腫瘤缺氧微環(huán)境的研究進(jìn)展△

馬苑，付秀華，王立紅#

1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，呼和浩特 010059

2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，呼和浩特 010000

在惡性腫瘤的生長(zhǎng)過程中，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的速度超過其血管生長(zhǎng)的速度，腫瘤細(xì)胞群周圍毛細(xì)血管的氧有效彌散范圍不能滿足腫瘤快速生長(zhǎng)的需要，導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)毛細(xì)血管的氧和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不均，由此形成腫瘤缺氧微環(huán)境。隨著人類對(duì)腫瘤探索的逐漸深入，影像、病理、基因檢測(cè)、外科手術(shù)、化療、放療、免疫治療等診治手段的應(yīng)用使抗腫瘤治療不斷取得新的進(jìn)展，但是仍無(wú)法從根本上改善惡性腫瘤患者的總生存率，因此，亟待實(shí)施更加有效的腫瘤治療策略。近年來(lái)，以腫瘤的缺氧微環(huán)境作為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，已取得初步成果。

1 缺氧微環(huán)境的發(fā)現(xiàn)

1955年，腫瘤缺氧現(xiàn)象首次被人類發(fā)現(xiàn)。缺氧微環(huán)境對(duì)人類腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要影響相繼被發(fā)現(xiàn)[1]。此后，人們從未間斷對(duì)缺氧微環(huán)境的研究，Le等[2]發(fā)現(xiàn)了肺癌組織中缺氧微環(huán)境的存在，這是人類最早發(fā)現(xiàn)的證明缺氧微環(huán)境在肺癌組織中存在的研究。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，大部分腫瘤組織均存在缺氧微環(huán)境，實(shí)體瘤中常存在缺氧細(xì)胞[3]。

2 缺氧標(biāo)志物

腫瘤細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下可通過自身某些內(nèi)源性基因表達(dá)的變化適應(yīng)其賴以生長(zhǎng)的微環(huán)境。目前，已知的調(diào)節(jié)因子包括缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxiainducible factor，HIF）、碳酸酐酶 9（carbonic anhydrase 9，CA9）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、p53、促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）和血小板源性生長(zhǎng)因子-β（platelet derived growth factor-β，PDGF-β）等，其中，HIF最受關(guān)注，其是一種轉(zhuǎn)錄因子，存在于人類所有細(xì)胞類型中，迄今已發(fā)現(xiàn)的HIF包括HIF-1、HIF-2、HIF-3，HIF在正常組織細(xì)胞對(duì)缺氧的急性反應(yīng)中起重要作用，而在腫瘤細(xì)胞中，HIF誘導(dǎo)能量代謝的變化，并阻止缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死。目前關(guān)于HIF-1的研究較多，其是細(xì)胞在缺氧應(yīng)激時(shí)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄激活因子，是一種由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞單位組成的異源二聚體，其表達(dá)與腫瘤的預(yù)后關(guān)系密切。CA9是一種生物酶，能可逆性地催化二氧化碳轉(zhuǎn)化為碳酸氫根離子和氫離子，通過其催化活性參與細(xì)胞內(nèi)外pH的調(diào)節(jié)，而pH的改變是由缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞代謝產(chǎn)生過量的酸而引起的。CA9還能夠促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲，在細(xì)胞黏附和擴(kuò)散方面起一定作用。CA9賦予了腫瘤細(xì)胞在缺氧、酸中毒環(huán)境中生存的能力，并增強(qiáng)了其遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移的能力，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療效果和預(yù)后均有關(guān)。

3 缺氧與腫瘤血管生成

血管生成在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著重要作用，新生血管為腫瘤細(xì)胞供給營(yíng)養(yǎng)和氧氣，是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的條件。關(guān)于腫瘤血管生成的機(jī)制已有大量研究，但仍未完全明確。研究證實(shí)，VEGF是最重要的血管生成因子，不僅可以特異性地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，還可以增加新生血管的通透性。有研究發(fā)現(xiàn)，缺氧和HIF-1α、HIF-2α在腫瘤血管生成過程中發(fā)揮重要作用[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α參與非小細(xì)胞肺癌的血管生成，其中，HIF-1α和VEGF在肺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常肺組織，且HIF-1α和VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)[7]。

CC趨化因子配體28（C-C motif chemokine ligand 28，CCL28）是腫瘤缺氧誘導(dǎo)的趨化因子，在缺氧細(xì)胞培養(yǎng)模型中發(fā)現(xiàn)CCL28可促進(jìn)肺腺癌血管的生成，且CCL28的分布與HIF-1α的分布一致，表達(dá)強(qiáng)度也與HIF-1α的表達(dá)強(qiáng)度相關(guān)；此外，肺腺癌患者血清中CCL28的濃度明顯高于健康供體，且與VEGFA的表達(dá)有關(guān)[8]。

研究顯示，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體在血管生成過程中具有調(diào)節(jié)作用，其能夠攜帶核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，主要包括具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)功能的非編碼RNA。低氧環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞集落分泌的外泌體過表達(dá)微小RNA（microRNA，miRNA）-23a，可在不同的血管生成模型中通過下調(diào)受體內(nèi)皮細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)誘導(dǎo)血管生成[9]。

Cbx4既是一種多梳蛋白，也是一種SUMO E3連接酶。有研究通過建立小鼠肝癌原位移植模型發(fā)現(xiàn)，在低氧條件下，Cbx4通過增加HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的VEGF在肝癌細(xì)胞中的產(chǎn)生和血管的生成，最終促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[10]。

4 缺氧與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移

缺氧腫瘤細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移的傾向，即腫瘤細(xì)胞在缺氧條件下會(huì)發(fā)生壞死的同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[11]。腫瘤缺氧微環(huán)境與淋巴管生成密切相關(guān)，主要通過HIF-1α調(diào)控VEGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、Prox-1 等信號(hào)級(jí)聯(lián)通路從而介導(dǎo)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，這在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。腫瘤的侵襲與基質(zhì)密切相關(guān)，大量促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的基質(zhì)細(xì)胞有助于缺氧區(qū)肺腺癌細(xì)胞侵襲行為的增強(qiáng)[12]。缺氧誘導(dǎo)膠原蛋白基因表達(dá)上調(diào)，其中，HIF-1和HIF-2可調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的降解，HIF激活轉(zhuǎn)錄程序?qū)е禄啄そ到?，同時(shí)增加膠原纖維的合成[13]；HIF-1還可通過誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞中P4HA1、P4HA2和PLOD2的表達(dá)，促進(jìn)缺氧條件下ECM的重構(gòu)，進(jìn)而影響細(xì)胞的形態(tài)、黏附和定向遷移，由此形成腫瘤侵襲的物理途徑[14]。

一項(xiàng)對(duì)喉癌患者喉癌組織標(biāo)本的研究結(jié)果顯示，缺氧不僅會(huì)促進(jìn)喉癌細(xì)胞的侵襲和遷移，還可誘導(dǎo)GLUT-1、波形蛋白（Vimentin）、N-cad的表達(dá)，而這些蛋白陽(yáng)性表達(dá)者的生存率明顯低于陰性表達(dá)者[15]。

缺氧微環(huán)境亦可誘發(fā)基因重組。一項(xiàng)對(duì)三陰性乳腺癌患者基因組的研究發(fā)現(xiàn)，早期缺氧可誘發(fā)基因組染色體不穩(wěn)定性（chromosome instability，CIN）和腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）的重構(gòu)，使腫瘤進(jìn)一步發(fā)展[16]。此外，缺氧還可維持或增強(qiáng)正常干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的干細(xì)胞表型，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展和耐藥性[17-18]。

近年來(lái)，抗血管生成藥物的應(yīng)用使多種惡性腫瘤的患者獲益，研究表明，長(zhǎng)期暴露于抗VEGF治療可能引起腫瘤的適應(yīng)性逃避現(xiàn)象，從而誘導(dǎo)更具有侵略性的腫瘤表型[19]。

對(duì)非小細(xì)胞肺癌缺氧模型的研究揭示了巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的新概念，缺氧微環(huán)境通過白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號(hào)使M1型巨噬細(xì)胞向具有促進(jìn)腫瘤發(fā)展作用的M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而高密度的M2型巨噬細(xì)胞與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[20]。

5 缺氧與耐藥

缺氧微環(huán)境在腫瘤耐藥現(xiàn)象中的作用早已被提出，腫瘤細(xì)胞對(duì)治療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抵抗性是抗腫瘤治療的障礙。多種腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是由微小殘留灶、腫瘤細(xì)胞的耐藥亞群導(dǎo)致的。缺氧通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期靜止，抑制細(xì)胞的凋亡和衰老，控制自噬，影響p53和線粒體的活性，從而賦予腫瘤細(xì)胞治療耐藥性。腫瘤缺氧環(huán)境還通過表達(dá)藥物運(yùn)載蛋白從而影響藥物的運(yùn)輸和細(xì)胞對(duì)藥物的攝取，從而產(chǎn)生化療耐藥性。P-糖蛋白（P-glucose protein，P-gp）是一種位于細(xì)胞膜的外排型藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與多藥耐藥基因1（multidrug resistance gene 1，MDR1）的表達(dá)有關(guān)，負(fù)責(zé)將各種結(jié)構(gòu)的藥物排出腫瘤細(xì)胞，從而形成腫瘤多藥耐藥現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的浸潤(rùn)性乳腺癌中HIF-1α、促紅細(xì)胞生成素的表達(dá)與P-gp的表達(dá)密切相關(guān)[21]。HIF-1α、TGF-β2 共同激活腫瘤耐藥基因GLI2的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤對(duì)化療藥物先天耐藥，而敲除HIF-1α/TGF-β2誘導(dǎo)的GLI2基因后，腫瘤對(duì)化療的耐藥性可發(fā)生逆轉(zhuǎn)，這更加證實(shí)了缺氧微環(huán)境可促進(jìn)腫瘤的治療抵抗[22]。

放療通過產(chǎn)生活性氧不可逆轉(zhuǎn)地破壞腫瘤細(xì)胞的DNA，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。消滅缺氧細(xì)胞所需的輻射劑量較消滅常氧細(xì)胞所需的輻射劑量高。由于正常組織對(duì)輻射的耐受性有限，一般不可增加放療的輻射劑量，因此，缺氧腫瘤細(xì)胞于放療后仍可能持續(xù)存在，形成更具侵襲性的腫瘤表型。此外，缺氧微環(huán)境可通過生成局部血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)低氧腫瘤細(xì)胞的放療耐受性[23]。

繼放療、化療之后，抗血管生成藥物成為抗腫瘤治療的新策略，一些抗血管生成藥物已被美國(guó)食品藥品管理局（Food and Drug Admistraton，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)用于治療肺腺癌、結(jié)直腸癌、腎癌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。大多數(shù)抗血管生成藥物直接或間接地靶向抑制VEGF或其受體，然而，腫瘤缺氧條件下的抗血管生成治療可由于PIM激酶含量的增加而產(chǎn)生腫瘤耐藥性[24]。據(jù)報(bào)道，缺氧可使白血病、腎癌或胃癌對(duì)索拉非尼產(chǎn)生耐藥性，并可導(dǎo)致肝癌細(xì)胞獲得對(duì)多種抗腫瘤藥物（包括索拉非尼、5-氟尿嘧啶、吉西他濱、順鉑、多柔比星和6-硫鳥嘌呤）的耐藥性，其中，索拉非尼的治療效果受缺氧環(huán)境的影響較小，而5-氟尿嘧啶抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用會(huì)受到缺氧環(huán)境的嚴(yán)重影響；在經(jīng)5-氟尿嘧啶處理的肝癌細(xì)胞中，缺氧不僅降低了胸腺嘧啶合成酶的水平，導(dǎo)致dTMP合成和DNA復(fù)制受阻，還影響了FdUTP的積累，導(dǎo)致DNA單鏈和雙鏈斷裂情況減少，抑制了DNA的修復(fù)，且進(jìn)一步減弱了s期（DNA復(fù)制期）的阻滯，減輕了線粒體膜電位的損失，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡減少。因此，缺氧微環(huán)境可誘導(dǎo)廣泛且有差異的耐藥性的形成[25]。

6 缺氧靶向藥物

低氧活化前體藥物（hypoxia-activated prodrug，HAP）又稱生物還原烷化劑，是一種低活性的前體藥物，可在缺氧條件下被還原活化。目前正在進(jìn)行臨床研究的HAP包括Evofosfamide（TH-302）、PR-104和Apaziquone（EO9）。TH-302是一種氮氧化合物，在小鼠模型中，應(yīng)用TH-302聯(lián)合多柔比星或多西他賽治療后，慢性缺氧腫瘤細(xì)胞的增殖明顯受限[26]。VEGF抑制劑、放療聯(lián)合TH-302可完全阻斷腫瘤的生長(zhǎng)，并且在停止治療后腫瘤靜止期持續(xù)超過3個(gè)月[27]。Peeters等[28]建立了動(dòng)物模型，并在不同的氧合條件下進(jìn)行放療和TH-302單獨(dú)及聯(lián)合治療，結(jié)果顯示，單獨(dú)治療后，腫瘤均出現(xiàn)了生長(zhǎng)延遲，而二者聯(lián)合應(yīng)用后，腫瘤的生長(zhǎng)延遲進(jìn)一步增加，TH-302可降低缺氧分?jǐn)?shù)，其治療效果依賴于腫瘤氧合情況，增加腫瘤氧合可消除TH-302的作用，而增加缺氧分?jǐn)?shù)可提高TH-302的治療效果。Kumar等[29]的研究也證實(shí)了抗血管生成藥物舒尼替尼聯(lián)合TH-302用于侵襲性神經(jīng)母細(xì)胞瘤小鼠模型的療效，兩種藥物起到互相增強(qiáng)療效的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，Evofosfamide應(yīng)用于復(fù)發(fā)難治性骨髓瘤患者取得臨床療效[30]。

反式番紅花酸鈉（trans-crocetin，TSC）的滲透性強(qiáng)，能使氧氣快速地從紅細(xì)胞擴(kuò)散至血管壁。作為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胰腺癌和腦轉(zhuǎn)移瘤的放射增敏劑，在放化療聯(lián)合TSC治療的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中已完成了Ⅰb/Ⅱ期臨床試驗(yàn)，證實(shí)其效果確切[31]。

CA9抑制劑與傳統(tǒng)藥物聯(lián)合應(yīng)用于對(duì)放、化療不敏感的缺氧腫瘤細(xì)胞已初步取得成效。CA9抑制劑SLC-0111在臨床前體外實(shí)驗(yàn)中取得良好的效果，增強(qiáng)了目前用于晚期黑色素瘤治療的達(dá)卡巴嗪和替莫唑胺的細(xì)胞毒性，增加了乳腺癌細(xì)胞對(duì)多柔比星的敏感性，還增強(qiáng)了5-氟尿嘧啶對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用[32]。

DHL是一種裝載血紅蛋白和抗腫瘤藥物多柔比星的脂質(zhì)體，可增加缺氧環(huán)境中活性氧的產(chǎn)生，促進(jìn)活性氧介導(dǎo)的多柔比星的細(xì)胞毒性，并提高腫瘤內(nèi)藥物的積累，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的內(nèi)化，提高腫瘤區(qū)域的氧含量，最終增強(qiáng)化療對(duì)低氧腫瘤的療效，逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)的化療耐藥[33]。

Obatoclax是B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）家族蛋白的BH3仿生物，研究顯示，Obatoclax（OBX）聯(lián)合化療可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲，同時(shí)增加缺氧腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性[34]。

大腸桿菌生物工程的應(yīng)用有望改變傳統(tǒng)放化療對(duì)正常細(xì)胞具有毒性作用的現(xiàn)狀。在乳腺癌動(dòng)物模型中，通過大腸桿菌Nissle 1917（escherichia coli Nissle 1917，EcN）微細(xì)胞趨向腫瘤酸性微環(huán)境，向乳腺癌壞死和缺氧的區(qū)域運(yùn)送化療藥物，最終達(dá)到腫瘤顯著緩解，且無(wú)嚴(yán)重不良反應(yīng)，有效避免了全身使用化療藥物對(duì)正常組織細(xì)胞的毒性作用[35]。

氧化還原效應(yīng)因子（APE1/Ref-1）是一種具有氧化還原信號(hào)活性的多功能蛋白，APE1/Ref-1信號(hào)通路通過HIF-1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄過程促進(jìn)CA9的表達(dá)，應(yīng)用APE1/Ref-1抑制劑阻斷HIF信號(hào)通路，可有效殺滅腫瘤細(xì)胞。小分子APX3330是APE1/Ref-1的直接抑制劑，對(duì)APE1/Ref-1氧化還原信號(hào)具有高度選擇性。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞系中應(yīng)用APX3330抑制APE1/Ref-1后，HIF-1信號(hào)和CA9 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，聯(lián)合使用APX3330和CA9抑制劑可增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[36]。

硼替佐米是一種蛋白酶體抑制劑，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗血管生成和抗腫瘤細(xì)胞增殖的作用，同時(shí)具有抑制HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性的能力，能通過阻斷低氧激活HIF-1的過程抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧微環(huán)境的適應(yīng)。美國(guó)FDA批準(zhǔn)其用于治療多發(fā)性骨髓瘤和套細(xì)胞淋巴瘤，被廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐中。與其他抗腫瘤靶向藥物類似的是，由于蛋白酶體抑制劑具有非特異性，其對(duì)正常的組織細(xì)胞也有一定的破壞作用[37]。

7 小結(jié)與展望

腫瘤缺氧微環(huán)境是由于不可控的細(xì)胞增殖、代謝改變和腫瘤血管異常導(dǎo)致氧及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸減少而形成的，其促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移以及耐藥性的形成，但其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的確切作用機(jī)制仍有待探索。經(jīng)過眾多研究者的共同努力，目前已有多種缺氧靶向藥物在臨床試驗(yàn)中取得較好效果，且少數(shù)藥物已應(yīng)用到臨床實(shí)踐中，這可能是一種有前景的治療思路，但仍然存在很多挑戰(zhàn)。例如，由于靶向缺氧微環(huán)境的藥物缺乏特異性，同時(shí)對(duì)腫瘤以外的缺氧組織細(xì)胞以及存在HIF的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生較多的不良反應(yīng)，因此限制了某些治療方法的臨床應(yīng)用。其次，與所有的抗腫瘤藥物類似，缺氧靶向藥物也不可避免地出現(xiàn)獲得性耐藥，從而使HIF及相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄因子重新激活。另外，腫瘤缺氧靶向治療的意義具有差異性，在不同患者、不同腫瘤類型中表現(xiàn)出不同的效果，期待更有效的腫瘤缺氧微環(huán)境靶向治療方法被發(fā)現(xiàn)。