人子宮平滑肌瘤原代細胞培養(yǎng)方法的建立和優(yōu)化

韋 超 李冬華* 錢睿亞 劉 宇 王文娜 邱甜甜 任 慧

(1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦四病房，北京 100026)

子宮肌瘤是一種常見的良性婦科腫瘤，多發(fā)生在育齡期女性，與雌激素濃度密切相關(guān)[1-3]。本病發(fā)病率高，大多數(shù)患者臨床癥狀不明顯，一般隨著年齡增長，雌孕激素濃度的下降，可自行萎縮，但有部分患者子宮肌瘤過大或者生長過快，癥狀明顯可能出現(xiàn)經(jīng)血增多及其引起的貧血，過大的子宮肌瘤產(chǎn)生壓迫癥狀如便秘、尿潴留、腰痛，甚至流產(chǎn)，影響受孕，嚴(yán)重影響女性的正常生活[4-7]，極少數(shù)患者向惡性腫瘤轉(zhuǎn)化[8]。目前臨床上尚缺乏有效的藥物治療，一般單發(fā)性肌瘤超過5 cm或者多發(fā)出現(xiàn)明顯癥狀者建議手術(shù)治療[9-13]。

體外研究模型的發(fā)展極大地促進了細胞代謝、增生、凋亡的研究，促進了人們對疾病機制深入認識和了解，很大程度地促進了醫(yī)學(xué)的發(fā)展[14]。體外實驗?zāi)Ｐ徒⒎椒ㄊ情_展一切體外實驗的基礎(chǔ)，體外模型的質(zhì)量決定了研究結(jié)果的真實性、可靠性和穩(wěn)定性，因此體外培養(yǎng)模型的建立和質(zhì)量控制對疾病的研究至關(guān)重要。原代細胞剛剛離體，組織學(xué)特性、生物學(xué)特性及遺傳特性都接近于體內(nèi)，適合藥物研究、分子機制研究、細胞分化研究等[15]。本研究基于消化法建立子宮肌瘤細胞原代培養(yǎng)方法并通過系列實驗對時間點探索進行培養(yǎng)方法的優(yōu)化，為子宮肌瘤體外實驗研究奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

I型膠原酶(美國Gibco公司)，DMEM-F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(美國Gibco公司),70 μm細胞篩(美國BD公司)，0.25%(質(zhì)量分數(shù))-EDTA的胰酶(美國Gibco公司)，細胞爬片(美國Meilunbio公司)，山羊血清(中國碧云天公司)，Triton X-100(中國索萊寶公司)，小鼠抗人平滑肌肌動蛋白α(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)，單克隆抗體(美國Abcam公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的熒光二抗(中國中山金橋公司)。

1.2 原代細胞的提取

1.2.1 組織來源

隨機選取經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院診斷子宮肌瘤且未經(jīng)藥物治療需行子宮平滑肌瘤剔除術(shù)的患者，本研究獲得所有患者知情同意并經(jīng)筆者醫(yī)院倫理委員會審核，倫理審批號：IEC-B-03-V01-FJ1。經(jīng)術(shù)后病理診斷確診為子宮肌瘤，取剔除部分新鮮的腫瘤組織，迅速放入含3%(質(zhì)量分數(shù))青/鏈霉素不含胎牛血清的冰浴DMEM-F12培養(yǎng)基中，封閉，迅速取回。

1.2.2 細胞提取

將組織塊取出，用含1%(質(zhì)量分數(shù))青/鏈霉素的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)反復(fù)漂洗3次，剝離最外層包膜和最內(nèi)層的中心缺血區(qū)，留取中間部分，用眼科剪將組織塊剪成1 mm3的組織碎塊，按照體積比1∶10加入0.2%(質(zhì)量分數(shù))I型膠原酶，放入37 ℃水浴，并間斷混勻，進行組織塊消化。分別在消化4、8、12、16、20和24 h后，用70 μm的細胞篩過濾細胞，將過濾出的細胞懸液1 200 r/min離心10 min。棄上清，加入完全培養(yǎng)基[包含10%(體積分數(shù))FBS和1%(質(zhì)量分數(shù))青/鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基]，吹打混勻細胞懸液加入細胞培養(yǎng)瓶中，放入5%(體積分數(shù))CO237 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度達到80%融合，用0.25%(質(zhì)量分數(shù))-EDTA的胰酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.3 α-SMA免疫熒光細胞鑒定

將培養(yǎng)到第 4代狀態(tài)穩(wěn)定后的子宮平滑肌瘤細胞，用含DMEM-F12完全培養(yǎng)基制備細胞懸液，接種于放置細胞爬片的24孔細胞培養(yǎng)板中，放入5%(體積分數(shù))CO237 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h；細胞貼壁后，加入完全培養(yǎng)基1 mL繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出培養(yǎng)板 PBS 漂洗3次，每次3 min。用4%(質(zhì)量分數(shù))多聚甲醛室溫固定20 min，PBS 漂洗3次，每次3 min。0.3%(體積分數(shù)) Triton X-100 室溫下破膜20 min，PBS漂洗3次。用10%(體積分數(shù))山羊血清的PBS，37 ℃封閉30 min；10%(體積分數(shù))山羊血清稀釋的一抗α-SMA抗體(1∶200)放置4 ℃孵育過夜；37 ℃復(fù)溫30 min，用PBS漂洗3次，每次5 min；加入10%(體積分數(shù))山羊血清稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗鼠(1∶200)，37 ℃避光孵育1 h，PBS 漂洗3次，每次5 min；向細胞爬片上滴加50 μL DAPI 染核5 min，PBS漂洗3次，每次5 min；用抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)48 h鏡下細胞密度和狀態(tài)

膠原酶消化組織塊4、8、12、16、20和24 h分別37 ℃ 5%(體積分數(shù))CO2，95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察拍照細胞密度和狀態(tài)。在膠原酶消化組織塊4h，細胞密度較低，隨著時間延長細胞密度增加，消化16 h細胞密度最大，之后20 h和24 h細胞密度下降。如圖顯示以I型膠原酶消化16 h獲取的細胞數(shù)目最多。培養(yǎng)48 h細胞可見：細胞均貼壁生長，基本形態(tài)呈梭形或分枝狀(圖1)。

圖1 組織消化不同時間點提取的原代子宮平滑肌瘤細胞(10×)Fig.1 Primary uterine leiomyoma cells extracted at different time points with tissue digestion methods

2.2 培養(yǎng)7 d鏡下細胞密度和狀態(tài)

光學(xué)顯微鏡下觀察，可以看到高密度細胞生長速度快，培養(yǎng)7 d，細胞基本均勻平鋪鋪滿，細胞排列規(guī)整緊密，條束狀；低密度細胞生長速度較慢，7 d可見細胞分枝狀、不規(guī)則狀，細胞空間充足，單個細胞伸展體積大，胞質(zhì)豐富(圖2)。

圖2 不同密度肌瘤細胞培養(yǎng)7 d形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of HuLM cells with different densities cultured for 7 daysHuLM： human uterus leiomyoma.

2.3 培養(yǎng)12 d鏡下細胞密度和狀態(tài)

光鏡下觀察，當(dāng)細胞密度達到完全融合后，細胞未表現(xiàn)出顯著的接觸抑制，表現(xiàn)為規(guī)則呈簇的平鋪疊層束狀生長，部分細胞單層排列，部分細胞多層重疊呈整齊的束狀帶排列，整體上表現(xiàn)出典型的峰谷狀。作為良性腫瘤，細胞接觸抑制不顯著，當(dāng)細胞鋪滿后，營養(yǎng)成分的匱乏，單層細胞區(qū)首先出現(xiàn)生長抑制，多層細胞束狀帶繼續(xù)維持束狀生長，這與子宮肌瘤體內(nèi)生長特性及其類似(圖3)。

圖3 培養(yǎng)12 d細胞形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of HuLM cells with different densities cultured for 12 daysHuLM： human uterus leiomyoma.

2.4 免疫熒光α-SMA細胞鑒定

高倍鏡和低倍鏡下均觀察到所有細胞的DAPI染細胞核和α-SMA染色細胞能全部擬合，所有的細胞均為子宮平滑肌瘤細胞(圖4)。

圖4 光學(xué)顯微鏡下免疫熒光檢測細胞α-SMA表達Fig.4 Detection of α-SMA expression in HuLM cells by immunofluorescenceα-SMA： alpha-smooth muscle actin;HuLM： human uterus leiomyoma.

3 討論

醫(yī)學(xué)研究中很多至關(guān)重要的實驗無法在人體內(nèi)進行，體外原代細胞培養(yǎng)彌補了這一缺陷。子宮肌瘤是單克隆腫瘤，取材來自單發(fā)的肌瘤組織，獲取的原代子宮肌瘤細胞，成分單一，離體時間短，具備體內(nèi)生理狀態(tài)下細胞的結(jié)構(gòu)和功能，體外培養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定，消除了神經(jīng)、體液及激素等因素的影響等優(yōu)點，因此獲取子宮肌瘤原代細胞進行體外實驗，在研究子宮肌瘤的發(fā)病機制、新藥研發(fā)及藥物作用機制等方面都有很好的應(yīng)用價值[16]。

子宮平滑肌瘤原代細胞存在培養(yǎng)和純化困難等問題，影響子宮平滑肌瘤體外實驗研究。研究[17-18]顯示，子宮肌瘤細胞的原代細胞的常用的獲取方法有組織塊貼壁法和消化法，采用組織塊貼壁法，需要1個月長出第一代，存在耗時長，污染風(fēng)險大等問題，不能滿足實驗基本需求，本研究未涉及。膠原酶消化法周期短，獲取細胞數(shù)目多，本研究針對消化法進行原代細胞獲取方法的實驗探索。消化法獲取細胞的關(guān)鍵是膠原酶的消化時間，常用Ⅰ型膠原酶或Ⅱ型膠原酶消化4、6、13 h不等[19-21]。本研究采用Ⅰ型膠原酶對子宮肌瘤組織的消化時間進行了系列實驗對子宮肌瘤的細胞獲取的消化條件，最佳消化時間進行探索。實驗結(jié)果表明在消化的2 h內(nèi)未取到細胞，在4 h內(nèi)獲取少量的子宮平滑肌瘤細胞，并且含有很多未消化完全的絮狀物，隨著消化時間延長獲取的細胞數(shù)增多，至16 h膠原酶消化的組織懸液，未見黏有絮狀物，獲取的細胞數(shù)達到最多，在消化20 h和24 h，獲取細胞數(shù)明顯減少，可能是由于膠原酶對細胞的消化損害，導(dǎo)致細胞數(shù)目減少。由此，可得出結(jié)論，用0.2%(質(zhì)量分數(shù))的Ⅰ型膠原酶對子宮平滑肌瘤組織消化，在組織和膠原酶體積比1∶10情況下，獲取原代子宮肌瘤細胞的最佳消化時間是16 h。

原代細胞源自剛剛離體的組織，由于機體組織的復(fù)雜性，提取的細胞往往含有組織纖維結(jié)構(gòu)、血管等成分，原代細胞的純化是一大挑戰(zhàn)。只有細胞純度達到95%以上才能保證細胞穩(wěn)定傳代、生物學(xué)特性穩(wěn)定性、實驗可重復(fù)性，才能進行后續(xù)實驗研究[18]。本研究用肌瘤組織提取細胞中含雜細胞較多，可能混合血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、血細胞等，血細胞不貼壁，內(nèi)皮細胞和成纖維細胞用0.25%(質(zhì)量分數(shù))EDTA的胰酶很容易消化下來，肌瘤細胞貼壁牢固，消化時間長3～5 min，早期消化下來的細胞受到胰酶的損害，細胞狀態(tài)差，經(jīng)反復(fù)傳代培養(yǎng)，子宮肌瘤細胞得到純化。子宮肌瘤細胞屬于平滑肌細胞，能特異性表達α-SMA[22]，本研究采用抗平滑肌細胞特異性抗體抗α-SMA抗體，用免疫熒光技術(shù)進行細胞鑒定，結(jié)果顯示，實驗獲取的子宮肌瘤細胞純度高達到95%以上，幾乎不含雜細胞，滿足實驗要求及后續(xù)研究的應(yīng)用，說明采用差速消化法可將雜細胞去除。

體外實驗需要在適宜的環(huán)境生長，本身受到各種不同于體內(nèi)因素的干擾。作為原代細胞，由于其體外培養(yǎng)有自身的局限性而且隨著傳代時間延續(xù)，細胞結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性可能發(fā)生變化[23]，而細胞研究對細胞培養(yǎng)的狀態(tài)和穩(wěn)定性有很高的要求，在細胞最佳狀態(tài)下的實驗研究才有意義。細胞狀態(tài)和生長周期密切相關(guān)，鑒于良性腫瘤和惡性腫瘤的顯著差異，及原代細胞和細胞系的顯著區(qū)別，本研究針對原代良性腫瘤細胞的獲取方法進行優(yōu)化，并對這一優(yōu)化方法培養(yǎng)的細胞進行不同時間細胞狀態(tài)和形態(tài)學(xué)特征分析，為后續(xù)實驗的繼續(xù)培養(yǎng)提供參考依據(jù)。

關(guān)于子宮肌瘤原代培養(yǎng)的文獻[20-23]報道很多，但如何獲得數(shù)量多、純度高的子宮肌瘤細胞仍是關(guān)鍵問題。本研究經(jīng)過一系列實驗、觀察，對人子宮肌瘤原代細胞的分離與培養(yǎng)的方法進行了探索，總結(jié)出一種穩(wěn)定可靠的子宮肌瘤原代細胞培養(yǎng)方法。通過對子宮肌瘤細胞的體外培養(yǎng)方法探索，優(yōu)化了子宮肌瘤原代細胞的培養(yǎng)和純化方法，培養(yǎng)出數(shù)量多、純度高的子宮肌瘤細胞，并對細胞不同狀態(tài)的形態(tài)特征進行描述，為子宮肌瘤細胞進一步研究提供了實用的實驗方法和可靠的參考依據(jù)。