脊髓Pellino1 在瑞芬太尼誘導的大鼠痛覺過敏中的作用及機制 *

付寶軍 姜靜靜 黃玉瓊 林宗航 李 恒

（廣州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院 清遠市人民醫(yī)院麻醉科，清遠 511518）

瑞芬太尼作為一種強效的受體激動劑，由于其半衰期短，停藥后迅速恢復，因此，廣泛應用于全身麻醉病人術中鎮(zhèn)痛維持。然而，大量的臨床觀察發(fā)現(xiàn)，瑞芬太尼在發(fā)揮其強大鎮(zhèn)痛作用同時常常誘發(fā)痛覺過敏 (remifentanil-induced hyperalgesia, RIH)，表現(xiàn)為病人在瑞芬太尼給藥后對疼痛刺激超敏現(xiàn)象[1]，痛覺過敏是術中使用瑞芬太尼后面臨的十分棘手的問題，給術后疼痛管理帶來了更大的挑戰(zhàn)。迄今為止，痛覺過敏的具體機制尚未闡明[2]，現(xiàn)有的防治痛覺過敏藥物有其自身局限性。膠質細胞尤其小膠質細胞在痛覺過敏中作用已經(jīng)證實[3,4]，但是在痛覺過敏中，小膠質細胞活化調(diào)節(jié)機制仍不清楚；Peli 是一個新發(fā)現(xiàn)的E3 泛素連接酶家族，包括Peli1、Peli2 和Peli3[5]，Peli1 作為一種小膠質細胞特異性調(diào)節(jié)因子參與實驗性自身免疫性腦脊髓炎[6]、蛛網(wǎng)膜下腔出血[7]和西尼羅河病毒腦炎的病理生理過程[8]。更重要的是，Peli1 通過激活小膠質細胞參與坐骨神經(jīng)壓迫致痛覺過敏[9]以及嗎啡鎮(zhèn)痛耐受導致痛覺過敏[10]。然而Peli 是否通過激活小膠質細胞參與痛覺過敏尚不清楚。本研究通過觀察痛覺過敏大鼠脊髓Peli1 表達變化以及預先鞘內(nèi)注射特異Peli1shRNA 對痛覺過敏大鼠脊髓小膠質細胞活化以及痛行為學影響，首次探討Peli1 在痛覺過敏中作用及其可能機制, 為痛覺過敏發(fā)生機制提供新的理論依據(jù)，同時也為開發(fā)防治痛覺過敏藥物提供新的作用靶點。

方 法

1.主要試劑及儀器

注射用瑞芬太尼購自宜昌人福藥業(yè)有限責任；PCR 試劑盒購自武漢博士德生物科技有限公司；von Frey 細絲、熱痛刺激儀購自Stoelting 公司；兔抗大鼠Peli1 單克隆抗體、兔抗大鼠Iba1 單克隆抗體購自Abcam 公司；Trizol RNA 抽提試劑、BeyoR TTM cDNA 逆轉錄試劑盒、焦碳酸二乙酯購自上海碧云天生物技術有限公司南通分公司；PCR 引物購自天跟生化科技北京有限公司。

2. 實驗動物和分組

雄性SD 大鼠，體質量200～230 g，由廣州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。于12 h 光照-黑暗循環(huán)、安靜環(huán)境下單籠飼養(yǎng)，自由飲水攝食。室溫(22.0±0.5)℃，濕度55%±10%。所有實驗操作均符合清遠市人民醫(yī)院實驗中心動物倫理要求并按照實驗動物使用原則進行。36 只大鼠隨機分成6 組：生理鹽水對照組（S 組），瑞芬太尼組（R 組），生理鹽水+鞘內(nèi)注射scrambled shRNA組（S + shscr組），生理鹽水+鞘內(nèi)注射Peli1shRNA 組（S + shPeli1 組），瑞芬太尼+鞘內(nèi)注射scrambled shRNA 組（R + shscr組），瑞芬太尼+鞘內(nèi)注射Peli1shRNA 組（R + shPeli1 組），每組6 只。S 組：經(jīng)尾靜脈持續(xù)輸注生理鹽水2 h；R 組：經(jīng)尾靜脈持續(xù)輸注瑞芬太尼4 μg/(kg·min) 2 h；S + shscr 組：連續(xù)3 天鞘內(nèi)注射scrambled shRNA 10 μl 后經(jīng)尾靜脈持續(xù)輸注生理鹽水2 h；R + shscr 組：連續(xù)3 天鞘內(nèi)注射scrambled shRNA10 μl (1×109TU) 后經(jīng)尾靜脈持續(xù)輸注瑞芬太尼4 μg/(kg·min) 2 h；S + shPeli1 組：連續(xù)3 天鞘內(nèi)注射Peli1shRNA 5 μg/10 μl (2×108TU) 后經(jīng)尾靜脈持續(xù)輸注生理鹽水2 h；R + shPeli1 組：連續(xù)3 天鞘內(nèi)注射Peli1shRNA 5 μg/10 μl 后經(jīng)尾靜脈持續(xù)輸注瑞芬太尼4 μg/(kg·min) 2 h。

3. 方法

（1）shRNA 寡核苷酸鏈的設計合成：根據(jù)Peli1 miRNA 序列設計shRNA 1、2、3 和陰性對照 (scrambled shRNA)，每條核苷酸鏈的中間添加莖環(huán)結構TTCAAGAGA，正、反義鏈的5'端分別引入GATCC 和AATTC，分別與BamH I 和EcoR I 酶切后的粘性末端互補，經(jīng)Blast 比對與人類其他基因編碼序列無同源性，委托上海吉瑪制藥技術有限公司合成。

（2）Peli1 shRNA 慢病毒質粒構建：使用BamH I和EcoR I 對慢病毒質粒進行雙酶切，將shRNA 寡核苷酸鏈退火形成雙鏈DNA 并與雙酶切后的質粒連接，連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)DH5α 大腸桿菌，在氨芐青霉素瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，篩選陽性克隆后委托上海吉瑪制藥技術有限公司測序驗證。Peli1 (shRNA1: 5'-GGATTTATGCTGCAGGGTTTG-3'; shRNA2: 5'-GGTGGTTGAAT ATACTCATGA-3'; shRNA3: 5'GGTTCACAGAAGACTCCAAAC-3') 和含scrambled shRNA 慢病毒 (shscr: 5'-TTC TCCGAACGTGTCACGT-3')。

（3）建立瑞芬太尼痛覺過敏模型：參照文獻[11]大鼠七氟烷（新晨藥業(yè)，中國）吸入麻醉后，尾靜脈穿刺置入24 G 靜脈留置針，連接電子注射泵（廣西威力方舟科技有限公司，中國），根據(jù)分組持續(xù)泵注瑞芬太尼（宜昌人福藥業(yè)有限責任公司，中國）4 μg/(kg·min) 2 h，生理鹽水組以相同速率泵注等體積生理鹽水。術中大鼠面罩給氧，維持自主呼吸。

（4）鞘內(nèi)注射：S + shscr 組、S + shPeli1 組、R + shscr 組、R + shPeli1 組大鼠吸入七氟烷麻醉后，參照Mestre 等[12]描述的方法將大鼠俯臥，定位脊柱L4-L5間隙，備皮，消毒，以微量注射器從椎間隙垂直緩慢進針，尾巴突然出現(xiàn)顫動或甩動，標志成功穿入鞘內(nèi)，此時保持穿刺針位置不變并緩慢注入scrambled shRNA 或Peli1shRNA，其劑量參照文獻[9]。

（5）機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)測定：用von Frey 纖維絲按照updown 法推算MWT：將一有機玻璃箱 (22 cm×22 cm×22 cm) 置于金屬篩網(wǎng)上，大鼠在有機玻璃箱中適應15 min 后，采用IITC2390 系列電子von Frey 垂直刺激大鼠后肢足底中部，持續(xù)時間≤ 4 s，大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽性反應，每次刺激間隔10 s，重復5 次。

（6）熱縮足反射潛伏期 (thermal withdrawal latency, TWL) 測定：按文獻方法測定大鼠足底的TWL，即將大鼠置于底為光滑玻璃的有機玻璃格子內(nèi)，適應20 min 待大鼠安靜后，從開始照射至出現(xiàn)縮足逃避反射的時間，以此表示熱痛閾。單次光照射時間不超過30 s，同一部位刺激的間隔時間為5 min，連續(xù)測定3 次，取平均值。

（7）Western blotting：利用BCA 蛋白測試盒測出總蛋白。按照35 μg、15 μl 每孔上樣，10%聚丙烯凝膠電泳濃縮膠40 V，分離膠100 V 分離，切膠后將相應分子量條帶上目的蛋白和內(nèi)參照蛋白在300 mA 條件下轉到PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，再分別加入Peli1 抗體、Iba1 抗體、 GFAP抗體 (1:1000 )和β-actin 抗體 (1:1000) 中，4℃孵育過夜，次日取出條帶用TBST 洗膜3 次，每次5 min，二抗(1:5000) 室溫孵育2 h 后用TBST 洗膜（同前）、ECL 曝光，采用Quantity One Software 進行分析，以目的蛋白/β-actin 的灰度比值作為目的蛋白表達的相對強度。

（8）PCR (RT-qPCR)：檢測行為學后，斷頸處死大鼠，分離腰椎，獲取脊髓。提取總RNA，反轉錄后檢測Peli1mRNA 的表達。反應體系為25 μl 體系，包括2 μl cDNA 模板、上下游定量引物各0.5 μl、12.5 μl 反應緩沖液和9.5 μl 超純水。反應為：95℃預變1 min，然后以94℃變15 s、60℃退火延伸60 s的條件擴增35 個循環(huán)，RT-qPCR 儀 (Bio-Rad) 檢測并分析。引物序列如下：Peli1: TGCTAAGTGCTCTAGCCGAG/CCCCCAACAGTCAGCAAGAC; Iba1: ATGACCAAAGCA GG GAT/CTTCAAGTTTGGACGGCA G; GFAP: GGTGTCCAGGCTGGTTTCTC/CAAGCCAGACCTCACAGCG; β-actin: CCACACCCGCCACCAGTTCG/TACAGCCCGG GGAGCATCGT。

（9）ELISA：大鼠深麻醉后在冰上迅速取出L4-5脊髓節(jié)段，按每g 凈重組織與9 ml 預冷的生理鹽水稀釋比例。勻漿后于4℃, 4000 rpm 下離心15 min（離心半徑5 cm），提取上清液并在-80℃保存。按ELISA 試劑盒公司提供的方法檢測蛋白并繪制標準曲線，重復3 次計算出各組上清液TNF-α、IL-6和IL-1β 濃度。

4.統(tǒng)計學分析

使用SPSS 20.0 統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±SD)表示。MWT 和TWL 比較采用重復測量方差分析，兩兩比較采用Sidak 法；Western Blot、RT-PCR、ELISA 數(shù)據(jù)結果采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey 法；P < 0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1. 靜脈輸注瑞芬太尼誘導大鼠機械痛覺過敏和熱痛覺過敏

通過分別測量大鼠MWT 和TWL 評價機械痛敏和熱痛敏，各組基礎MWT 和TWL 差異無統(tǒng)計學意義；與S 組相比，R 組大鼠在給瑞芬太尼后6 h、1 天、3 天MWT 和TWL 明顯降低(P < 0.001)，表明痛覺過敏模型成功建立， MWT 和TWL 于第5天恢復至對照水平（見圖1）。

圖1 靜脈輸注瑞芬太尼誘導大鼠機械痛敏和熱痛敏 (n = 6, ±SD)(A) MWT 時程變化；(B) TWL 時程變化 ***P < 0.001, 與S 組相比Fig. 1 Intravenous infusion of remifentanil induc mechanical allodynia and heat hyperalgesia in rats (n = 6, ±SD)(A) The time course of MWT; (B) The time course of TWL. ***P < 0.001, compared with group S.

2. 靜脈輸注瑞芬太尼導致大鼠脊髓Peli1 蛋白及mRNA 表達增加

進一步探究靜脈輸注瑞芬太尼對大鼠脊髓Peli1表達水平的影響。對各組Peli1 蛋白印跡相對灰度值以及mRNA 相對表達進行單因素方差分析結果顯示，與S 組相比，瑞芬太尼輸注后6 h 大鼠脊髓Peli1 蛋白及mRNA 表達明顯上調(diào)(P < 0.001)，1 天上調(diào)最為明顯(P < 0.001)，5 天基本恢復至對照水平（見圖2）。

圖2 靜脈輸注瑞芬太尼增加大鼠脊髓Peli1 蛋白及mRNA 的表達(n = 3, ±SD)(A) 大鼠脊髓背角Peli1 蛋白表達及定量分析；(B) 大鼠脊髓背角Peli1mRNA 定量分析***P < 0.001, 與Baseline 相比Fig. 2 Remifentanil infusion increases the protein and mRNA expression of Peli1 in the spinal cord of rats (n = 3, ±SD)(A) The expression and quantitative analysis of Peli1 protein in the spinal dorsal horn; (B) Quantitative analysis of Peli1 mRNA in the spinal dorsal horn. ***P < 0.001, compared with Baseline.

3. 鞘內(nèi)注射Peli1shRNA 減輕瑞芬太尼誘導的機械痛覺過敏和熱痛覺過敏

為了進一步證實脊髓Peli1 在瑞芬太尼誘導的痛覺過敏中作用，于瑞芬太尼輸注前預先鞘內(nèi)注射scrambled shRNA 或Peli1shRNA 在基因水平阻斷Peli1 作用。鞘內(nèi)注射scrambled shRNA 或Peli1sh-RNA 不影響靜脈注射生理鹽水大鼠的基礎MWT 和TWL，而與R + shscr 組相比，R + shPeli1 組大鼠TWL和MWT在6 h、1天、3天明顯增加（P < 0.05，P < 0.001，見圖3）。

圖3 Peli1shRNA 處理減輕瑞芬太尼誘導的大鼠痛覺過敏(n = 6, ±SD)(A) MWT 時程變化；(B) TWL 時程變化 *P < 0.05, ***P < 0.001,與R + shscr 組相比Fig. 3 Pretreatment of Peli1shRNA attenuates hyperalgesia induced by remifentanil in rats (n = 6, ±SD)(A) The time course of MWT; (B) The time course of TWL. *P < 0.05, ***P < 0.001, compared with group R + shscr.

4. 鞘內(nèi)注射Peli1shRNA 抑制瑞芬太尼誘導的小膠質細胞標志物Iba1 蛋白表達

瑞芬太尼輸注后第1 天，采用Western blotting分別對S + shscr 組、S + shPeli1 組、R + shscr 組、R + shPeli1 組大鼠脊髓小膠質細胞標志物Iba1 和星型膠質細胞標志物GFAP 蛋白灰度(relative density, RD)進行單因素方差分析。結果顯示與S + shscr組比較，R + shscr 組大鼠脊髓Iba1 蛋白灰度增強(P < 0.001)，說明瑞芬太尼輸注激活大鼠脊髓小膠質細胞, 與R + shscr 組比較，R + shPeli1 組大鼠脊髓Iba1 蛋白灰度降低(P < 0.001)；各組大鼠脊髓GFAP 蛋白灰度差異無統(tǒng)計學意義（見圖4）。

5. 鞘內(nèi)注射Peli1shRNA 抑制瑞芬太尼誘導的小膠質細胞標志物Iba1 mRNA 表達上調(diào)

瑞芬太尼輸注后第1 天，采用RT-PCR 分別對S + shscr 組、S + shPeli1 組、R + shscr 組、R + shPeli1組大鼠脊髓小膠質細胞標志物Iba1 mRNA 和星型膠質細胞標志物GFAP mRNA 進行單因素方差分析結果顯示, 與S + shscr 組比較，R + shscr 組大鼠脊髓Iba1 mRNA 表達增強(P < 0.001)，說明瑞芬太尼輸注激活大鼠脊髓小膠質細胞。與R + shscr 組比較，R + shPeli1 組大鼠脊髓Iba1 mRNA 表達降低(P < 0.001)，提示Peli1shRNA 預處理能顯著抑制瑞芬太尼所致的Iba1 mRNA 表達增加。各組大鼠脊髓GFAP mRNA 表達差異無統(tǒng)計學意義（見圖5）。

圖5 Peli1shRNA 預處理抑制瑞芬太尼誘導的脊髓背角小膠質細胞標志物Iba1 mRNA 表達上調(diào)(n = 3, ±SD)(A) 大鼠脊髓背角Iba1 mRNA 定量分析；(B) 大鼠脊髓背角GFAP mRNA 定量分析***P < 0.001,與S + shscr 組相比；###P < 0.001,與R + shscr 組相比Fig. 5 Pretreatment of Peli1shRNA prevents the upregulation of microglia marker Iba1 mRNA induced by remifentanil in the spinal dorsal horn (n = 3, ±SD)(A) Quantitative analysis of Iba1 mRNA in the spinal dorsal horn; (B) Quantitative analysis of GFAP mRNA in the spinal dorsal horn.***P < 0.001, compared with group S + shscr; ###P < 0.001, compared with group R + shscr.

6. 鞘內(nèi)注射Peli1shRNA 抑制瑞芬太尼誘導的TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達

瑞芬太尼輸注后第1 天，對S + shscr 組、S + shPeli1組、R + shscr 組、R + shPeli1 組大鼠脊髓TNF-α、IL-6 和IL-1β 的表達進行單因素方差分析。結果顯示與S + shscr 組相比，R + shscr 組大鼠脊髓TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達增加，差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.001)，說明瑞芬太尼輸注誘導炎性細胞因子表達。與R + shscr 組相比，R + shPeli1 組大鼠脊髓TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達明顯降低（P < 0.001，見圖6）。

圖6 Peli1shRNA 預處理抑制瑞芬太尼誘導脊髓背角TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達(n = 3, ±SD)(A) 大鼠脊髓背角TNF-α 表達定量分析；(B) 大鼠脊髓背角IL-6 表達定量分析；(C) 大鼠脊髓背角IL-1β 表達定量分析***P < 0.001, 與S + shscr 組相比；#P < 0.05, ##P < 0.01,與R + shscr 組相比Fig. 6 Pretreatment of Peli1shRNA prevents the expression of TNF-α, IL-6 and IL-1β induced by remifentanil in the spinal dorsal horn (n = 3, ±SD)(A) Quantitative analysis of TNF-α expression in the spinal dorsal horn; (B) Quantitative analysis of IL-6 expression in the spinal dorsal horn; (C) Quantitative analysis of IL-1β expression in the spinal dorsal horn.***P < 0.001, compared with group S + shscr; #P < 0.05, ##P < 0.01, compared with group R + shscr.

討 論

瑞芬太尼作為一種人工合成強效μ 阿片受體激動劑，因其起效快，作用時間短，長期輸注無蓄積等優(yōu)點而被廣泛應用于臨床全身麻醉鎮(zhèn)痛維持。但是近年來發(fā)現(xiàn)瑞芬太尼較其他阿片類藥物更易誘發(fā)痛覺過敏[13,14]，表現(xiàn)為痛閾下降、痛覺異常敏感甚至出現(xiàn)觸誘發(fā)痛[15]。本實驗進一步顯示瑞芬太尼輸注可以誘導大鼠脊髓Peli1 表達增加，而且預先鞘內(nèi)注射Peli1shRNA 不僅可以明顯抑制小膠質細胞的激活，且能夠緩解瑞芬太尼誘導的機械敏痛和熱痛覺敏感。提示Peli1 介導小膠質細胞活化可能參與瑞芬太尼誘發(fā)痛覺過敏。

1.脊髓小膠質細胞活化介導瑞芬太尼誘導痛覺過敏

瑞芬太尼誘發(fā)痛覺過敏分子生物學機制復雜，目前已知瑞芬太尼可以通過μ 阿片受體的變異、長時 程 增 強 (long-term potentiation, LTP)、NMDA 受體的激活和脊髓膠質細胞的活化等介導痛覺過敏，且可能涉及離子通道、信號通路、細胞因子等多方面[16]。然而脊髓小膠質細胞的活化介導瑞芬太尼痛覺過敏機制研究一直備受關注，研究證實在瑞芬太尼誘發(fā)痛覺過敏大鼠模型中，脊髓活性氧 (reactive oxygen species, ROS) 通過激活小膠質細胞和N-甲基-D-天冬氨酸 (N-methyl-D-aspartate, NMDA) 受體活化介導瑞芬太尼誘導的痛覺過敏[4]。另外，研究發(fā)現(xiàn)預先鞘內(nèi)注射CCL2 中和抗體可明顯抑制痛敏大鼠脊髓小膠質細胞的激活，提示CCL2 通過激活小膠質細胞介導瑞芬太尼痛覺過敏的過程，且在痛覺過敏中CCL2 可能是神經(jīng)元和小膠質細胞相互作用的媒介[5]。與上述結果相一致，本研究結果表明，瑞芬太尼持續(xù)輸注后1 天大鼠脊髓小膠質細胞活化標志物Iba1 蛋白及mRNA 表達明顯上調(diào)，且此時大鼠痛敏行為學表現(xiàn)也最為明顯，以上提示，小膠質細胞激活在瑞芬太尼誘導痛覺過敏機制中發(fā)揮重要作用，但對瑞芬太尼導致痛覺過敏中小膠質細胞激活調(diào)節(jié)機制仍不清楚。

2.脊髓Peli1 激活小膠質細胞在瑞芬太尼誘導痛覺過敏中作用

Peli 分子形成了一個保守的E3 泛素連接酶家族[17]。在不同的Peli 中，Peli1 尤其令人感興趣，因為與其他家族成員相比，Peli1 在LPS 刺激下在小膠質細胞中大量表達[18]。最近的研究表明，脊髓Peli1 在神經(jīng)損傷和嗎啡鎮(zhèn)痛耐受導致痛覺過敏中發(fā)揮了重要作用[9,10]。本研究結果顯示，靜脈輸注瑞芬太尼導致大鼠脊髓Peli1 蛋白及mRNA 表達6 h上調(diào)，1 天最為明顯，且變化趨勢與大鼠痛覺行為學時程變化相吻合，提示Peli1 可能參與瑞芬太尼誘導痛覺過敏，為了進一步驗證Peli1 在瑞芬太尼誘導痛覺過敏中的作用，采用RNA 干擾技術探討Peli1shRNA 對痛覺行為學影響，實驗發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射Peli1shRNA 明顯抑制Peli1 蛋白及mRNA 表達，證實RNA 干擾技術對Peli1 抑制有效性，另外，預先靶向抑制Peli1 明顯抑制瑞芬太尼導致的痛覺過敏；進一步提示脊髓Peli1 在瑞芬太尼誘發(fā)的痛覺過敏中發(fā)揮必要作用。為了進一步探討脊髓Peli1 介導痛覺過敏機制，本研究觀察鞘內(nèi)注射Peli1shRNA對星形膠質細胞和小膠質細胞特異性標志表達的影響，結果研究發(fā)現(xiàn)預先鞘內(nèi)注射Peli1shRNA 可明顯抑制痛敏大鼠脊髓小膠質細胞活化標志物Iba1 表達，但星形膠質細胞活化標志物GFAP 表達未受影響，提示Peli1 可能通過激活小膠質細胞介導瑞芬太尼痛覺過敏的過程。一般認為，膠質細胞介導神經(jīng)炎癥在疼痛中樞敏化中發(fā)揮作用[19,20]，活化膠質細胞釋放促炎細胞因子，如TNF-α、IL-6 和IL-1β，其與感覺神經(jīng)元表面受體結合，增強神經(jīng)元興奮性，誘發(fā)痛覺過敏[21,22]，因此，我們推測痛覺過敏形成過程中，Peli1 介導小膠質細胞激活，活化小膠質細胞合成和釋放炎性因子，進而敏化脊髓神經(jīng)元。本研究表明，瑞芬太尼持續(xù)輸注誘發(fā)大鼠痛覺過敏同時伴有脊髓TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達增加，而預先鞘內(nèi)注射Peli1shRNA 可明顯抑制痛覺過敏大鼠脊髓TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達。然而，在瑞芬太尼誘發(fā)痛覺過敏中Peli1 可能的細胞定位即Peli1 原發(fā)生成部位還有待實驗進一步證實。

3.脊髓小膠質細胞Peli1 參與瑞芬太尼誘導痛覺過敏可能的信號通路

最近的研究顯示，在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受模型中，脊髓Peli1 通過激活小膠質細胞促進其產(chǎn)生和釋放促炎因子如腫瘤壞死因子 (TNF-α)[10]，而后者已被證實在瑞芬太尼引起痛敏中發(fā)揮著重要作用[23]；此外，脊髓Peli1通過絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK) 通路參與嗎啡鎮(zhèn)痛耐受相關痛覺過敏[10,24]并且脊髓背角p38MAPK 激活有助于瑞芬太尼誘導大鼠術后痛敏；在腫瘤壞死因子存在的情況下，si Peli1轉染細胞NF-κB RELA轉錄活性降低[25]。因此，我們推測脊髓Peli1 可能通過激活p38MAPK和NF-κB 信號通路誘發(fā)促炎因子參與瑞芬太尼誘發(fā)痛覺過敏。另外，研究表明，在LPS 刺激小膠質細胞中，miR590-5p 過表達靶向抑制Peli1 基因表達[26]，那么在脊髓水平，miR590-5p 是否靶向調(diào)控Peli1 蛋白參與瑞芬太尼誘發(fā)痛覺過敏，還有待后續(xù)實驗進一步證實。

綜上所述，本研究結果表明脊髓Peli1 通過激活小膠質細胞介導瑞芬太尼誘導的痛覺過敏，本研究的結果為痛覺過敏的發(fā)生機制提供了新的理論依據(jù)，同時也為開發(fā)防治痛覺過敏藥物提供了新的作用靶點。