miR-378初始體rs1076064多態(tài)性與中國(guó)漢族人群乳腺癌的關(guān)聯(lián)研究

趙敏君，錢瑞儀，黃 鑫，楊 陽(yáng)，陳科潤(rùn)，易 維，楊瑞卿，司馬秀田

(1.四川大學(xué)華西醫(yī)院 a.全科醫(yī)學(xué)科；b.神經(jīng)外科，四川 成都610041;2.四川大學(xué)華西臨床醫(yī)學(xué)院，四川 成都610041；3.樂(lè)山市人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，四川 樂(lè)山614000)

乳腺癌發(fā)病高居我國(guó)女性惡性腫瘤的首位，2015年新發(fā)病例約27.2萬(wàn)，死亡病例約7萬(wàn)[1]。隨著篩查技術(shù)的廣泛應(yīng)用，乳腺癌5年生存率有所提高，但是約3-10%的乳腺癌患者在確診時(shí)即有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。乳腺癌的發(fā)病與多種因素有關(guān)，包括環(huán)境因素和遺傳因素等。研究組前期發(fā)現(xiàn)CD44相關(guān)位點(diǎn)rs13347多態(tài)性與乳腺癌的轉(zhuǎn)移有一定相關(guān)性[3]。然而，迄今為止，其準(zhǔn)確發(fā)病原因仍未完全闡明。

MiRNA是生物體內(nèi)廣泛存在的一類具有調(diào)控功能的非編碼RNA分子，由基因組轉(zhuǎn)錄，經(jīng)過(guò)miRNA初始體(pri-mRNA)、前體miRNA等步驟的加工最終形成成熟體miRNA。人類基因組中存在上千種miRNA，其中，miR-378在乳腺癌中異常高表達(dá)[4-6]。單核苷酸多態(tài)性(SNP)rs1076064位于miR-378初始體區(qū)，有文獻(xiàn)報(bào)道該位點(diǎn)多態(tài)性與肝細(xì)胞癌和前列腺癌的發(fā)病密切相關(guān)[7,8]。本研究擬探討miR-378初始體rs1076064多態(tài)性與中國(guó)漢族女性乳腺癌發(fā)病的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本采集

病例組：共133例，來(lái)自2013-2015年樂(lè)山市人民醫(yī)院住院的乳腺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn):①女性患者;②病理組織學(xué)確診為乳腺癌;③無(wú)合并其他部位原發(fā)性腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：①乳腺良性腫瘤；②有骨髓移植史患者。平均年齡 50.72±9.61歲。

對(duì)照組：共216例，來(lái)自同時(shí)期在樂(lè)山市人民醫(yī)院體檢的健康女性。排除具有乳腺癌家族史的個(gè)體。平均年齡41.21±10.13歲。

入選病例組和對(duì)照組樣本均為無(wú)關(guān)漢族個(gè)體。

1.2 儀器與試劑

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增儀為杭州朗基科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Ion torrent PGM測(cè)序儀為美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；臺(tái)式離心機(jī)為德國(guó)eppendorf公司儀器；全基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；Taq I限制性內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司；擴(kuò)增引物由上海生工生物有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1DNA提取 運(yùn)用試劑盒提取外周靜脈血中全基因組DNA，按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。運(yùn)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取DNA的濃度和純度。

1.3.2基因分型 rs1076064位點(diǎn)PCR擴(kuò)增引物如下：5’-CGGCAAAGATCACCAGAAGA-3’(上游)，5’-CAGGTGTTTGCAGGAGCAGT-3’(下游)。經(jīng)過(guò)3輪PCR，電泳割膠純化后，置于Ion torrent PGM測(cè)序儀上測(cè)序，操作步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

直接計(jì)數(shù)法計(jì)算rs1076064不同基因型在病例組和對(duì)照組中的分布，運(yùn)用χ2檢驗(yàn)分析基因型分布是否符合Handy-Weinberg遺傳平衡，并比較兩組的相關(guān)性，以比值比(OR)和95%置信區(qū)間(CI)表示相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0處理，P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

rs1076064多態(tài)性在乳腺癌和對(duì)照組中的分布頻率見(jiàn)表1，在共顯性、顯性、隱性和過(guò)顯性遺傳模型中，兩組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。根據(jù)腫瘤大小和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行分層分析，亦未發(fā)現(xiàn)rs1076064多態(tài)性與上述臨床特征之間的相關(guān)性(表2和表3)。

表1 乳腺癌組和對(duì)照組rs1076064多態(tài)性比較

表2 rs1076064與乳腺癌腫瘤大小的關(guān)聯(lián)

表3 rs1076064與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)

3 討論

miRNA在腫瘤演變過(guò)程中的調(diào)控作用得到了廣泛的認(rèn)識(shí)。已經(jīng)證實(shí)，乳腺癌中多種miRNA分子差異性表達(dá)，包括miR-378[4-6]。Yin等[4]報(bào)道乳腺癌中miR-378顯著高表達(dá)，用于乳腺癌診斷的曲線下面積為0.807。體外轉(zhuǎn)染miR-378可使腫瘤細(xì)胞獲得干性特征，包括促進(jìn)細(xì)胞集落形成和自我更新等[5]。異位表達(dá)miR-378可通過(guò)結(jié)合于Runx1基因3’非翻譯區(qū)抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移[9]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA GAS5通過(guò)靶向miR-378a-5p/Hedgehog信號(hào)通路成員SuFu促進(jìn)三陰乳腺癌細(xì)胞凋亡[10]。此外，miR-378(*)通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子PGC-1β的兩個(gè)伴侶ERRγ和GABPA的表達(dá)調(diào)節(jié)并誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的代謝轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致三羧酸循環(huán)基因表達(dá)和氧氣消耗的減少，以及乳酸生成和細(xì)胞增殖的增加[11]。以上研究提示，miR-378有望成為乳腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。

既往研究顯示，位于miRNA初始體的SNP可能作為乳腺癌的生物學(xué)標(biāo)記物[12,13]。例如，攜帶miR-125a初始體的多態(tài)位點(diǎn)rs12976445CT和CC基因型患者中miR-125a表達(dá)較低，而原癌基因人類表皮生長(zhǎng)因子受體2表達(dá)較高[12]。位于miR-182初始體的多態(tài)位點(diǎn)rs4541843-T等位基因增加了乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[13]。最近，有報(bào)道位于miR-378初始體的多態(tài)位點(diǎn)rs1076064G等位基因具有較高的啟動(dòng)子活性，預(yù)示著更好的肝癌預(yù)后[7]和前列腺癌疾病進(jìn)展[8]?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，推測(cè)rs1076064可能參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。本研究運(yùn)用病例-對(duì)照研究分析了rs1076064與中國(guó)漢族女性乳腺癌的相關(guān)關(guān)系，并評(píng)估了該多態(tài)位點(diǎn)與乳腺癌臨床特征的關(guān)聯(lián)。

然而，本研究并未發(fā)現(xiàn)miR-378初始體rs1076064多態(tài)性與中國(guó)漢族女性乳腺癌發(fā)病、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在明確的相關(guān)關(guān)系。造成該陰性結(jié)果的可能原因如下：第一，本研究納入的樣本例數(shù)較少，僅有133例乳腺癌患者，無(wú)法排除假陰性結(jié)果；第二，研究設(shè)計(jì)為病例-對(duì)照研究，無(wú)法排除入選偏倚。第三，乳腺癌的發(fā)病是多因素交互作用的結(jié)果，由于本研究是回顧性分析，未考慮環(huán)境等因素的影響。因此，未來(lái)有必要進(jìn)行大樣本前瞻性研究驗(yàn)證本研究結(jié)果。有文獻(xiàn)顯示，雖然單一的rs4245739基因分型與雌激素受體陰性乳腺癌發(fā)病無(wú)關(guān)，但是rs4245739A等位基因聯(lián)合miR-184、miR-191、miR-193a、miR-378表達(dá)譜能夠區(qū)分乳腺癌的腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目[14]，提示rs1076064多態(tài)性聯(lián)合多個(gè)miRNAs表達(dá)可能作為乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)記物。

綜上所述，miR-378初始體rs1076064多態(tài)性與中國(guó)漢族女性乳腺癌發(fā)生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。未來(lái)有待進(jìn)一步開(kāi)展不同種族的大樣本驗(yàn)證性研究及基因-基因、基因-環(huán)境交互作用和SNP-miRNA表達(dá)譜聯(lián)合分析，以期明確rs1076064- miRNAs的多因素綜合作用對(duì)乳腺癌發(fā)病的影響，為乳腺癌的早期診斷及個(gè)體化精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)。