胚胎冷凍保存生育功能。此外，由于倫理、宗教和社會(huì)原因，獲取胚胎和隨后儲(chǔ)存胚胎可能存在其他各種限制。在這些情況下，卵母細(xì)胞冷凍可能是更優(yōu)的一種選擇。美國生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)（ASRM）和美國臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO）已將卵母細(xì)胞冷凍保存作為“癌癥和其他需要治療的疾病對婦女未來生育能力構(gòu)成嚴(yán)重威脅的生育保護(hù)策略”[1]。然而，卵母細(xì)胞冷凍保存需要卵巢刺激，因此可能導(dǎo)致癌癥治療的延遲。

卵巢組織冷凍保存技術(shù)是保留生育功能另一重要方法，卵巢組織凍存不需要進(jìn)行卵巢刺激，因此可以不用延遲治療時(shí)間，尤其是對青春期前的女性也可適用。這種方法對卵巢組織（切片/碎片）進(jìn)行超低溫保存，可以儲(chǔ)存大量原始卵泡和初級(jí)卵泡，在合適的時(shí)間進(jìn)行凍存卵巢組織的再移植，以獲取生育功能。來自四個(gè)歐洲醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)顯示，這種卵巢自體移植術(shù)后妊娠率可達(dá)25%[2]。卵巢的自然可塑性有助于移植到不同的部位，在這些部位，卵巢可以重新血管化，并迅速恢復(fù)其正常生理。卵巢組織可以原位移植到骨盆或異位移植到皮下、腎及卵巢包膜或肌肉[3]。無論移植部位如何，卵巢移植都可能發(fā)生缺血和潛在的卵泡閉鎖，這對該技術(shù)的成功提出了挑戰(zhàn)。因此，在卵巢移植時(shí)，必須保證移植體與宿主組織之間有良好的細(xì)胞通訊。同時(shí)需注意的是，這種自體移植也可能存在再次引入癌細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)。雖然確切的風(fēng)險(xiǎn)還不清楚，但癌癥患者的尸檢顯示，不同癌癥類型轉(zhuǎn)移到卵巢的概率可達(dá)8.4%～55%[4]。目前研究顯示，白血病患者在進(jìn)行卵巢組織凍存自體移植后，再次引入惡性細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)率最高，因此，患有盆腔或血液學(xué)惡性腫瘤的婦女可能不是卵巢組織移植的合適人選。為了規(guī)避這種風(fēng)險(xiǎn)，異種移植和卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)可能成為另外的選擇。將凍融的卵巢組織移植到動(dòng)物宿主體內(nèi)，隨后收集成熟卵母細(xì)胞，可以提供相當(dāng)大的優(yōu)勢。通過這種技術(shù)，可以消除癌癥傳播和復(fù)發(fā)的可能性；有研究已經(jīng)可以從異種移植的卵巢組織中獲得M Ⅱ期卵母細(xì)胞[5]。如結(jié)合卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的應(yīng)用，似乎可為有需要的女性提供更多選擇。

卵母細(xì)胞體外成熟相較卵母細(xì)胞冷凍保存可能具有一些優(yōu)點(diǎn)，如不需要促排卵，同時(shí)消除了胚胎冷凍的宗教和/或其他倫理、法律和道德問題。未成熟卵母細(xì)胞可以從體內(nèi)或體外獲得，體內(nèi)獲得主要通過取卵技術(shù)，現(xiàn)多應(yīng)用于多囊卵巢綜合征患者，以降低卵巢過度刺激的發(fā)生率，目前應(yīng)用該方法已經(jīng)有許多健康分娩的報(bào)道[6]。從體外新鮮卵巢組織或凍存卵巢組織中獲得未成熟卵母細(xì)胞主要適用于腫瘤患者，優(yōu)點(diǎn)是可以防止癌細(xì)胞擴(kuò)散，且避免了自體移植將腫瘤細(xì)胞再次引入體內(nèi)的風(fēng)險(xiǎn)。2014 年，Prasath EB 等人首次通過對卵巢癌患者切除的卵巢中獲得未成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行IVM 后凍存，后經(jīng)體外受精胚胎移植獲得活產(chǎn)[7]。

目前關(guān)于卵巢組織及細(xì)胞的凍存方法主要有傳統(tǒng)的慢速冷凍和玻璃化凍存法。在傳統(tǒng)的緩慢冷凍中，組織或細(xì)胞以可編程的方式緩慢冷卻至約140 ℃，然后將組織放入196 ℃的液氮中用于儲(chǔ)存[8]，但是，對于大組織切片或整個(gè)器官來說，由于組織核心及表面的非均勻的冷卻速率，及細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，容易造成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷[9]，這種損傷可以通過提高表面體積比來減少，即需要盡可能小的樣本，但對于凍存卵巢組織來說，過小的卵巢組織切片不利于保存大量的卵泡。同時(shí)也不適用于整個(gè)卵巢的保存。凍存前應(yīng)用冷凍保護(hù)劑溶液能夠能夠穿透組織到足夠的深度，防止冰晶形成的傷害，但解凍后，必須及時(shí)去除冷凍保護(hù)劑，因?yàn)橐坏┙M織或器官處于生理溫度，這些冷凍保護(hù)劑就可能對組織產(chǎn)生毒害作用。玻璃化冷凍是一種避免冰晶形成的過程，將組織或細(xì)胞暴露于高濃度的冷凍保護(hù)劑中，然后在-210 ℃的溫度下迅速冷卻至液氮中[10]，能夠消除卵巢組織中形成冰晶的風(fēng)險(xiǎn)。玻璃化法與慢速冷凍法的不同之處在于冷凍保護(hù)劑的濃度（高）和冷卻速度（快）。在對卵巢組織進(jìn)行玻璃化冷凍和慢速冷凍，然后進(jìn)行組織培養(yǎng)以評(píng)估隨后的卵母細(xì)胞存活率的系統(tǒng)性比較中，兩種方法卵母細(xì)胞存活率相似，但玻璃化冷凍可提高顆粒細(xì)胞存活率和基質(zhì)完整性[11]。另一項(xiàng)研究提示，與慢速冷凍相比，對人囊胚的玻璃化冷凍有更高的復(fù)蘇率和妊娠率[12]。雖然最初的數(shù)據(jù)顯示卵巢組織玻璃化冷凍可能是更有利的方法，但在玻璃化冷凍取代慢速冷凍作為卵巢組織冷凍保存的標(biāo)準(zhǔn)方法之前，還需要進(jìn)行更多的研究，尤其是高濃度的冷凍保護(hù)劑誘導(dǎo)細(xì)胞毒性和滲透性損傷和玻璃化安全性的問題。

總之，細(xì)胞與組織凍存技術(shù)在保留女性生育功能中發(fā)揮重要的、甚至不可替代的作用，也幫助了內(nèi)分泌治療不敏感的部分乳腺癌患者，讓他們在選擇卵巢去勢治療的同時(shí)，生育功能的需要得到保障。