活性氮自由基在口腔中的作用及其機(jī)制

馬歆茹，駱春梅，王沙沙，杜 芹

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州 遵義 563003；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院口腔科，四川 成都 610072；3.川北醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000；4.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610054，5.中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，四川 成都 610041)

活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)分子家族的成員以一氧化氮為中心，包括過(guò)氧亞硝基陰離子(ONOO-)、亞硝酸根離子(NO2-)、硝酰基陰離子(NO-)、二氧化氮(NO2)和三氧化二氮(N2O3)等[1]。RNS可以介導(dǎo)口腔中多種病理生理反應(yīng)。在生理情況下，RNS對(duì)維持口腔功能十分重要，如牙周組織中的NO可以擴(kuò)張牙周組織內(nèi)血管，增加局部血流，促進(jìn)傷口愈合及改善皮瓣存活[2]。而在病理狀態(tài)下，由感染等因素導(dǎo)致口腔中RNS顯著升高，此時(shí)RNS雖可作為宿主非特異性免疫重要的一部分有效抵抗外界感染，但濃度過(guò)高的RNS會(huì)導(dǎo)致硝化應(yīng)激，引起宿主細(xì)胞損傷或凋亡，介導(dǎo)或參與牙周炎、根尖周炎、扁平苔蘚和口腔癌等疾病。本文主要介紹口腔中RNS的構(gòu)成及其病理生理功能，探討RNS對(duì)口腔健康的雙重作用，為口腔疾病防治提供理論基礎(chǔ)。

1 口腔內(nèi)主要RNS的來(lái)源及作用機(jī)制

1.1 NONO廣泛存在于體內(nèi)各組織器官中，是一種具有生物活性的氣體信號(hào)分子，它作為親脂自由基可以通過(guò)擴(kuò)散穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入胞質(zhì)[3]。體內(nèi)的NO可以通過(guò)一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)途徑和硝酸鹽-亞硝酸鹽-NO途徑產(chǎn)生，其中NOS途徑是產(chǎn)生內(nèi)源性NO的主要途徑。哺乳動(dòng)物的NOS主要由L-精氨酸的代謝產(chǎn)生，分三種類型，在組織中表達(dá)不同并通過(guò)適當(dāng)?shù)拇碳みx擇性激活，產(chǎn)生NO[4]。其中神經(jīng)型一氧化氮合酶(neuronal NOS，nNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial NOS，eNOS)在短時(shí)內(nèi)只能產(chǎn)生少量的NO，主要起調(diào)節(jié)生理功能的作用，如參與平滑肌松弛、調(diào)節(jié)血管舒張以控制血壓、參與神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)信號(hào)傳遞、參與組織穩(wěn)態(tài)、參與學(xué)習(xí)及記憶的過(guò)程以及抑制血小板聚集等[5]。但另一種NOS，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible NOS，iNOS)往往不在健康情況下表達(dá)，而在受γ-干擾素和脂多糖等細(xì)胞因子或微生物產(chǎn)物誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞中表達(dá)。iNOS被轉(zhuǎn)錄激活后通過(guò)催化精氨酸，可在幾小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生大量的NO，這種過(guò)量的NO往往介導(dǎo)細(xì)胞毒性。

無(wú)論通過(guò)哪一種途徑合成，生物系統(tǒng)中的NO都可以通過(guò)兩種不同的信號(hào)通路發(fā)揮其生物學(xué)作用：環(huán)鳥苷3，5-單磷酸cGMP依賴性通路以及cGMP非依賴性通路。在前一種通路中，NO與可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的血紅素基團(tuán)結(jié)合，激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生cGMP以及活化蛋白激酶G，在神經(jīng)與血液系統(tǒng)中起信號(hào)傳導(dǎo)作用。而后一種通路則是通過(guò)對(duì)半胱氨酸硫醇的S-亞硝基化以及對(duì)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸的硝化，介導(dǎo)生物分子的化學(xué)修飾，引起細(xì)胞損傷。

1.2 ONOO-ONOO-由NO和超氧化物反應(yīng)而產(chǎn)生，在NO和超氧化物接近等摩爾比時(shí)其產(chǎn)量最大，是一種比NO更穩(wěn)定，且活性更強(qiáng)的氧化劑及硝化劑，是導(dǎo)致硝化應(yīng)激的主要成分。

生理?xiàng)l件下ONOO-的產(chǎn)量很低，起維持生理功能的作用。與NO介導(dǎo)的生理作用相似，ONOO-可作為信號(hào)分子參與信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，如調(diào)節(jié)血管收縮及調(diào)節(jié)免疫功能。但在炎癥等病理情況下，細(xì)胞因子或微生物刺激吞噬細(xì)胞，生成過(guò)量的的超氧陰離子(O2-)和NO，且二者發(fā)生反應(yīng)生成大量的ONOO-。ONOO-能與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等大多數(shù)生物分子反應(yīng)，促進(jìn)生物分子氧化或硝化而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。例如，ONOO-可以硝化蛋白質(zhì)的酪氨?；纬上趸野彼?，過(guò)量的ONOO-可以導(dǎo)致硝基酪氨酸在體內(nèi)的積累，改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與活性功能[8]。ONOO-還可以與鳥嘌呤快速反應(yīng)生成8-硝基鳥嘌呤，8-硝基鳥嘌呤有潛在的致突變作用和致癌的可能性，與腫瘤侵襲和癌癥患者的預(yù)后不良顯著相關(guān)。ONOO-介導(dǎo)的生物分子的修飾在多種疾病中起了重要的作用，包括高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、敗血癥、膿毒癥、缺血再灌注損傷和神經(jīng)退行性疾病等全身疾病，以及牙周炎、口腔腫瘤和輻射誘導(dǎo)的唾液腺功能障礙等口腔疾病[9]。

高濃度的ONOO-對(duì)真核生物和原核生物都具有強(qiáng)于NO的細(xì)胞毒性。組織中長(zhǎng)時(shí)間生成適量的ONOO-也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的大量氧化和潛在破壞，影響細(xì)胞功能及信號(hào)傳導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。除了損傷機(jī)體正常細(xì)胞外，ONOO-還能作為一種重要的抗菌劑發(fā)揮強(qiáng)于NO的微生物毒性作用，參與機(jī)體免疫。

1.3 NO2-體內(nèi)的NO2-有三種不同的來(lái)源。第一種來(lái)源是作為ONOO-等其他RNS在體內(nèi)分解生成的代謝產(chǎn)物。第二種來(lái)源是由硝酸鹽在體內(nèi)還原成亞硝酸鹽：當(dāng)人體食用含硝酸鹽的食物后，硝酸鹽經(jīng)唾液腺濃縮釋放進(jìn)入口腔，通過(guò)口腔內(nèi)硝酸鹽還原菌的作用將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽[6]。第三種來(lái)源為膳食攝入的亞硝酸鹽。

NO2-能通過(guò)兩種途徑發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。在缺氧和炎癥條件下NO2-含量升高，黃嘌呤氧化還原酶(xanthine oxidoreductase，XOR)發(fā)揮NO2-還原酶功能，催化NO2-還原為NO發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。除了這種途徑外，在不依賴XOR的條件下，NO2-可以通過(guò)與血紅蛋白反應(yīng)，降低血紅蛋白還原NO的能力而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。但是NO2-也能通過(guò)衍生出多種RNS修飾生物分子，引起細(xì)胞損傷，或促進(jìn)N-亞硝胺(N-nitrosamines)的形成導(dǎo)致炎癥和癌癥等病理現(xiàn)象。

1.4 N2O3NO能在有氧環(huán)境下與氧分子反應(yīng)，自動(dòng)氧化為NO2及N2O3，而N2O3可以解離生成NO+和硝酸鹽。口腔微環(huán)境中的NO能通過(guò)這種方式轉(zhuǎn)化為其他RNS。當(dāng)體內(nèi)NO的量遠(yuǎn)大于O2-時(shí)，NO與O2-反應(yīng)主要生成N2O3。當(dāng)體內(nèi)巨噬細(xì)胞受γ-干擾素刺激后，可比受未刺激時(shí)多合成3～4倍的NO，這時(shí)NO與O2-反應(yīng)主要生成N2O3。N2O3不穩(wěn)定，它可以促進(jìn)硫與胺的亞硝化，生成S-亞硝基硫醇(S-nitrosothiols，RSNO)和N-亞硝胺。

2 口腔中RNS的生理作用

口腔中富含多種RNS，它們主要有兩個(gè)來(lái)源：由NOS產(chǎn)生的NO衍生或源于口腔微環(huán)境中硝酸鹽還原菌產(chǎn)生的NO2-。這些RNS不僅起調(diào)節(jié)和維持口腔生理功能的重要作用，還能在多種口腔硬軟組織疾病中發(fā)揮正面作用。

從表3可以看出，合金鋅粉加入量按照貧鎘液鈷的30倍加入，鋅粉消耗量大，除鈷效率不到20%，鎘也并未置換出來(lái)，并未有效地解決系統(tǒng)鈷循環(huán)、富集的問題。

2.1 抗菌RNS可以被機(jī)體的免疫系統(tǒng)用于防御感染，殺滅病原微生物。在機(jī)體遭受外界微生物的入侵后，微生物及其產(chǎn)物刺激巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活iNOS，在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量NO。NO可介導(dǎo)細(xì)胞毒性以殺傷微生物，它可以結(jié)合螯合鐵池生成二硝基-鐵絡(luò)合物(DNICs)抑制細(xì)菌功能，還能通過(guò)與ROS的反應(yīng)而增強(qiáng)其細(xì)胞毒性。外界微生物入侵后，吞噬細(xì)胞活化促進(jìn)NADPH氧化酶活性，通過(guò)呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量的O2-。O2-不僅能在酸性條件下快速歧化生成H2O2發(fā)揮抗菌作用，還能與與NO反應(yīng)生成ONOO-發(fā)揮更強(qiáng)的抗菌作用。口腔內(nèi)的RNS能作為機(jī)體抵抗病原菌的非特異性防御機(jī)制，如iNOS產(chǎn)生的NO可以控制牙齦卟啉單胞菌感染，抑制根尖周細(xì)菌從而控制牙槽骨吸收的進(jìn)展。而缺乏NO會(huì)加速牙槽骨的感染性吸收[10]。

在口腔中，硝酸鹽還原菌產(chǎn)生亞硝酸鹽也可以在齲病和牙周炎等口腔疾病中發(fā)揮抑菌作用。唾液中高濃度的硝酸鹽有助于齲病的預(yù)防，在變異鏈球菌和乳酸桿菌等致齲產(chǎn)酸菌導(dǎo)致的牙齒周圍的酸性環(huán)境中，亞硝酸鹽被快速質(zhì)子化形成亞硝酸，而不穩(wěn)定的亞硝酸會(huì)歧化形成以NO為主的一系列氮氧化物，起抑菌或殺菌作用[11]。另一方面，在食用富含硝酸鹽的食物后，唾液的PH會(huì)升高，抑制致齲菌的生長(zhǎng)[12]。除預(yù)防齲病外，亞硝酸鹽也能在牙周炎和口念珠菌病等口腔炎癥疾病中發(fā)揮抗菌作用，炎癥狀態(tài)下唾液腺能分泌更高濃度的硝酸鹽，增加唾液的保護(hù)潛力。這種高濃度的硝酸鹽可由硝酸鹽還原菌還原為亞硝酸鹽，發(fā)揮抑菌作用[13]。

口腔中的亞硝酸鹽可隨唾液進(jìn)入酸性胃環(huán)境中而發(fā)揮抗菌作用，在一定程度上防止胃腸道疾病。此外，一些口腔微生物還能通過(guò)口腔中亞硝酸鹽在全身感染中發(fā)揮積極作用。副鰻鏈球菌及血鏈球菌等口腔共生鏈球菌在有氧條件下能主要通過(guò)丙酮酸氧化酶SpxB產(chǎn)生H2O2，H2O2與口腔中的亞硝酸鹽反應(yīng)形成ONOO-等RNS，抑制銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)，利于肺部囊性纖維化感染期間肺部功能的改善[14]。

2.2 調(diào)節(jié)血管舒張口腔中的亞硝酸鹽進(jìn)入體循環(huán)后，能轉(zhuǎn)化為NO等RNS發(fā)揮一些生理作用，體循環(huán)中的NO可以通過(guò)血管舒張發(fā)揮一定的降血壓作用，益于心血管健康。由于口腔內(nèi)硝酸鹽還原菌是產(chǎn)生亞硝酸鹽的一個(gè)重要來(lái)源，口腔微生物群的變化會(huì)引起NO含量變化，通過(guò)調(diào)節(jié)血管舒張影響血壓。因此，使用抗菌漱口水的人口腔微環(huán)境中及血漿中亞硝酸鹽含量減少，使收縮壓和舒張壓增高[15]。

口腔軟組織中NOS產(chǎn)生的NO通過(guò)調(diào)節(jié)口腔血流及唾液的流動(dòng)，維持著口腔的生理功能?？谇唤M織的血液循環(huán)受nNOS和eNOS合成的NO調(diào)節(jié)，對(duì)于維持口腔健康至關(guān)重要。例如，NO調(diào)節(jié)著牙齦中的血流灌注，使血管舒張并向遠(yuǎn)端擴(kuò)散，尤其是向根尖部血管擴(kuò)散，對(duì)皮瓣存活和傷口愈合起積極作用[2]。適量的NO維持牙周組織的健康，在早期牙周炎中，牙周組織中的NO通過(guò)舒張血管平滑肌調(diào)節(jié)局部血流，起改善微循環(huán)的作用。

2.3 控制口腔疾病的發(fā)展以NO為代表的RNS可以控制一些口腔疾病的發(fā)展。Korde等[16]的研究表明，口腔癌組織中的NO能通過(guò)抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞發(fā)揮一定的抗腫瘤作用，并且iNOS的上調(diào)可能會(huì)抑制口腔癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和致瘤性。在牙周炎及根尖周炎中，NO控制著牙槽骨吸收的進(jìn)展，高濃度的外源性NO可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞祖細(xì)胞凋亡，抑制成熟破骨細(xì)胞的再吸收活性而抑制牙槽骨的吸收。

3 口腔中RNS的病理作用

口腔內(nèi)RNS除了發(fā)揮正面作用外也能導(dǎo)致多種病理狀態(tài)。例如，由微生物感染產(chǎn)生的RNS通過(guò)靶向微生物起抗菌作用，但RNS靶向的分子部位不僅是微生物，還包括了宿主，因此RNS也會(huì)損傷宿主細(xì)胞。這種由RNS引起的生物分子修飾會(huì)導(dǎo)致一些病理狀態(tài)，與多種口腔疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

3.1 促進(jìn)牙周炎的進(jìn)展許多研究證實(shí)了炎癥牙周組織中iNOS的活性及NO含量高于正常牙周組織，這是因?yàn)檠例l卟啉單胞菌、伴放線聚集桿菌和中間普氏菌等牙周致病菌能通過(guò)刺激巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)iNOS表達(dá)[5，7，9]，使局部持續(xù)產(chǎn)生大量NO和ONOO-，ONOO-與酪氨酸反應(yīng)生成硝基酪氨酸，導(dǎo)致牙周組織損傷。iNOS的表達(dá)及隨后生成的RNS促進(jìn)了牙周病的進(jìn)展，造成牙周局部組織的破壞、牙槽骨吸收。如由iNOS產(chǎn)生的NO不僅可以通過(guò)增強(qiáng)破骨細(xì)胞的分化和活性，還可以和ONOO-通過(guò)激活聚ADP-核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]介導(dǎo)下游組織毒性，導(dǎo)致牙槽骨吸收和牙周炎中血漿外滲[17，18]。

一些外源性因素或全身因素促進(jìn)了牙周炎中RNS的產(chǎn)生。例如，吸煙的牙齦炎患者的牙齦組織內(nèi)能檢測(cè)到較不吸煙的牙齦炎患者更強(qiáng)的iNOS表達(dá)，參與牙周病的發(fā)病機(jī)制[19]?；继悄虿〉难乐苎状笫蟮难例l組織中ONOO-及硝基酪氨酸含量增高，提示糖尿病患者能通過(guò)硝化應(yīng)激加重牙周病的程度[20]。

3.2 促進(jìn)根尖周組織破壞來(lái)源于牙髓和根管系統(tǒng)的細(xì)菌感染導(dǎo)致根尖周聚集大量的免疫細(xì)胞，引起根尖周炎癥。各種急慢性根尖周炎患者的根尖周組織中都存在著大量表達(dá)iNOS的細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、多形核白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，使根尖周組織富含NO。與牙周炎中牙槽骨吸收相似，由iNOS產(chǎn)生的NO在炎癥狀態(tài)下促進(jìn)根尖周牙槽骨的吸收，并且NO與O2-反應(yīng)生成的ONOO-可導(dǎo)致根尖周組織的嚴(yán)重破壞。

3.3 促進(jìn)口腔癌的發(fā)生由RNS導(dǎo)致的硝化應(yīng)激是口腔癌發(fā)病的主要原因，RNS的增加導(dǎo)致唾液抗氧化系統(tǒng)的消耗減少，使氧化劑與抗氧化劑失衡，造成生物分子的氧化損傷，特別是NO介導(dǎo)生成的脂質(zhì)過(guò)氧化物——丙二醛、氧化蛋白質(zhì)和氧化DNA的形成與口腔癌的病理機(jī)制密切相關(guān)。許多研究表明，口腔癌患者唾液中RNS增加而抗氧化劑含量顯著減少，且類似的氧化劑——抗氧化劑失衡也發(fā)生在口腔癌患者癌組織中及血液中，提示口腔癌患者抗氧化防御機(jī)制減少而硝化應(yīng)激增加[21～23]。此外，口腔中硝酸鹽還原菌產(chǎn)生的亞硝酸鹽與胺和酰胺的反應(yīng)可生成N-亞硝胺，N-亞硝胺具有很高的致癌性和致突變性，也促進(jìn)了口腔癌的發(fā)生[21，22]。

3.4 參與口腔扁平苔蘚的發(fā)生發(fā)展NO與口腔扁平苔蘚(orallichen planus，OLP)的發(fā)生發(fā)展有著緊密聯(lián)系。一些研究表明，OLP患者的唾液NO和亞硝酸鹽明顯增高，這可能是由于炎癥狀況而導(dǎo)致iNOS的過(guò)表達(dá)，產(chǎn)生了更多的NO，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在OLP的組織病理學(xué)中被視為基底細(xì)胞變性[24，25]。盡管NO在OLP的發(fā)病機(jī)制中的具體作用尚不明確，但對(duì)唾液NO的測(cè)定可能對(duì)扁平苔蘚的診斷、監(jiān)測(cè)及治療有一定意義。

3.5 參與Sj?gren綜合征的進(jìn)展NO的產(chǎn)生也與Sj?gren綜合征密切相關(guān)。Benchabane等[26]的研究表明，由于IL-6和IL-17 A等炎性因子的存在，Sj?gren綜合征患者唾液腺組織中的iNOS被激活而產(chǎn)生過(guò)量NO，而過(guò)量的NO可能導(dǎo)致唾液腺炎性損傷和腺泡細(xì)胞萎縮。

3.6 促進(jìn)唾液腺功能障礙的發(fā)生外源性輻射能促進(jìn)體內(nèi)RNS和ROS產(chǎn)生，引起一系列疾病。頭頸部惡性腫瘤的患者在接受放射治療后，唾液腺組織中會(huì)產(chǎn)生大量的NO與O2-，二者反應(yīng)生成ONOO-造成生物分子的損傷，使這些患者易患口干癥。輻射后產(chǎn)生的RNS可能是輻射誘導(dǎo)的唾液腺功能障礙的重要致病因素。

4 結(jié)語(yǔ)

RNS是近年來(lái)學(xué)者們研究的熱點(diǎn)，口腔中富含多種RNS，發(fā)揮著多種病理生理作用。在正常生理情況下，RNS維持著口腔的正常生理功能，而在一些病理狀態(tài)下，由于RNS的含量上升或機(jī)體抗氧化系統(tǒng)障礙，導(dǎo)致了硝化應(yīng)激。RNS與多種口腔疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，RNS能在口腔疾病中發(fā)揮一定的正面作用：RNS可以在口腔感染性疾病中發(fā)揮抑菌作用、控制一些口腔疾病的進(jìn)展以及用于口腔疾病的治療。RNS在口腔疾病的治療方面展現(xiàn)出一定的臨床應(yīng)用前景：NO可作為治療一些口腔疾病的靶標(biāo)，抑制NO或使NO過(guò)量產(chǎn)生可以作為口腔疾病的治療策略，如使用iNOS選擇性抑制劑可以加速根尖周病的愈合[27]，使用外源性NO能抑制OSCC癌細(xì)胞的增值[28]。但過(guò)量的RNS也是導(dǎo)致或促進(jìn)多種口腔疾病的重要因素，因?yàn)镽NS會(huì)導(dǎo)致生物分子的化學(xué)修飾并介導(dǎo)損傷，參與多種口腔疾病的病理過(guò)程。隨著對(duì)口腔中RNS的作用機(jī)制的研究進(jìn)一步深入，逐漸豐富了人們對(duì)一些口腔疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的理解，為口腔疾病的預(yù)防和治療提供了新的方向。