植物外泌體提取及應(yīng)用研究進(jìn)展

帖慧琳，李春磊，王浩然，于榮敏，朱建華

（暨南大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510632）

真核細(xì)胞釋放到細(xì)胞外空間的小泡稱(chēng)為胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）[1]。 EV在細(xì)胞間[2]和種間通訊[3]及免疫反應(yīng)[4]中起重要作用[5]。到目前為止，已經(jīng)在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了3種EV，包括多囊體（multivesicular body，MVB）-質(zhì)膜（plasma membrane，PM）融合產(chǎn)生的外泌體，從PM直接萌發(fā)的微囊泡，以及細(xì)胞死亡過(guò)程中產(chǎn)生的凋亡小體[6-8]。

外泌體是真核細(xì)胞分泌的直徑為40～100 nm的細(xì)胞外囊泡，是細(xì)胞內(nèi)MVB與PM融合后從細(xì)胞中釋放的小泡[9]。許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞有釋放外泌體的能力，包括網(wǎng)織紅細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、上皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等。在動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)外泌體后，越來(lái)越多的證據(jù)表明在植物中會(huì)出現(xiàn)MVB和類(lèi)似外泌體的囊泡。這些發(fā)現(xiàn)主要集中在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化（包括與細(xì)胞壁相關(guān)的過(guò)程）研究上，或集中在植物對(duì)各種脅迫的反應(yīng)上[10]。

除了動(dòng)物體液外，許多植物中也發(fā)現(xiàn)含蛋白質(zhì)和小RNA的外泌體樣納米粒子，如生姜、胡蘿卜、西瓜葡萄、橄欖、瓜子。這些植物外泌體由于缺乏毒性，有大規(guī)模生產(chǎn)的可能性，其內(nèi)在特性和攜帶藥物或小RNA分子等其他化合物的可能性，在醫(yī)療應(yīng)用中引起了廣泛關(guān)注[11]。Regente等[12]于2009年首次發(fā)現(xiàn)植物中存在外泌體樣小泡，該小泡在向日葵種子中直徑為50～200 nm。其后許多研究集中于囊泡及其生物活性成分的深層表征，以更好地了解其內(nèi)在特性和可能的生物技術(shù)應(yīng)用。有研究通過(guò)超速離心從植物物種，如葡萄、葡萄柚、姜和西蘭花中分離出帶有特定的蛋白質(zhì)組、脂質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組譜的細(xì)胞外囊泡[13-16]；并發(fā)現(xiàn)這些可食用植物來(lái)源的囊泡有抗炎特性：葡萄、葡萄柚來(lái)源的外泌體樣納米顆粒有靶向腸道細(xì)胞的作用，并能在使小鼠免受硫酸葡聚糖鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎方面發(fā)揮作用[13-14]。

1 植物外泌體分泌方式和物質(zhì)構(gòu)成

植物外泌體與動(dòng)物外泌體形態(tài)結(jié)構(gòu)類(lèi)似，有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，含有蛋白質(zhì)和微小RNA，呈茶托狀或杯狀，其形態(tài)可利用透射電子顯微鏡（TEM）觀察[17]。提取外泌體總脂后，對(duì)其進(jìn)行更詳細(xì)分析[18-19]。蛋白質(zhì)分析表明，包含參與信號(hào)傳遞的蛋白質(zhì)，其中許多蛋白質(zhì)在應(yīng)激和免疫反應(yīng)中被高度誘導(dǎo)；還包含涉及活性氧信號(hào)傳導(dǎo)和氧化應(yīng)激反應(yīng)的蛋白質(zhì)，及各種膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和囊泡內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[20]。植物外泌體含有較豐富的miRNA，其為一類(lèi)長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源單鏈非編碼RNA，在生物體中起重要作用，是一種高效的基因表達(dá)調(diào)控因子[21]。越來(lái)越多報(bào)告顯示，miRNA不僅在其原始系統(tǒng)內(nèi)執(zhí)行生物學(xué)功能，還可進(jìn)行跨界基因表達(dá)調(diào)控[22]。

2 植物外泌體的分離純化及鑒定

2.1 植物外泌體的分離純化

目前，外泌體的分離方法主要包括超速離心法[23]、蔗糖密度梯度離心法[24]、超濾離心法[25]、免疫磁珠法[26]、聚合物沉淀法[27]、尺寸排阻色譜法[28]和微流控技術(shù)[29]。這些分離方法均有各自的優(yōu)勢(shì)和局限性。超速離心法和蔗糖密度梯度離心法利用外泌體與其他組分在密度和大小上的差異，通過(guò)不同的離心力分離外泌體，操作簡(jiǎn)單、獲得的外泌體數(shù)量較多，但工藝費(fèi)時(shí)、回收率不穩(wěn)定，反復(fù)離心可能會(huì)對(duì)外泌體造成損傷[23-24]。超濾離心法是基于粒子大小的分離技術(shù)，利用超濾膜將外泌體從蛋白質(zhì)等生物大分子中分離，不影響外泌體的生物活性，但可能損傷外泌體，不能保持其形態(tài)[25]。免疫磁珠法是基于外泌體表面的受體對(duì)其進(jìn)行分離，能分離所有外泌體或外泌體的選擇性亞型，但這種方法成本高，使用條件苛刻，不適于大量樣品，且此方法分離的囊泡可能失去原有的功能活性[26]。聚合物沉淀法利用聚合物（如聚乙二醇）劫持水分子，使外泌體溶解度下降，再通過(guò)低速離心分離，操作簡(jiǎn)單、無(wú)需專(zhuān)門(mén)設(shè)備，目前已實(shí)現(xiàn)商品化，但提取過(guò)程中脂蛋白和聚合物之間可能產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致外泌體純度降低[27]。尺寸排阻色譜法是基于分離分子的大小和尺寸進(jìn)行分離，分離純度高、可保證外泌體的完整性和生物活性，但提取的外泌體濃度低，后續(xù)應(yīng)用需濃縮，且需專(zhuān)業(yè)設(shè)備[28]。近年，新發(fā)展的微流控技術(shù)是一種基于外泌體生物化學(xué)和物理性質(zhì)差異的微尺度分離技術(shù)，樣品處理速度快、成本低、靈敏度高，但產(chǎn)量較低，僅適用于診斷[29]；還有試劑盒提取外泌體，此法操作簡(jiǎn)單便捷，不需特殊設(shè)備，隨著產(chǎn)品不斷更新?lián)Q代，提取效率和純化效果逐漸提高，但市場(chǎng)上各類(lèi)產(chǎn)品分離純化效果良莠不齊[30]。

目前，大多用超速離心法和蔗糖密度梯度離心法提取植物外泌體。Regente等[12]最早從向日葵種子中提取細(xì)胞外囊泡。將20g種子中提取的細(xì)胞外液通過(guò)0.5 μm膜過(guò)濾，并通過(guò)連續(xù)離心步驟分別按照步驟10 000g離心30 min，40 000g離心60 min和100 000g離心60 min分級(jí)分離。棄去第一個(gè)沉淀，將40 000g和100 000g沉淀部分分別重懸在Tris-HCl pH 7.5緩沖液中。結(jié)果在40 000g部分有較高密度50～200 nm 囊泡樣小泡。Brian等[20]提取擬南芥葉片的細(xì)胞外囊泡，將上述方法40 000g離心部分在OptiPrep密度梯度中純化。Wang等[14]分離柚子的細(xì)胞外囊泡，去除果皮，將果肉在高速混合器中于4 ℃下均化1 min。依次將收集的汁液以20 000g離心20 min，然后以10 000g離心1 h除去碎屑。將納米囊泡以150 000g沉淀1.5 h，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌1次，然后使用蔗糖梯度（分別為8 %，30 %，45 %和60 %）純化和分離。

綜上，植物外泌體的提取方法一般是將待提取部位處理后，先低速離心除去雜質(zhì)，再高速離心分離外泌體，然后使用密度梯度純化。根據(jù)提取的植物種類(lèi)、部位及作用目的不同在實(shí)驗(yàn)中對(duì)提取方法進(jìn)行調(diào)整。

2.2 植物外泌體的鑒定

可使用納米顆粒跟蹤分析儀（NanoSight）平臺(tái)、BCA比色法或Bio-Rad蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒[17]，通過(guò)比較納米囊泡計(jì)數(shù)與蛋白質(zhì)濃度的比值估算囊泡制劑的純度；使用電子顯微鏡檢查，觀察到外泌體的杯狀圓形結(jié)構(gòu)，動(dòng)態(tài)光散射分析其粒徑大小約為40～100 nm；流式細(xì)胞分析（FACS）進(jìn)一步證實(shí)了所研究囊泡的同源性；采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)對(duì)外泌體進(jìn)行廣泛的蛋白質(zhì)分析，將其與已知的植物外泌體蛋白質(zhì)進(jìn)行比對(duì)分析[31]。

目前，對(duì)植物外泌體的鑒定主要是采用電子顯微鏡觀察形態(tài)和動(dòng)態(tài)光散射分析粒徑分布。動(dòng)物外泌體已有標(biāo)記蛋白可確定，但植物外泌體在這方面的研究還不成熟。

3 外泌體的功能及應(yīng)用

3.1 對(duì)腸道菌群的作用

飲食已被證明對(duì)人腸道菌群的組成有相當(dāng)大的影響[32]。Yun等[33]研究了植物來(lái)源外泌體中RNA對(duì)腸道菌群的作用，從生姜外泌體中鑒定出小RNA和miRNA，可調(diào)節(jié)腸道微生物組成及其代謝產(chǎn)物，并抑制小鼠結(jié)腸炎。主要機(jī)制：（1）富含脂質(zhì)的ELN生姜外泌體發(fā)出一個(gè)信號(hào)，導(dǎo)致腸道細(xì)菌對(duì)其進(jìn)行吸收；（2）外泌體的小RNA介導(dǎo)腸道微生物和宿主免疫系統(tǒng)之間的相互作用，形成免疫和腸道微生物之間的平衡；（3）外泌體RNA調(diào)節(jié)腸道微生物的組成、代謝產(chǎn)物、生長(zhǎng)和定位。具體是生姜外泌體中RNA誘導(dǎo)的腸道益生菌LGGI3A通過(guò)激活A(yù)HR信號(hào)通路促進(jìn)IL-22表達(dá)，在屏障表面誘導(dǎo)抗微生物免疫和組織修復(fù)。此前，其他研究也發(fā)現(xiàn)生姜類(lèi)外泌體納米粒子可降低炎性細(xì)胞因子[腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）和IL-1β）]表達(dá)，增加結(jié)腸炎模型中的抗炎細(xì)胞因子（IL-10和IL-22）的表達(dá)[34]。

3.2 種間通訊

Mu等[17]從葡萄、葡萄柚、生姜、胡蘿卜4種食用植物中分離和鑒定了外泌體，證實(shí)了這些細(xì)胞外囊泡大小和結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物的外泌體相似。這些植物外泌體被腸道巨噬細(xì)胞和干細(xì)胞吸收，并對(duì)受體細(xì)胞有生物學(xué)效應(yīng)。其中，生姜外泌體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)血紅素加氧酶-1（HO-1）和IL-10表達(dá)；而包括葡萄和葡萄柚在內(nèi)的果源外泌體誘導(dǎo)Wnt/TCF4活化，Wnt信號(hào)是維持腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。研究表明，植物通過(guò)類(lèi)外泌體納米顆粒，與哺乳動(dòng)物細(xì)胞（特別是腸道巨噬細(xì)胞和干細(xì)胞）交流，且不同類(lèi)型植物的外泌體對(duì)受體哺乳動(dòng)物細(xì)胞有不同的生物學(xué)效應(yīng)。

Rutter等[20]從擬南芥玫瑰花的質(zhì)外體液中純化了囊泡。這些囊泡富含與應(yīng)激和防御相關(guān)的蛋白質(zhì)，在感染細(xì)菌性病原體丁香假單胞菌的強(qiáng)毒株入侵期間和響應(yīng)水楊酸（SA）的過(guò)程中，囊泡分泌增強(qiáng)。數(shù)據(jù)表明，外泌體有助于先天免疫，并可能介導(dǎo)植物和動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞間通訊。Zhao等[35]研究椰汁miRNA和外泌體發(fā)現(xiàn)，椰子分離的納米粒子粒徑小于從牛奶中提取的外泌體。這些植物衍生的納米粒子可能與動(dòng)物衍生的外泌體相似，因此，植物衍生的miRNA有很大的潛力可通過(guò)外泌體被吸收到哺乳動(dòng)物體內(nèi)。Baldini等[36]在柑橘外泌體樣納米粒子的抗氧化研究中，根據(jù)其研究結(jié)果推測(cè)水果衍生納米粒子在進(jìn)食后有可能介導(dǎo)物種間的通訊。

3.3 植物防御

外泌體在病原體侵襲期間在植物細(xì)胞中增殖，且常在MVB與PM融合的各種狀態(tài)下可見(jiàn)。大多數(shù)融合發(fā)生在乳頭狀結(jié)構(gòu)或細(xì)胞外防御結(jié)構(gòu)附近，這些結(jié)構(gòu)能阻止病原體進(jìn)入細(xì)胞[37-38]。促進(jìn)MVB與PM融合的GTPase酶也積聚在感染部位附近，是成功形成乳頭狀細(xì)胞所必需的[39-40]。此外，TEM顯示，乳頭狀基質(zhì)含有MVB與PM融合后產(chǎn)生的外泌體[41]。Nielsen等[39]在研究白粉病真菌對(duì)擬南芥入侵的過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)了多囊泡聚集，病原體入侵會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞多囊泡與質(zhì)膜融合分泌外泌體。這些數(shù)據(jù)表明植物中外泌體的分泌有助于對(duì)病原體的早期防御結(jié)構(gòu)發(fā)展。

外來(lái)體也可介導(dǎo)小干擾RNA從植物細(xì)胞到真菌細(xì)胞的運(yùn)輸。在宿主誘導(dǎo)的基因沉默過(guò)程中，在植物（特別是厚樸）中表達(dá)的小RNA能減少入侵真菌中目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)[42]。

3.4 儲(chǔ)存和運(yùn)輸

采摘被子植物和裸子植物，如樺樹(shù)、云杉和楊樹(shù)的莖和枝條，液氮低溫機(jī)械破壞，對(duì)樣本進(jìn)行掃描電子、原子力顯微鏡、內(nèi)切葡聚糖酶活性測(cè)定等。研究表明，被子植物和裸子植物次生韌皮部和次生木質(zhì)部的外泌體在內(nèi)源葡聚糖酶的儲(chǔ)存和運(yùn)輸中有生理作用[43]。

3.5 藥物載體

外泌體相比較傳統(tǒng)納米載體系統(tǒng)，生物相容性好、利用度高且安全無(wú)毒，并能成功攜帶模型藥物和目的基因進(jìn)一步應(yīng)用于各種疾病的藥物遞送系統(tǒng)研究[30]。目前動(dòng)物外泌體裝載化學(xué)藥物、核酸藥物及植物提取物的研究已有報(bào)道。外泌體有強(qiáng)大的穿透能力，可穿透體內(nèi)屏障，在體內(nèi)的穩(wěn)定性較好，具有脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)，能包裹疏水性藥物，將藥物運(yùn)送到達(dá)受體細(xì)胞。有研究表明，由于外泌體體積較小，能避免被單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)清除，延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的半衰期[44]。

研究表明[45]通過(guò)植物外泌體可將疏水性的姜黃素傳遞到結(jié)腸腫瘤和正常結(jié)腸組織中，外泌體可被作為細(xì)胞處理致癌miRNA的載體。Wang等將葡萄柚產(chǎn)生的細(xì)胞外納米囊泡裝載甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）遞送給小鼠，能顯著降低MTX毒性，并提高其在硫酸葡聚糖鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎中的治療作用[14]。

3.6 治療炎癥性腸病

Wang等[14]證明了葡萄柚衍生的納米囊泡被腸道巨噬細(xì)胞選擇性吸收，并改善了葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎。這些作用是通過(guò)上調(diào)血紅素加氧酶-1（HO-1）的表達(dá)并抑制腸道巨噬細(xì)胞中IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生而介導(dǎo)的。

一些研究表明，含有姜黃素的外泌體對(duì)乳腺癌和大腸癌等多種癌細(xì)胞有治療作用[46]。包裹姜黃素的葡萄柚外泌體可改善結(jié)腸炎，增加小鼠存活率，減少糞便中的血液，減少體重下降，減少結(jié)腸組織中白細(xì)胞的浸潤(rùn)。免疫酶聯(lián)分析（ELISA）表明，包裹姜黃素的葡萄柚外泌體對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織提取液中TNF-α、IL-6和IL-1b的降低與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這種治療策略可用于治療多種炎癥性疾病，包括癌癥和自身免疫性疾病[47]。這些發(fā)現(xiàn)表明，外泌體可在腸道中充當(dāng)免疫調(diào)節(jié)劑，維持腸道巨噬細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，并可用于開(kāi)發(fā)口服小分子藥物，減輕疾病中的炎癥反應(yīng)。

3.7 在癌癥中的作用

Raimondo等[48]研究表明，柑橘檸檬汁中外泌體能通過(guò)誘導(dǎo)TRAIL（腫瘤壞死因子α相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體）介導(dǎo)的細(xì)胞死亡抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，而不影響正常細(xì)胞，表明食用植物納米小體可能是一種可行的腫瘤治療方法。

4 結(jié)論與展望

近年，外泌體已成為生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，尤其是可食用植物外泌體的研究在不斷增加。目前，外泌體的研究大多集中在動(dòng)物細(xì)胞外泌體，如來(lái)源于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞外泌體，其含有缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）穩(wěn)定性lncRNA，可調(diào)控乳腺癌的有氧糖酵解[49]；來(lái)源于橫紋肌肉瘤的細(xì)胞外泌體，對(duì)受體橫紋肌肉瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖有積極作用[50]；各種研究均致力于尋找更好的治療策略以解決各種困擾人類(lèi)已久的腫瘤、癌癥等疑難雜癥，也確實(shí)取得了可觀效果。

然而，對(duì)植物外泌體的研究還較少。在植物外泌體研究中存在的主要問(wèn)題有：第一，植物外泌體提取方法較單一，提取工藝優(yōu)化研究也較少；第二，動(dòng)物外泌體可通過(guò)標(biāo)記蛋白進(jìn)行鑒定，但植物外泌體的鑒定中最常用的仍是電鏡觀察和粒徑分析；第三，植物外泌體的研究對(duì)象更多是類(lèi)外泌體納米顆粒，并不完全是外泌體，其范圍較廣泛，如果能進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝和鑒定方法，植物外泌體的研究會(huì)更有說(shuō)服力。已有的研究表明，植物外泌體在植物防御免疫、種間通訊、治療哺乳動(dòng)物炎癥反應(yīng)、作為藥物載體等方面均表現(xiàn)出一定的作用，也表明在這些方面，植物外泌體的發(fā)展前景十分廣闊。