仔豬口服牛蒡子提取物牛蒡苷元的藥動學(xué)研究

乜 春，陳夏冰，吳利軍，楊文海，邵志勇，周 華，陳 潔，金爾光，童偉文，何 斌*

(1.青海省貴德縣畜牧獸醫(yī)工作站，海南藏族自治州811700；2.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，武漢430208）

牛蒡子(Fructus Arctii)是一種常用中藥，在獸醫(yī)臨床上主要發(fā)揮疏散風(fēng)熱、宣肺透疹等多種功效，用于畜禽風(fēng)熱、咳嗽與氣喘等癥狀的治療[1]。其有效成分主要為牛蒡苷和牛蒡苷元等木質(zhì)素物質(zhì)[2]，研究表明牛蒡子發(fā)揮直接藥理作用為牛蒡苷元，主要通過牛蒡苷在消化道內(nèi)轉(zhuǎn)化而來[3-5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其的直接有效成分牛蒡苷元具有抗炎、抗病毒、抗菌與抗腫瘤[6-11]作用，同時牛蒡苷元還具有保護肝臟以及防治糖尿病[12-14]等多種藥理學(xué)作用，因此具有非常好的臨床開發(fā)與應(yīng)用的前景；本研究將牛蒡子粉經(jīng)過水提取后的提取成分采用灌胃給藥的方式給仔豬灌胃給藥，不同時間點采集血樣研究提取物在仔豬體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)特征，為獸醫(yī)臨床用藥提指導(dǎo)。

1 試驗材料

1.1 試驗藥品

牛蒡苷元標準品由上海喬羽生物科技有限公司提供，生產(chǎn)批號：20180709，牛蒡苷元含量≥99.0%； 取100 mg 標準品置于100mL 容量瓶中，甲醇準確定容制備標準工作液。牛蒡子購于廣西中藥材大市場經(jīng)100 目粉碎而得實驗用牛蒡子粉。牛蒡子粉和牛蒡苷元在仔豬體內(nèi)的給藥計量根據(jù)《華人民共和國獸藥典》推薦計量使用。

1.2 試驗儀器

AgiLent 公司生產(chǎn)的1200 型高效液相色譜儀，D3024R 型高低溫速冷凍離心機，N-EVAPTM111 型氮吹儀。

1.3 動物

長大仔豬6 頭，雌雄各半，體重為30.0±5.0 kg，按照1-6 號進行編號；購于武漢市某生豬養(yǎng)殖場。購回后豬群自由飲水和采食在試驗動物房觀察10 d，試驗開始給藥前12 h 豬群禁食，全價飼料日糧不含有任何添加的藥物。

2 方法

2.1 色譜條件

檢測用色譜柱為250 mm×4.6 mm，5 μm 的SB-C18柱；檢測波長為280 nm；流動相為水：乙腈的體積比35:65；流速為1.0 mL/min；進樣量為20 μL；檢測柱溫箱溫度為（30±0.1）℃[15]。

2.2 血漿樣品處理方法

首先吸取0.5mL 室溫下自然解凍的血漿樣品于5.0mL 離心管中，隨后加入2.0 mL 的CH2Cl2充分渦旋振蕩，8000 r/min 冷凍離心15.0 min 后收集CH2Cl2層，再用CH2Cl2提取血漿樣品1 次，合并2 次收集的CH2Cl2，用40 ℃氮氣水浴吹干，殘渣用200 μL 的流動相溶解，采用0.22μm 濾膜過濾后以20 μL 進樣分析[15]。

2.3 標準曲線的建立

分別向7 支5.0 mL 聚丙烯離心管中各加入500 μL 室溫下自然解凍的空白血漿樣品，然后再依次加入高濃度、少量的標準工作液，得到為0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL 含 牛 蒡 苷元的血漿樣品，按照事先建立的樣品處理方法處理后進行高效液相色譜儀檢測分析，記錄牛蒡苷元的色譜圖和峰面積。以峰面積(x)為橫坐標，濃度(y)為縱坐標，建立血漿樣品標準工作曲線和方程。

2.4 方法學(xué)驗證

分別吸取在實驗室室溫下自然解凍的空白血漿500μL 置于5.0mL 聚丙烯離心管中，然后按照低、中、高三個濃度依次加入標準工作液，使其配制成分別為0.1、1.0、5.0μg/mL 的含牛蒡苷元低、中、高三個不同濃度的血漿樣品，按照本文中2.2 的方法流程進行處理后上機檢測分析?？疾烊諆?nèi)變異系數(shù)時每個濃度在同一天內(nèi)設(shè)置5個平行進行檢測，測定日間變異系數(shù)時每個濃度連續(xù)重復(fù)檢測5d。計算本研究所建立的血漿樣品處理和高效液相色譜儀檢測方法的回收率、準確度、精密度以及靈敏度。

2.5 藥物動力學(xué)試驗設(shè)計

長大仔豬6 頭給牛蒡子水提取前稱重、采集空白血漿并禁食10.0 h 以上，試驗全程仔豬自由飲水。每頭仔豬分別以1.0 mg/kg.bw 的劑量灌胃給藥后，于10、20、30、45、60、90、120、180、240、300、360、480、720、1440、2880 min 采集血樣3.0 mL左右； 所采集血液樣品分別放置于肝素鈉離心管中，5000 r/min 條件下離心15.0 min，取上層血漿于-20 ℃保存[16]。

3 實驗結(jié)果

3.1 牛蒡苷元在血漿中的色譜行為

高相液相色譜檢測時牛蒡苷元樣品的時出峰間為13.8 min，檢測基線平穩(wěn)，色譜峰對稱性較好。仔豬空白血漿樣品色譜圖如圖1，牛蒡苷元1.0 μg/mL 加入空白血漿色譜圖如圖2，仔豬血漿樣品中牛蒡苷元0.55 μg/mL 色譜圖如圖3。

圖1 仔豬空白血漿色譜圖

圖2 仔豬空白血漿添加牛蒡苷元1.0 μg/mL 色譜圖

圖3 試驗給藥后仔豬血漿中牛蒡苷元0.55 μg/mL 色譜圖

3.2 標準工作曲線

牛蒡苷元標準品在0.05～10.0 μg/mL 濃度范圍相關(guān)性較好（r=0.9998），線性回歸方程為y=0.0265x-0.0328。牛蒡苷元添加到仔豬血漿中的標準工作曲線如圖4。

圖4 牛蒡苷元在仔豬血漿中的標準工作曲線

3.3 方法學(xué)驗證結(jié)果

本研究建立的檢測方法的檢測限為0.025 μg/mL，定量限為0.05 μg/mL。該方法回收率大于83.35%，日內(nèi)變異系數(shù)均在3.51%以內(nèi)，日間變異系數(shù)均在5.90%以內(nèi)；仔豬空白血漿中添加牛蒡苷元的回收率表1，變異系數(shù)如表2。

表1 豬空白血漿中添加ACT 的回收率和日內(nèi)變異系數(shù)考察結(jié)果(n=5)

表2 豬空白血漿中添加ACT 的回收率和日間變異系數(shù)考察結(jié)果(n=5)

3.4 藥物動力學(xué)試驗數(shù)據(jù)

牛蒡子水提物在仔豬體內(nèi)的血藥濃度如表3，主要藥物動力學(xué)參數(shù)如表4，血藥濃度- 時間曲如圖5。

表3 單劑量口灌牛蒡子水提物(1.0g/kg.bw)后牛蒡苷元在豬體內(nèi)的血藥濃度(μg/mL)

表4 單劑量口灌牛蒡子水提物(1.0 g/kg.bw)后在豬體內(nèi)的主要藥物動力學(xué)參數(shù)(n=8)

圖5 口灌給藥后牛蒡苷元在豬體內(nèi)的藥物濃度- 時間曲線

口灌給藥后牛蒡苷元在仔豬體內(nèi)的血藥濃度- 時間數(shù)據(jù)符合有吸收二室模型，藥時曲線出現(xiàn)雙峰，達峰時間（tmax）為0.251±0.011 h，峰濃度（cmax）為0.560±0.063 μg/mL，吸收半衰期（t1/2ka）為0.098±0.006 h，分布半衰期（t1/2α）0.208±0.009 h；消除半衰期（t1/2β）23.816±2.151 h；表觀分布容積（Vd）32.212±4.033 L/kg，表明牛蒡子水提物在仔豬體內(nèi)吸收較快，在組織中分布非常廣泛，代謝消除極為緩慢。

4 討論

牛蒡子是一種常用中藥，在中醫(yī)以及獸醫(yī)臨床上發(fā)揮眾多的藥理學(xué)作用和臨床功效，其應(yīng)用和研發(fā)前景良好。，本研究發(fā)現(xiàn)牛蒡子水提物灌胃給藥后其直接有效成分牛蒡苷元吸收快，達峰時間短；消除半衰期t1/2β（23.816±2.151 h）較長，表觀分布容積Vd（32.212±4.033 L/kg）較大，峰濃度cmax（0.560±0.063 μg/mL）相對較低，表明牛蒡苷元可在仔豬體內(nèi)較長時間發(fā)揮作用。這與Li[17]報道的牛蒡苷元在大鼠和比格犬中表現(xiàn)出強吸收能力，在大鼠的組織分布迅速、廣泛，2.5 小時達到峰值和寬度（在幾乎所有組織和器官中均可檢測到），腸道中的AG 濃度最高，其次是心臟，肝臟，胰腺和腎臟。這與牛蒡子粉口灌后在仔豬體內(nèi)的吸收迅速、分布廣泛的研究結(jié)果相似。通過比較靜脈注射牛蒡苷元和灌胃牛蒡子粉藥物動力學(xué)參數(shù)發(fā)現(xiàn)，兩者在主要藥動學(xué)參數(shù)消除半衰期（t1/2β）、表觀分布容積（Vd）、藥時曲線下面積（AUC）等方面均差異極顯著（p＜0.01）。表明胃腸道系統(tǒng)對牛蒡苷元的吸收、分布、代謝及排泄的影響較大。

口灌牛蒡子水提物牛蒡苷元第一次達峰時間（Tmax）為0.5 h左右，峰濃度（Cmax）為0.796 ±0.022 μg/mL，第二次達峰在4.0 h 左右，峰濃度（Cmax）為0.540±0.018 μg/mL；這與Cai[18]研究報道的Wistar 大鼠口服不同劑量的牛蒡苷元及其纈氨酸酯衍生物后，牛蒡苷元血藥濃度- 時間曲線符合一室模型特征，口服吸收為非線性動力學(xué)過程，可能存在飽和過程；有一定差異，這可能是動物種屬差異所致。Gao[19]報道牛蒡苷元在肝臟、腸道和血漿中存在廣泛的葡萄糖醛酸水解作用，可能與藥物的雙吸收峰有關(guān)，雙吸收峰的存在，進一步證明了其在體內(nèi)停留的時間較長。Ikeda[20]報道牛蒡苷元在人體內(nèi)藥物動力學(xué)為非線性模型，觀察到牛蒡苷和牛蒡苷元吸收存在第二個峰，提示有肝內(nèi)循環(huán)。Gao[21]研究表明，葡萄糖醛酸化是牛蒡苷元的主要腸道和肝臟代謝途徑，在膽汁中排泄的牛蒡苷元的葡糖苷酸可以進一步水解回母體化合物，這表明其潛在的腸肝循環(huán)。這些研究報道與牛蒡子水提物給藥后牛蒡苷元在仔豬體內(nèi)存在雙吸收峰相同，為牛蒡苷元在仔豬體內(nèi)肝腸循環(huán)提供了進一步的支撐。

Zeng[22]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠的P- 糖蛋白功能損害，牛蒡子苷元為P- 糖蛋白底物，導(dǎo)致糖尿病大鼠口服牛蒡苷元的Cmax和AUC0-10h值相比正常大鼠，分別增長356.8%和223.4%；但靜脈注射后，牛蒡苷元在正常和糖尿病大鼠之間Cmax和AUC0-10h值沒有顯著差異。在本研究試驗前和試驗過程中觀察到仔豬的生理狀態(tài)均未受到影響，不同性別的仔豬在血藥濃度和藥動學(xué)參數(shù)上沒有明顯差別，結(jié)合Zeng 的研究報道，可以推測牛蒡苷元在仔豬病理狀態(tài)下口服后的藥物學(xué)參數(shù)與健康狀態(tài)下的藥動學(xué)參數(shù)差異不會太大，但實際情況需要進一步研究證實。

5 結(jié)論

研究結(jié)果表明：口服牛蒡子粉水提物后，牛蒡子苷元在仔豬體內(nèi)為有吸收二室模型，吸收快、分布廣、消除慢，可能存在肝腸循環(huán)，可長時間發(fā)揮藥物作用，建議臨床上使用時控制用藥劑量和次數(shù)，防止藥物在機體內(nèi)蓄積產(chǎn)生的副作用。