雙香豆素通過(guò)抑制PDK1活性增加人膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺敏感性的研究

周 磊，熊 壯，馬 躍，董敬蓉，丁文斌

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130021)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)原發(fā)性腫瘤。由于惡性膠質(zhì)瘤患者多為青壯年，且缺乏有效的綜合治療措施，因此預(yù)后很差。替莫唑胺作為基礎(chǔ)化療藥物廣泛應(yīng)用于惡性膠質(zhì)瘤臨床治療中[1]。替莫唑胺是一種新型烷化劑，通過(guò)細(xì)胞毒作用發(fā)揮抗腫瘤效果，較傳統(tǒng)細(xì)胞毒藥物不良反應(yīng)小，患者耐受性好。限制替莫唑胺治療效果的主要原因在于細(xì)胞毒藥物的劑量限制性毒性，因此如何增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性一直是抗腫瘤化療研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

惡性腫瘤細(xì)胞特征性的代謝模式為有氧糖酵解，也稱為Warburg效應(yīng)，而逆轉(zhuǎn)Warburg效應(yīng)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞代謝重編程，是重要的抗腫瘤治療靶點(diǎn)之一。丙酮酸脫氫酶激酶1(PDK1)可通過(guò)磷酸化負(fù)調(diào)節(jié)丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(PDC)活性，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞能量代謝[2]。很多研究發(fā)現(xiàn)，PDK1在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞的侵襲、耐藥、惡性進(jìn)展中密切相關(guān)。雙香豆素作為臨床用藥，具有抗凝、抗腫瘤和抗菌的多重藥效學(xué)作用。且已有研究表明，雙香豆素具有抑制PDK1活性的作用[3]。因此，本研究以人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞為模型，探討雙香豆素是否通過(guò)抑制PDK1活性進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞代謝模式，以提高U87細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG細(xì)胞來(lái)自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系實(shí)驗(yàn)室。U87MG細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)條件培養(yǎng)于含有10%FBS(Hyclone，美國(guó))的DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱。

1.2 細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)(Cell Viability Assays)

U87MG細(xì)胞接種于96孔板中，8 000細(xì)胞/孔。不同濃度替莫唑胺作用24 h后，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)孵育4 h后，棄去培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO，室溫振蕩 10 min，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(波長(zhǎng) 490 nm)測(cè)定各孔 A值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3 免疫印跡

冷RIPA裂解液裂解細(xì)胞。全細(xì)胞裂解液使用Bio-Rad蛋白試劑測(cè)定蛋白濃度。每樣本取約50 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，濕轉(zhuǎn)法到PVDF膜上，封閉后按照1∶1 000加入特異性一抗，4℃孵育過(guò)夜，洗脫后加入HRP標(biāo)記的二抗，ECL發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。

1.4 葡萄糖攝取和乳酸生成檢測(cè)

細(xì)胞加藥處理后，PBS清洗后，加入新鮮培養(yǎng)液。收集培養(yǎng)液，分別用葡萄糖和乳酸檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)檢測(cè)培養(yǎng)液中葡萄糖和乳酸濃度，用細(xì)胞總蛋白定量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。使用one-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，分析軟件為SPSS 12.0，P<0.01有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雙香豆素與替莫唑胺對(duì)U87MG細(xì)胞存活率的影響

根據(jù)文獻(xiàn)及本研究組的前期工作，采用雙香豆素濃度為25 μmol/L，分別聯(lián)合替莫唑胺濃度為100 μmol/L、200 μmol/L和400 μmol/L作用于U87MG細(xì)胞24 h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，雙香豆素與替莫唑胺聯(lián)合作用對(duì)U87MG細(xì)胞存活率抑制明顯高于單獨(dú)替莫唑胺作用組，特別是替莫唑胺濃度為200 μmol/L時(shí)，與雙香豆素合加具有明顯的協(xié)同作用(圖1，P<0.01)。所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用替莫唑胺濃度為200 μmol/L，雙香豆素濃度為25 μmol/L。

*P<0.01圖1 雙香豆素與替莫唑胺對(duì)U87MG細(xì)胞存活率的影響

2.2 雙香豆素與替莫唑胺對(duì)U87MG細(xì)胞PDK1活性的影響

PDK1是葡萄糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶，在糖酵解中發(fā)揮重要作用。PDK1通過(guò)磷酸化PDH的ser232位點(diǎn)，降低PDH活性，因而抑制丙酮酸的脫羧氧化生成乙酰輔酶A進(jìn)入線粒體的過(guò)程，促進(jìn)Warburg效應(yīng)和腫瘤的生長(zhǎng)。免疫印跡法檢測(cè)PDK1靶蛋白PDH及磷酸化PDH的ser232位點(diǎn)(p-PDHE1A)的表達(dá)變化，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，TMZ組p-PDHE1A無(wú)明顯變化，但DIC組和TMZ+DIC組p-PDHE1A表達(dá)明顯降低(圖2)。

圖2 雙香豆素與替莫唑胺對(duì)U87MG細(xì)胞PDK1活性的影響

2.3 雙香豆素與替莫唑胺對(duì)U87MG細(xì)胞葡萄糖攝取的影響

為進(jìn)一步探討雙香豆素影響U87MG細(xì)胞對(duì)替莫唑胺敏感性的機(jī)制，我們檢測(cè)了葡糖糖代謝相關(guān)指標(biāo)葡萄糖攝取和乳酸生產(chǎn)量。葡萄糖攝取結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TMZ組葡萄糖攝取增高，而DIC組葡萄糖攝取降低，特別是TMZ+DIC組與TMZ組相比，葡萄糖攝取明顯降低(圖3，P<0.01)。

*P<0.01圖3 雙香豆素與替莫唑胺對(duì)U87MG細(xì)胞葡萄糖攝取的影響

2.4 雙香豆素與替莫唑胺對(duì)U87MG細(xì)胞乳酸生成的影響

乳酸生成結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TMZ組乳酸生成增高，而DIC組乳酸生成降低，特別是TMZ+DIC組與TMZ組相比，乳酸生成明顯降低(圖4，P<0.01)。

*P<0.01圖4 雙香豆素與替莫唑胺對(duì)U87MG細(xì)胞乳酸生成的影響

3 討論

惡性膠質(zhì)瘤預(yù)后不佳，特別是化療抵抗是其難以治愈的根本原因之一。惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞可通過(guò)致癌信號(hào)的激活及不同代謝機(jī)制異常導(dǎo)致其對(duì)化療治療敏感性降低[4]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤能量代謝依賴于Warburg效應(yīng)，即有氧糖酵解。PDK1可通過(guò)磷酸化負(fù)向調(diào)節(jié)丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(PDC)，導(dǎo)致PDC失活促進(jìn)Warburg效應(yīng)。最新研究證實(shí)，PDK1表達(dá)與活性受癌基因調(diào)節(jié)，在多種癌癥中過(guò)表達(dá)，并在癌細(xì)胞代謝中發(fā)揮重要作用。

PDK1在腫瘤組織中的高表達(dá)與腫瘤中異常糖酵解密切相關(guān)，因此，抑制PDK1可作為抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)。關(guān)于PDKs抑制劑的研究較多，但因具有抗癌療效時(shí)劑量過(guò)大或者選擇性抑制較差等造成毒副作用較大等問(wèn)題，限制其在臨床上的應(yīng)用[5]。Zhou等利用Discovery Studio 3.5軟件的Libdock模塊虛擬篩選并分析了雙香豆素與PDK1的可能結(jié)合位點(diǎn)，并在一系列細(xì)胞內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了雙香豆素抑制PDK1活性的效果[6]。此外，Zhang和Xu等在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證了雙香豆素可通過(guò)抑制PDK1活性進(jìn)而達(dá)到抗卵巢癌作用和增加肝癌細(xì)胞化療敏感性的作用[3,7]。

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中PDK1高表達(dá)，且其磷酸化水平與患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)。因此，本研究以人膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞為模型，探討雙香豆素是否可以提高U87MG細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性?；谖墨I(xiàn)報(bào)道與本研究組的前期工作，我們選用雙香豆素濃度為25 μmol/L，經(jīng)免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)該濃度對(duì)U87MG細(xì)胞中PDK1的活性具有很好的抑制效果。而雙香豆素與替莫唑胺聯(lián)合作用可明顯增加U87MG細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性。為進(jìn)一步探討雙香豆素如何發(fā)揮化療增敏作用，我們利用免疫印跡法檢測(cè)PDK1靶蛋白PDH及磷酸化PDH的ser232位點(diǎn)(p-PDHE1A)的表達(dá)變化，表明雙香豆素單獨(dú)或與替莫唑胺聯(lián)合作用于U87MG細(xì)胞均可有效抑制PDK1活性，而替莫唑胺單獨(dú)作用無(wú)明顯效果。PDK1是葡萄糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶，在糖酵解中發(fā)揮重要作用。PDK1通過(guò)磷酸化PDH的ser232位點(diǎn)，降低PDH活性，因而抑制丙酮酸的脫羧氧化生成乙酰輔酶A進(jìn)入線粒體的過(guò)程，促進(jìn)Warburg效應(yīng)和腫瘤的生長(zhǎng)。我們?cè)诖嘶A(chǔ)上，檢測(cè)了葡糖糖代謝相關(guān)指標(biāo)葡萄糖攝取和乳酸生產(chǎn)量。替莫唑胺單獨(dú)作用可引起U87MG細(xì)胞葡萄糖攝取和乳酸生成增多，提示W(wǎng)arburg效應(yīng)增強(qiáng)可能是腫瘤細(xì)胞對(duì)抗替莫唑胺的保護(hù)性機(jī)制之一。而雙香豆素可明顯降低降低替莫唑胺引起的葡萄糖攝取和乳酸生成增多的效應(yīng)。

綜上，我們的研究結(jié)果表明，雙香豆素可通過(guò)抑制PDK1活性，改變U87MG細(xì)胞代謝模式，進(jìn)而增加U87MG細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性。本研究再次驗(yàn)證了雙香豆素是有效的PDK1活性抑制劑，為其“老藥新用”和臨床惡性膠質(zhì)瘤綜合治療提供了新的參考。