H295R細(xì)胞系類固醇生成試驗(yàn)的研究進(jìn)展

王鵬敏，郝衛(wèi)東*

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，食品安全毒理學(xué)研究與評價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191)

內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals，EDCs)指外源性干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的化學(xué)物質(zhì)，對其篩選方法和作用機(jī)制的研究已成為毒理學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。目前，已經(jīng)有許多篩選類固醇激素干擾物的方法，比如利用原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞、原代大鼠卵巢顆粒細(xì)胞、嚙齒類動物子宮增重試驗(yàn)、Hershberger試驗(yàn)、Y-1小鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞等。相較于其他試驗(yàn)方法，H295R細(xì)胞系類固醇生成試驗(yàn)不需要使用動物，也不需要進(jìn)行復(fù)雜的分離操作，具有細(xì)胞系穩(wěn)定，且與人的內(nèi)分泌和細(xì)胞生理學(xué)關(guān)系更加緊密的優(yōu)點(diǎn)，已成為篩選類固醇激素干擾物的首選方法和優(yōu)先策略[1]。

1 H295R細(xì)胞系

1.1 H295細(xì)胞系的起源

H295細(xì)胞為人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞系，具有類似未分化的人類胚胎腎上腺細(xì)胞的生理特性，能表達(dá)類固醇激素合成過程中涉及的酶類。最初由Gazdar等[2]從原發(fā)性侵襲性腎上腺皮質(zhì)癌建立。用放射免疫分析法和質(zhì)譜法對其進(jìn)行了類固醇分泌研究，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞可分泌超過30種類固醇，有大約20種被鑒定出來，包括糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素、雄激素和雌激素。該細(xì)胞具有腎上腺皮質(zhì)所有重要的酶系統(tǒng)，包括P450scc、CYP17、3β-HSD、17-βHSD、CYP19、CYP21和CYP11B/B2。這一細(xì)胞系可從美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)購買得到，編號為CRL-10296，懸浮生長緩慢。

1.2 H295細(xì)胞亞系——H295R和H295A

1.2.1 H295R和H295A的起源及類固醇生成H295細(xì)胞的生長狀態(tài)以及類固醇生成受到培養(yǎng)條件的影響。Rainey等[3]通過改變培養(yǎng)基條件使H295細(xì)胞貼壁生長且細(xì)胞周期縮短。H295細(xì)胞在添加了Ultroser G的培養(yǎng)基中表現(xiàn)出生長速率增加。通過每3 d換一次培養(yǎng)液，棄去未貼壁細(xì)胞的方法，經(jīng)過3個月的實(shí)驗(yàn)，Rainey將那些貼壁細(xì)胞篩選出來，命名為H295R。H295R細(xì)胞系可從ATCC購買得到，編號為CRL-2128。H295R細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM/F12培養(yǎng)液中，包含L谷氨酰胺、15 mmol/L的HEPES、1%的ITS plus培養(yǎng)基添加劑(含有胰島素6.25 μg/mL、轉(zhuǎn)鐵蛋白6.25 μg/mL、硒6.25 ng/mL、牛血清白蛋白1.25 mg/mL、亞油酸5.35 μg/mL)、1%的青霉素/鏈霉素、2%的Ultroser G。

H295A細(xì)胞系的分離方法與H295R類似，通過換液法去除未貼壁細(xì)胞從而選擇出單層貼壁細(xì)胞[4]。H295R細(xì)胞與H295A細(xì)胞相比更接近于親本H295細(xì)胞。H295A細(xì)胞主要產(chǎn)生17α羥孕酮和11脫氧皮質(zhì)醇，這些是糖皮質(zhì)激素的前體。H295R細(xì)胞不僅產(chǎn)生17α羥孕烯醇酮、17α羥孕酮、11脫氧皮質(zhì)醇，而且產(chǎn)生脫氫表雄酮(DHEA)、雄烯二酮，這些是腎上腺性激素的前體。此外，也可在兩細(xì)胞發(fā)現(xiàn)少量的孕酮。H295和H295R細(xì)胞均可產(chǎn)生睪酮，可在培養(yǎng)H295和H295R細(xì)胞的培養(yǎng)液中檢出睪酮，H295A細(xì)胞則無法檢出。因此，可選擇利用H295R細(xì)胞作為研究調(diào)節(jié)雄激素生成機(jī)制的模型。H295A、H295R細(xì)胞在睪酮分泌量上的不同可能是因?yàn)镠295A細(xì)胞表現(xiàn)出較高的3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-HSD)酶活性，H295R細(xì)胞表現(xiàn)出較低的3β-HSD酶活性和較高的17，20裂解酶活性。H295R細(xì)胞所表現(xiàn)出的現(xiàn)象與高級靈長類動物腎上腺功能初現(xiàn)時所具有的3β-HSD表達(dá)下降的特征一致[5]。腎上腺網(wǎng)狀帶、睪丸間質(zhì)細(xì)胞和卵巢膜細(xì)胞均表達(dá)細(xì)胞色素P450(CYP450)家族CYP17的17α羥化酶和17，20裂解酶活性，因此產(chǎn)生DHEA[6]。3β-HSD和CYP17具有共同的作用底物。這表明3β-HSD和CYP17酶活性的平衡在類固醇生成方面起重要作用。因此CYP17是否僅具有17α羥化酶活性或同時具有17α羥化酶和17，20裂解酶活性是調(diào)控雄激素生成的關(guān)鍵。

出生后，人腎上腺雄激素產(chǎn)生關(guān)閉，直到青春期腎上腺功能初現(xiàn)時，腎上腺雄激素開始分泌，并且分泌量不斷增加，30歲左右達(dá)到穩(wěn)定階段，隨后不斷下降[7]。利用免疫組化法研究人腎上腺皮質(zhì)，發(fā)現(xiàn)在腎上腺功能初現(xiàn)時期，束狀帶(zona fasciculate，ZF)表現(xiàn)出細(xì)胞色素b5(CYB5)、膽鹽磺基轉(zhuǎn)移酶(SULT2A1)、3β-HSD表達(dá)的特殊改變。在腎上腺功能初現(xiàn)后，SULT2A1、CYB5顯著增加，3β-HSD顯著降低[8]。有流行病學(xué)研究表明[9]，過早產(chǎn)的女性在腎上腺功能初現(xiàn)時具有更高的風(fēng)險(xiǎn)發(fā)展成為多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)。

目前，對腎上腺功能初現(xiàn)有關(guān)方面的研究知之甚少，動物模型似乎不適合此類研究。因?yàn)槟I上腺功能初現(xiàn)僅發(fā)生在高級靈長類動物，并且腎上腺類固醇生成存在物種差異。因此，目前大多數(shù)研究者常采用H295A和H295R細(xì)胞作為研究模型。雖然H295A、H295R細(xì)胞來自同一腫瘤細(xì)胞，但H295R細(xì)胞比H295A細(xì)胞產(chǎn)生更多的雄激素。因此，兩種不同的細(xì)胞系可能成為研究調(diào)節(jié)雄激素產(chǎn)生關(guān)鍵機(jī)制的良好模型。

1.2.2 H295R和H295A細(xì)胞的激素合成調(diào)控與應(yīng)用1866年，Arnold首次描述了腎上腺皮質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)[10]。腎上腺皮質(zhì)由3層構(gòu)成，最外層為球狀帶(zona glomerulosa，ZG)，接著為占大部分的束狀帶(ZF)，內(nèi)層為網(wǎng)狀帶(zona reticularis，ZR)，分別分泌鹽皮質(zhì)激素、糖皮質(zhì)激素和腎上腺性激素。各層分泌不同的激素主要是各層細(xì)胞所含的促進(jìn)激素合成的酶不同，因而產(chǎn)生不同的酶促反應(yīng)，它們均以膽固醇為合成底物，與類固醇激素合成有關(guān)的酶分布于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和鉀離子(K+)主要調(diào)節(jié)球狀帶的類固醇生成，促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)主要調(diào)節(jié)束狀帶和網(wǎng)狀帶的類固醇生成。

在體內(nèi)，AngⅡ作用于腎上腺球狀帶通過血管緊張素Ⅱ受體1(AT1)增加醛固酮的產(chǎn)生。研究表明H295細(xì)胞對ACTH、AngⅡ刺激無應(yīng)答。相反，H295R細(xì)胞的類固醇激素生成受到AngⅡ、K+以及ACTH的調(diào)控。H295R細(xì)胞表達(dá)較高水平的AT1受體，給予AngⅡ刺激，可增加H295R細(xì)胞的醛固酮和皮質(zhì)醇分泌量，睪酮分泌量有所下降[11]。給予H295A細(xì)胞AngⅡ刺激，未發(fā)現(xiàn)類固醇激素生成的明顯改變。因此，H295R細(xì)胞可能對闡明AngⅡ調(diào)節(jié)腎上腺細(xì)胞的作用機(jī)制具有重要意義。

另一個主要調(diào)節(jié)腎上腺醛固酮生成的生理調(diào)節(jié)劑是細(xì)胞外的鉀離子水平。K+可增加H295R細(xì)胞內(nèi)的鈣水平，進(jìn)而激活鈣依賴的PKC信號通路，從而增加醛固酮的生成[3]。K+也可增加AngⅠ和AngⅡ的生成[12]。甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)及甲狀旁腺激素相關(guān)肽(parathyroid hormone related peptide，PTHRP)也可調(diào)節(jié)腎上腺醛固酮生成，可調(diào)節(jié)新離體的球狀帶細(xì)胞的醛固酮生成。PTH和PTHRP也可增加H295R細(xì)胞的醛固酮生成。PTH和PTHRP通過依賴cAMP的方式激活H295R細(xì)胞的類固醇生成。因此，H295R細(xì)胞可為醛固酮生成作用機(jī)制的研究提供適宜的細(xì)胞模型。

腎上腺皮質(zhì)醇的主要激素調(diào)節(jié)物質(zhì)是ACTH。ACTH/cAMP通路在調(diào)節(jié)類固醇激素生成方面起到了非常重要的作用。ACTH激活G蛋白偶聯(lián)受體黑皮質(zhì)素2受體(MC2R)，MC2R幾乎僅存在于腎上腺皮質(zhì)，活化的MC2R觸發(fā)cAMP的產(chǎn)生，進(jìn)而激活蛋白激酶A和其他相關(guān)的信號通路[13]。H295A、H295R細(xì)胞均表達(dá)低水平的ACTH受體。ACTH處理可引起醛固酮生成的急速增加但此效應(yīng)無法長時間維持。cAMP刺激直接增加了兩細(xì)胞中類固醇的生成[14]，并且cAMP的刺激作用在H295R細(xì)胞更顯著，這說明cAMP信號通路在兩細(xì)胞是完整的。因此在評價(jià)對類固醇生成具有較弱抑制作用的外源化學(xué)物時，可考慮給予腺苷酸環(huán)化酶激活劑forskolin刺激，使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高。在有forskolin刺激的條件下可能更容易觀察到外源化學(xué)物的抑制作用[15]。鑒于在forskolin刺激條件下H295R細(xì)胞類固醇激素生成基因的表達(dá)與成年人腎上腺基因表達(dá)譜具有更明顯的相似性[15]以及細(xì)胞生存的激素環(huán)境，可以認(rèn)為在forskolin刺激條件下得到的結(jié)果更有意義。對ACTH的低反應(yīng)性是這一細(xì)胞模型的缺陷。一個可供選擇的策略是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使H295細(xì)胞系的ACTH受體表達(dá)恢復(fù)。通過對H295A、H295R細(xì)胞的比較研究可以幫助我們發(fā)現(xiàn)鹽皮質(zhì)激素或雄激素生成的重要的調(diào)節(jié)機(jī)制。

2 H295R細(xì)胞系類固醇生成試驗(yàn)的應(yīng)用

根據(jù)OECD化學(xué)品測試指南TG456的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，并經(jīng)同行評審及多實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證的結(jié)果顯示，H295R細(xì)胞體外傳代至F5～F10代，接種濃度在2×105個/mL，培養(yǎng)24 h后，再染毒48 h，有利于檢測激素生成的變化，通過檢測培養(yǎng)基中睪酮和雌二醇含量來判斷化學(xué)物對類固醇生成的影響。染毒時同時增加陽性組(10 μmol/L forskolin)和陰性組(3 μmol/L prochloraz)，當(dāng)滿足陽性組睪酮生成量至少為對照組的2倍且雌二醇生成量至少為對照組的7.5倍；陰性組睪酮和雌二醇生成量為對照組的0.5倍時，符合測試準(zhǔn)則。H295R細(xì)胞的生長狀態(tài)以及類固醇的生成受培養(yǎng)條件的影響，特別是培養(yǎng)基中的血清因素會對類固醇激素的生成有較大影響。2010年，Kempná等[16]首次報(bào)道了H295R細(xì)胞的饑餓培養(yǎng)。他們發(fā)現(xiàn)H295R細(xì)胞可以在無血清的培養(yǎng)基中存活96 h。H295R細(xì)胞可以內(nèi)源性生成胰島素樣生長因子-2(IGF-Ⅱ)，內(nèi)源性生成的IGF-Ⅱ能夠充當(dāng)自分泌生長刺激物使H295R細(xì)胞在無血清的條件下生存較長時間。

血清剝奪改變了H295R的類固醇生成，使雄激素生成增加，糖皮質(zhì)激素生成減少。在無血清和胰島素的饑餓條件下，H295R產(chǎn)生更多的雄激素和DHEA，抑制了HSD3B2基因的表達(dá)，3β-HSD酶活性降低；CYP17基因表達(dá)未發(fā)生改變，但顯著增加了CYP17絲氨酸磷酸化，因而增加了裂解酶活性，羥化酶活性未發(fā)生改變。MAPK激酶(MEK)和ERK1/2磷酸化水平降低[17]。同樣，對H295A饑餓培養(yǎng)也發(fā)現(xiàn)CYP17磷酸化的增加。

在世界范圍內(nèi)多囊卵巢綜合征(PCOS)大約影響著5%～10%的育齡婦女。主要表現(xiàn)為雄激素過多、月經(jīng)稀發(fā)且伴隨排卵過少、促性腺激素分泌紊亂等，并且通常與胰島素抵抗和代謝綜合征有關(guān)。高雄激素血癥是PCOS患者的主要表現(xiàn)，雄激素來源于卵巢和腎上腺。從患者體內(nèi)分離出卵巢卵泡膜細(xì)胞研究其類固醇代謝，發(fā)現(xiàn)與正常的細(xì)胞相比3β-HSD和CYP17酶活性增加。實(shí)驗(yàn)表明增加的CYB5以及CYP17的磷酸化導(dǎo)致17，20裂解酶活性增加，這與H295R細(xì)胞特性一致[18]。因此，H295R細(xì)胞的饑餓培養(yǎng)可能成為研究PCOS及開發(fā)潛在治療藥物的模型。

3 H295R細(xì)胞系類固醇生成試驗(yàn)的研究進(jìn)展與目前的解決方法

H295R試驗(yàn)已得到國際范圍的廣泛認(rèn)同，美國內(nèi)分泌干擾物篩選項(xiàng)目(endocrine disruptor screening program，EDSP)已將H295R試驗(yàn)用于EDSP的一級篩選(Tier 1 battery)[19]。隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，H295R試驗(yàn)已逐步被高通量H295R細(xì)胞系類固醇生成試驗(yàn)(high-throughput H295R assay，HT-H295R)所取代[20]。目前，已利用HT-H295R篩選了2 012種常見化學(xué)物，利用HPLC-MS/MS測定了11種類固醇激素，包括孕激素、糖皮質(zhì)激素、雄激素和雌激素等[21]，并通過計(jì)算馬氏距離(Mahalanobis distance，Md)或平均馬氏距離(mean Mahalanobis distance，mMd)對化學(xué)物進(jìn)行優(yōu)先級排序[22]。但H295R細(xì)胞系類固醇生成試驗(yàn)仍具有很多局限性。細(xì)胞系的類固醇生成能力以及對激動劑的反應(yīng)能力可能會隨著培養(yǎng)條件和時間的變化而發(fā)生改變，因此，體外培養(yǎng)所觀察到的結(jié)果可能與體內(nèi)的實(shí)際情況不同。對于試驗(yàn)結(jié)果，沒有對性別差異的定性分析。比如，一種抑制雌激素生成的化學(xué)物對于女性來說可能被認(rèn)為是中等或弱的內(nèi)分泌干擾物，但對于男性來說可能被認(rèn)為是強(qiáng)的內(nèi)分泌干擾物。其次，H295R細(xì)胞系不涉及檢測通過影響下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal，HPG軸)而影響類固醇生成的物質(zhì)。另外，存在從腫瘤細(xì)胞系到體內(nèi)效應(yīng)外推的局限性。未分化的細(xì)胞與性腺和腎上腺的內(nèi)分泌生理是有本質(zhì)不同的，特別是這一細(xì)胞系缺乏促性腺激素所必需的膜受體[23]，比如黃體生成素(luteinizing hormone，LH)和卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)受體，這在性類固醇激素級聯(lián)的生物合成過程中是至關(guān)重要的。H295R細(xì)胞不能準(zhǔn)確預(yù)測化學(xué)物對性腺性類固醇生成的影響，因?yàn)镠295R細(xì)胞的性類固醇生成水平比性腺低，因此限制了該方法的靈敏度。Letcher等[24]發(fā)現(xiàn)相較于人絨毛膜癌細(xì)胞系JEG-3(高侵襲)和JAR(低侵襲)，H295R細(xì)胞對外源化學(xué)物的細(xì)胞毒作用不敏感，由此提出一個科學(xué)問題，即體外篩選化學(xué)物內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的適宜模型是選擇對細(xì)胞毒性更敏感的還是較不敏感的模型？因?yàn)橥庠椿瘜W(xué)物的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)是在對細(xì)胞沒有明顯細(xì)胞毒性的條件下進(jìn)行的，模型的敏感性會影響到對結(jié)果的分析以及化學(xué)物在生物體中閾值的制定。

有研究表明[25]，1×106個H295R細(xì)胞培養(yǎng)48 h可產(chǎn)生8 ng睪酮，雌二醇產(chǎn)生量更低，大約是睪酮量的1/6，因此很難發(fā)現(xiàn)較弱的抑制劑；給予forskolin刺激后可產(chǎn)生29 ng睪酮[26]。1×106個Leydig細(xì)胞培養(yǎng)3 h即可產(chǎn)生30 ng睪酮[27]，這一內(nèi)在特性使其可以用來識別較弱的抑制劑，并且給予LH刺激后睪酮生成量可增加7.4～10.8倍。2017年，Principato等[28]首次提出將純化的原代大鼠Leydig細(xì)胞作為H295R細(xì)胞系類固醇生成試驗(yàn)的補(bǔ)充，來評價(jià)化學(xué)物對睪丸睪酮生成的影響。他們認(rèn)為那些通過H295R試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)對睪酮生成無抑制作用的化學(xué)物，可能會引起LH預(yù)刺激后Leydig細(xì)胞睪酮生成的改變，進(jìn)而被認(rèn)定為疑似內(nèi)分泌干擾物。實(shí)驗(yàn)中他們選取了20種在H295R試驗(yàn)中未能引起睪酮生成降低的化學(xué)物，并把這些化學(xué)物分為兩類：一類是使17α羥基孕酮水平降低(比如辛伐他汀、芐氯菊酯、葉菌唑、高氰戊菊酯等)，一類使11脫氧皮質(zhì)酮水平升高(比如敵菌靈、對苯二酚、強(qiáng)的松等)，但都未引起睪酮生成的降低。他們發(fā)現(xiàn)，其中有85%的化學(xué)物可引起Leydig細(xì)胞睪酮生成降低。這表明Leydig細(xì)胞具有更高的靈敏度，可用于篩選H295R試驗(yàn)假陰性的化學(xué)物。另有研究表明，化學(xué)物對H295R細(xì)胞和Leydig細(xì)胞類固醇激素生成的影響存在相反的結(jié)果。雙酚A(BPA)可引起H295R細(xì)胞雌二醇水平升高[29-33]，但在Leydig細(xì)胞中可降低雌二醇水平[34]，對于這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異的原因尚不清楚。

4 展望

H295R細(xì)胞的應(yīng)用范圍具有巨大的開發(fā)潛能。H295R類固醇生成試驗(yàn)是一個簡便、快捷的環(huán)境類固醇激素干擾物體外篩選方法，用來篩選非受體途徑的類固醇激素干擾物和腎上腺皮質(zhì)激素干擾物，使大規(guī)模的體外篩選成為可能，填補(bǔ)目前大量化學(xué)物有關(guān)類固醇生成干擾方面的數(shù)據(jù)空缺，因此，該方法具有廣闊的應(yīng)用前景。但僅根據(jù)H295R類固醇生成試驗(yàn)結(jié)果來認(rèn)定化學(xué)物是否為內(nèi)分泌干擾物是不全面的，還需進(jìn)一步結(jié)合其他試驗(yàn)。體外實(shí)驗(yàn)不能像體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)菢友芯堪l(fā)生在體內(nèi)的復(fù)雜的交互作用，缺乏與其他內(nèi)分泌系統(tǒng)等的相互作用。因此，還需要不斷完善和探索新的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的評價(jià)方法。