敲低HOTTIP 抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲并促進(jìn)凋亡的機(jī)制研究

岳賢文，劉珊珊，王會(huì)東

（1.濰坊呼吸病醫(yī)院 放射科，山東 濰坊；2.濰坊市人民醫(yī)院 心內(nèi)一科，山東 濰坊；3.濰坊市人民醫(yī)院 乳腺外科，山東 濰坊）

本次研究主要通過對人體非小細(xì)胞癌細(xì)胞系的H1975以及A549 進(jìn)行研究，從而了解敲低HOTTIP 對惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移的抑制效果。待此兩種細(xì)胞系的細(xì)胞性狀穩(wěn)定后，將所有細(xì)胞轉(zhuǎn)移至RPMI1640 培養(yǎng)基上進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中預(yù)先加入適量10%胎牛血清與抗菌-抗真菌劑混合溶液?？刂普w溫度為37 ℃，并調(diào)整整體培養(yǎng)環(huán)境為5%二氧化碳與95%空氣，連續(xù)培養(yǎng)，將其作為研究對照組。

我們首先通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRTPCR）對正常人體組織以及腫瘤病灶組織中的HOXA 基因簇末端轉(zhuǎn)錄物即是HOTTIP 的相對表達(dá)進(jìn)行詳細(xì)檢測分析，同時(shí)為分析了解HOTTIP 對A549 以及H197 癌細(xì)胞的影響，通過使用RNA 干擾技術(shù)合成用于對HOTTIP 形成干擾表達(dá)的si-HOTTIP 以及其陰性對照。使用lipofectamine3000 試劑將si-HOTTIP 以及HOTTIP 轉(zhuǎn)染進(jìn)入H1975 與A549 細(xì)胞中，從而完成對HOTTIP 低表達(dá)細(xì)胞體的構(gòu)建。并將兩組細(xì)胞分別分為si-HOTTIP 組以及si-NC 組。

對所有細(xì)胞的轉(zhuǎn)染完成后，對HOTTIP 在RNA 的表達(dá)量進(jìn)行測定，測定方法主要使用qRT-PCR 技術(shù)完成對所有組別細(xì)胞中HOTTIP 相對表達(dá)量的測定，其后根據(jù)表達(dá)量計(jì)算出相應(yīng)的轉(zhuǎn)染效率。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)盒-8（CCK-8）分別評測了“對照組”“si-HOTTIP 組”和“si-NC 組”A549和H1975 細(xì)胞的活力。使用異硫氰酸熒光素以及硫化丙啶雙重染色法完成對各組細(xì)胞的凋亡率檢測，并通過蛋白質(zhì)印跡完成對各組細(xì)胞中蛋白Bax、cleaved-Caspase-3 以及cleaved-Caspase-9 蛋白表達(dá)情況，此三種蛋白主要負(fù)責(zé)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，通過了解細(xì)胞中此類蛋白的表達(dá)情況即可了解細(xì)胞組的凋亡率情況。同時(shí)，了解細(xì)胞組中的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB/AKT）信號通路和絲裂原活化蛋白激酶（AMPK）信號通路中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，包括總PI3K 蛋白（t-PI3K）、磷酸化PI3K 蛋白（p-PI3K）、總AKT 蛋白（t-AKT）和磷酸化AKT 蛋白（p-AKT）、磷酸化蛋白AMPK（p-AMPK）和總蛋白AMPK（t-AMPK）的表達(dá)情況[1]。其后使用ImageLabTM圖像處理軟件完成兩種細(xì)胞p/t-PI3K 以及p/t-AMPK 條帶量化分析處理。此次研究主要使用β-actin 蛋白作為研究比對中的內(nèi)部參照，并分別使用Transwell 細(xì)胞培養(yǎng)小室以及24 孔Millicell 懸掛式細(xì)胞培養(yǎng)小室完成對不同細(xì)胞組的細(xì)胞處理后遷移、侵襲能力測定，所有研究中測定均在相同條件下至少重復(fù)3 次并取平均值，以保證研究測定的準(zhǔn)確性與有效性。使用SPSS 24.0 軟件完成此次研究中所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，并將數(shù)據(jù)結(jié)果使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示，其中P 值使用單因素方差分析法進(jìn)行計(jì)算。

為探明敲除HOTTIP 在NSCLC 患者病理學(xué)機(jī)制中的影響情況，此次研究將使用對照組與si-HOTTIP 組、si-NC 組中A549 以及H1975 細(xì)胞中miR-206 表達(dá)情況了解HOTTIP對NSCLC 患者病理學(xué)機(jī)制的影響以及其與miR-206 的影響關(guān)系。同時(shí)通過合成抑制miR-206 蛋白表達(dá)的相關(guān)抑制因子以及陰性對照NC 抑制因子，可將其轉(zhuǎn)染至兩種細(xì)胞中，形成對應(yīng)處理組，并進(jìn)一步了解miR-206 對HOTTIP 的介導(dǎo)功能。此外本次研究使用qRT-PCR 技術(shù)將確定所有處理組轉(zhuǎn)染后的轉(zhuǎn)染效率情況，了解此種方法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

此次研究同時(shí)還將利用C C K-8 檢測對照組、s i-N C+N Cin 組、si-HOTTIP+NCin 組、si-HOTTIP+miR-206in組中A549 以及H1975 細(xì)胞的獲利情況。并主要使用通過AnnexinV-FITC/PI 雙染色法以及流式細(xì)胞檢測技術(shù)完成對各組細(xì)胞凋亡率的檢測情況，并使用上述蛋白質(zhì)免疫印跡法ImageLabTM圖像處理軟件與完成對細(xì)胞各蛋白表達(dá)的測定，與帶量化分析。

為確定EGFR 與miR-206 的關(guān)系，此次研究通過雙熒光素酶進(jìn)行檢測試驗(yàn)，測定miR-206mimic、NCmimic、EGFR-wt、突變型-EGFR 以及細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況，形成“miR-206mimic+EGFR-wt”組、“NCmimic+EGFR-wt”組、“miR-206mimic+EGFR-mut”組和“NCmimic+EGFR-mut”組。通過細(xì)胞凋亡檢測后可知，A549 以及H1975 細(xì)胞中，對照組和si-NC 組凋亡率相類似，且si-HOTTIP 組細(xì)胞凋亡率明顯較si-NC 組細(xì)胞更高，組間差異顯著（P＜0.05）。敲低HOTTIP表達(dá)使Bax、cleaved-caspase3 和cleaved-caspase9 表達(dá)量明顯較si-NC 組更高，組間差異顯著（P＜0.05）。且si-NC 組與對照組細(xì)胞間并未出現(xiàn)顯著性差異。

通過對細(xì)胞實(shí)施遷移與侵襲檢測后可知，相較于對照組，轉(zhuǎn)染si-NC 對細(xì)胞遷移率無明顯影響。相較于si-NC 組，轉(zhuǎn)染si-HOTTIP 可使細(xì)胞相對遷移率明顯下降。且對照組與si-NC 組細(xì)胞間無明顯相對侵襲率差異。相對于si-NC組細(xì)胞，si-HOTTIP 組細(xì)胞相對侵襲率明顯更低（P＜0.05）。

通過Westernblot 檢測后可知，在A549 細(xì)胞中，si-NC 組細(xì)胞內(nèi)p-AKT 蛋白表達(dá)量與p/t-PI3K 和p/t-AKT 明顯更高，組間差異顯著（P＜0.05）。而對照組與si-NC 組細(xì)胞間無明顯差異（P＞0.05）。同時(shí)，對H1975 細(xì)胞，對照組與si-NC 組t-PI3K以及t-AKT 蛋白表達(dá)量均無明顯變化。而對A549 細(xì)胞，對照組細(xì)胞與si-NC 組細(xì)胞中蛋白表達(dá)情況以及p/t-AMPK 幾乎相同，si-HOTTIP 組細(xì)胞p-AMPK 表達(dá)與p/t-AMPK 表達(dá)明顯較si-NC 組細(xì)胞更低，組間差異顯著（P＜0.05）。

Westernblot 檢測EGFR 蛋白的表達(dá)顯示，對A549 細(xì)胞和H1975 細(xì)胞而言，“對照組”和“si-NC+NCin”組結(jié)果相同；但“si-NC+NCin”處理組EGFR 蛋白表達(dá)量明顯較干擾HOTTIP 更 高（P＜0.05）；與“si-HOTTIP+NCin”處 理 組相比，“si-HOTTIP+miR-206in”處理組細(xì)胞中，EGFR 蛋白表達(dá)量將在敲低HOTTIP 沉默miR-206 的表達(dá)后明顯升高（P＜0.05）。

雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果顯示，相較于對照組，共轉(zhuǎn)染NCmimic 和EGFR-wt 后，細(xì)胞中熒光素酶相對活力無明顯變化；同時(shí)共轉(zhuǎn)染miR-206mimic 和EGFR-wt 后，細(xì)胞中熒光素酶活力明顯下降，組間差異均具有顯著性（P＜0.05）。此外，無論是共轉(zhuǎn)染NCmimic 和EGFR-mut 亦或是共轉(zhuǎn)染miR-206mimic 和EGFR-mut，相較于對照組，經(jīng)過檢測后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中所存在的熒光素酶相對活性未出現(xiàn)明顯改變。

敲低HOTTIP 對于細(xì)胞凋亡具有一定促進(jìn)作用，主要是通過上調(diào)表達(dá)miR-206 抑制NSCLC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的方式達(dá)到促進(jìn)目的，其中EGFR 可作為miR-206 的作用靶點(diǎn)[2]。此外此次研究結(jié)果顯示，HOTTIP、miR-206 和EGFR在NSCLC 細(xì)胞系兩種細(xì)胞，均有較為顯著的作用，旨在為其他醫(yī)學(xué)從業(yè)人員深入研究提供一定參考，為臨床治療方向提供新的思路。