IVF治療中卵丘顆粒細(xì)胞密度對胚胎學(xué)結(jié)局的影響

董 競 吳 鈴 趙激浪 歐陽杰 凡 永 呂祁峰 李孟惠 李 斌

進(jìn)行體外授精時，受精及早期胚胎質(zhì)量將直接影響不孕癥患者的治療結(jié)局。常規(guī)體外受精-胚胎移植(IVF-ET)操作中，卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物(cumulus-oocyte complex, COC)將直接與數(shù)量合適的精子進(jìn)行共同孵育過夜，第2天去除卵丘細(xì)胞后觀察原核形成及早期胚胎發(fā)育情況[1]。在這個過程中，因延長了精卵共同孵育的時間，死亡的精子及受精過程中大量散落的卵丘細(xì)胞可能會產(chǎn)生一些不利于早期胚胎發(fā)育的物質(zhì)，如氧化自由基等，從而影響體外胚胎的發(fā)育[2]。此外，過多的精子和卵丘細(xì)胞也會大量消耗掉培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分，從而對早期的胚胎造成不良的影響。短時授精研究發(fā)現(xiàn)，縮短精卵共育的時間不會影響受精率，可提高胚胎發(fā)育質(zhì)量[3～5]。但有研究認(rèn)為，卵母細(xì)胞過早的脫離卵丘細(xì)胞存在的微環(huán)境會對其成熟、受精產(chǎn)生不利的影響，保留卵丘細(xì)胞能夠增加卵子受精后的胚胎發(fā)育能力，提高胚胎利用率和臨床妊娠率[2，6]。現(xiàn)有研究多集中在通過減少精卵共育的時間來改善臨床結(jié)局，但I(xiàn)VF授精時，卵丘顆粒細(xì)胞存在的密度對胚胎學(xué)結(jié)局的影響尚未引起關(guān)注。本研究旨在探討傳統(tǒng)IVF授精時，COC上卵丘顆粒細(xì)胞密度對胚胎學(xué)結(jié)局的影響。本文將通過受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、卵子利用率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率等多種指標(biāo)來評價IVF授精時，卵丘細(xì)胞的多寡對胚胎學(xué)和胚胎移植結(jié)局的影響。

對象與方法

1.研究對象：回顧性分析2016年11月～2017年5月(對照組)和2017年11月～2018年5月(研究組)在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院輔助生殖科接受體外受精-胚胎移植治療的不孕癥患者710例?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：首次IVF周期患者；年齡≤35歲；基礎(chǔ)卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)<10IU/L；竇卵泡數(shù)≥5個；獲卵數(shù)≤15個。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重的內(nèi)外科系統(tǒng)性疾病不適宜接受促排卵治療及不能耐受妊娠患者；有高泌乳素血癥及產(chǎn)生高雄激素的其他內(nèi)分泌疾病，如卵巢和腎上腺腫瘤等。對照組按照1∶1與研究組根據(jù)年齡、不孕年限和體重指數(shù)等患者基本資料進(jìn)行傾向得分匹配[7]。本研究嚴(yán)格遵守《赫爾辛基宣言》并得到醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會的審批，參與對象均簽署知情同意書。

2.超促排卵及取卵：按本中心孕激素促排卵方案進(jìn)行促排[8]。從月經(jīng)周期的第3～5天開始促排，在促排7～8天后，陰道超聲監(jiān)測卵泡的發(fā)育情況，并進(jìn)行性激素水平的測定，根據(jù)卵泡的發(fā)育情況及血清中的激素水平，調(diào)整用藥量，當(dāng)有1個以上卵泡的直徑達(dá)到20mm或者3個以上的卵泡直徑達(dá)到18mm以上時扳機(jī)，扳機(jī)34～36h后在陰道超聲引導(dǎo)下行取卵術(shù)。

3.剝除卵丘細(xì)胞：先用巴斯德管將取到的COCs在2ml G-IVF(瑞典Vitrolife公司)中洗去殘留紅細(xì)胞，隨后轉(zhuǎn)入含1ml G-IVF的Falcon 353037培養(yǎng)皿(美國Corning公司)中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育3～4h。授精操作前，先在無菌大皿Falcon 353003中做一個200μl G-IVF的液滴，再將待切除卵丘顆粒細(xì)胞的COCs轉(zhuǎn)入液滴中(≤5個COCs)，用1ml BD注射器在COC周圍呈井字形切割4下(圖1)，切除卵母細(xì)胞周圍約80%的卵丘顆粒細(xì)胞后，隨后將處理好的COC轉(zhuǎn)入含1ml G-IVF的Falcon 353037培養(yǎng)皿中，等待加精。重復(fù)上述操作，將所有需要切除卵丘顆粒細(xì)胞的COCs處理完畢。上述所有操作均是在37℃，6% CO2的操作箱(美國Astec公司, ss-250)中進(jìn)行。

圖1 卵丘顆粒細(xì)胞部分去除前后的比較(×4)A.顆粒細(xì)胞部分去除前；B.顆粒細(xì)胞部分去除后；C.切卵丘示意圖

4.精液處理與體外受精：男方取卵日手淫法取精，密度梯度離心聯(lián)合上游法優(yōu)化處理精液，隨后將精子置入37℃、6% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育備用。取卵后3～4h，去除和未去除部分卵丘顆粒細(xì)胞的卵子行常規(guī)IVF授精。COC均置于盛有1ml G-IVF的Falcon 353037培養(yǎng)皿中，加入經(jīng)密度梯度離心后優(yōu)選的精子，孵育過夜后，觀察原核。

5.胚胎培養(yǎng)與觀察：授精后約16～18h觀察受精情況，72h觀察胚胎卵裂情況。采用Cummins′標(biāo)準(zhǔn)對第3天胚胎進(jìn)行評級[9]。其中Ⅰ級和Ⅱ級胚胎作為優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行冷凍保存；Ⅲ級和Ⅳ級胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚期。囊胚采用Gardner和Schoolcraft評分系統(tǒng)進(jìn)行評級。在第5天或第6天，只有3BC級或更高級別的胚胎被冷凍，而囊胚在第7天至少達(dá)到3CC才有資格被冷凍。胚胎冷凍根據(jù)既有方法采用Cryotop進(jìn)行[10]。

6.胚胎移植與妊娠結(jié)果判斷：筆者所在中心常規(guī)采用凍融胚胎移植(FET),胚胎移植的內(nèi)膜準(zhǔn)備主要有自然周期、微刺激和激素替代3種方式，均按筆者所在中心常規(guī)進(jìn)行[11]。胚胎移植操作均在超聲監(jiān)測下進(jìn)行，移植后14天行尿hCG檢測，陽性為生化妊娠，再經(jīng)14天行陰道超聲檢查，見孕囊者為臨床妊娠。

結(jié) 果

1.患者基本資料：經(jīng)過傾向得分匹配后共入選710個周期，研究組和對照組各355個周期。兩組患者的年齡、不孕年限、體重指數(shù)、基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)LH、不孕原因和平均獲卵數(shù)等基本資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 患者的基本資料

2.IVF治療時降低卵丘顆粒細(xì)胞密度對患者受精和胚胎發(fā)育的影響:研究組的受精率、正常受精率、有效成囊率和卵子利用率均高于對照組相應(yīng)指標(biāo)(P<0.01)，異常受精率則低于對照組(P<0.01)。兩組間卵裂率和優(yōu)胚率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表2。

表2 兩組患者受精和胚胎發(fā)育的比較[%(n/N)]

3.IVF治療時不同COC授精密度下卵丘顆粒細(xì)胞密度對胚胎學(xué)結(jié)局的影響：研究組(切除COC上部分卵丘顆粒細(xì)胞)中按授精卵數(shù)分為低密度(1～5個)、中密度(6～10個)和高密度(11～15個)3組分別與對照組相應(yīng)授精卵密度的患者進(jìn)行比較，以分析不同授精密度情況下卵丘顆粒細(xì)胞密度對受精和胚胎發(fā)育的影響。3個授精密度組內(nèi)，研究組和對照組患者的年齡、不孕年限、體重指數(shù)、基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)LH、不孕原因和平均獲卵數(shù)等基本資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表3)。

項目低密度(1～5個)中密度(6～10個)高密度(11～15個)對照組研究組對照組研究組對照組研究組周期數(shù)7979153153123123年齡(歲)32.56±2.1932.00±2.0632.09±2.2231.87±2.5231.60±2.1331.59±2.44不孕年限(年)3.80±2.353.14±1.933.15±2.013.23±1.893.03±1.663.53±2.01體重指數(shù)(kg/m2)22.28±3.7022.66±4.0421.86±3.2422.39±3.4021.59±2.7821.72±2.74基礎(chǔ)FSH(IU/L)6.21±1.755.76±1.415.57±1.305.77±1.205.45±1.115.42±1.03基礎(chǔ)LH(IU/L)3.37±2.213.93±3.083.65±2.074.04±2.133.96±2.144.05±2.26不孕原因 輸卵管因素41(51.90)44(55.70)96(62.75)108(70.59)75(60.98)88(71.54) 排卵障礙4(5.06)2(2.53)3(1.96)2(1.31)5(4.07)7(5.69) 子宮內(nèi)膜異位癥4(5.06)3(3.80)9(5.88)6(3.92)01(0.81) 混合因素26(32.91)28(35.44)36(23.53)31(20.26)37(30.08)21(17.07) 不明原因4(5.06)2(2.53)9(5.88)6(3.92)6(4.88)6(4.88)獲卵數(shù)3.46±1.343.48±1.438.16±1.368.03±1.3412.81±1.4412.81±1.33

當(dāng)COC授精密度≤5個時，研究組和對照組之間受精率、正常受精率、異常受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、有效成囊率和卵子利用率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)COC授精密度>5個時，研究組的正常受精率、有效成囊率和卵子利用率顯著高于對照組(P<0.05)，異常受精率顯著低于對照組(P<0.05)，其中當(dāng)COC授精密度>10個時，研究組的受精率、正常受精率、異常受精率、有效成囊率和卵子利用率與對照組的比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，詳見表4。

表4 不同授精密度情況下兩組患者受精和胚胎發(fā)育的比較[%(n/N)]

4.IVF治療時降低卵丘顆粒細(xì)胞密度對患者胚胎移植結(jié)局的影響:研究組和對照組分別進(jìn)行了449和387個FET周期，研究組和對照組的生化妊娠率、臨床妊娠率、宮外孕率、流產(chǎn)率、種植率、活產(chǎn)率、繼續(xù)妊娠率等比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；研究組的新生兒孕周、出生體重和出生缺陷率與對照組相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表5。

表5 兩組患者FET結(jié)果的比較

討 論

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，人們不斷探索如何改進(jìn)實驗方法以獲取更高的受精率、更優(yōu)質(zhì)的胚胎及更高的臨床妊娠率。本研究旨在了解IVF治療時卵丘顆粒細(xì)胞存在的密度對早期胚胎發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)在IVF授精前通過切除部分卵丘顆粒細(xì)胞降低其密度可顯著提高卵子的正常受精率、降低異常受精率，改善早期胚胎質(zhì)量，增加患者卵子利用率，而對胚胎移植結(jié)果沒有明顯影響。

卵丘顆粒細(xì)胞可分泌雌二醇(estradiol, E2)及孕酮(progesterone, P4)，常規(guī)IVF受精過程中大量顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的高水平的E2、P4對胚胎具有直接的毒性作用[12，13]。卵丘顆粒細(xì)胞還可產(chǎn)生大量的活性氧類物質(zhì)(reactiveoxygenspecies, ROS)，引起細(xì)胞膜流動性降低，促使DNA碎片形成和胚胎發(fā)育停止，導(dǎo)致透明帶硬化，影響胚胎正常孵出，降低胚胎的生存能力[14，15]。此外體外培養(yǎng)過程中大量顆粒細(xì)胞也會消耗培養(yǎng)液中的營養(yǎng)，使卵子處于一個相對營養(yǎng)不足的環(huán)境中。為減少卵丘顆粒細(xì)胞代謝產(chǎn)物對卵子及受精卵可能產(chǎn)生的負(fù)面影響，本研究在授精前切除過多的顆粒細(xì)胞以降低其密度，在保證受精時間的同時，降低卵子、受精卵周圍不良代謝產(chǎn)物的濃度，減少對授精液營養(yǎng)成分的消耗。Gianaroli等[3]研究發(fā)現(xiàn)，減少COC暴露于授精液中的時間后，受精率和種植率都顯著提高，表明減少COC暴露于授精液中的時間有利于胚胎發(fā)育。

多項研究認(rèn)為短時受精有利于胚胎質(zhì)量及種植潛能的提高，是減少了卵丘或精子代謝廢物對卵子產(chǎn)生的潛在損害，這與本研究有異曲同工之效[16～18]。但是史鴻志等[19]研究發(fā)現(xiàn)，過夜受精在受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率等指標(biāo)上甚至優(yōu)于短時受精聯(lián)合補(bǔ)救ICSI，因為過夜受精減少了體外操作和暴露時間，一些卵母細(xì)胞在過夜培養(yǎng)過程中胞質(zhì)和胞核達(dá)到了更好的成熟狀態(tài)，且在一個合適的受精濃度范圍內(nèi)，精卵作用時間的延長并不產(chǎn)生負(fù)面的影響，反而為卵母細(xì)胞提供了更多的優(yōu)質(zhì)精子選擇。本研究通過在授精前切除COC上部分卵丘顆粒細(xì)胞以降低其密度的方法，讓卵子在過夜受精的同時又減少了卵丘顆粒細(xì)胞代謝廢物對卵子產(chǎn)生的潛在損害，研究結(jié)果證明了此授精方案的有效性，未來將需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并進(jìn)行隨機(jī)對照研究來探索授精前切除部分顆粒細(xì)胞對卵子受精和胚胎發(fā)育的影響。

既然授精過程中卵丘顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的代謝廢物會影響受精和胚胎發(fā)育，那么IVF授精時授精皿中不同的COC密度就會造成卵丘顆粒細(xì)胞密度的不同，可能會影響卵子受精和胚胎發(fā)育。因此本研究將入組患者按照IVF授精時授精皿內(nèi)卵子數(shù)分組，分析不同授精密度下不同卵丘顆粒細(xì)胞密度對受精結(jié)果和早期胚胎發(fā)育的影響。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)COC授精密度≤5個時，研究組和對照組之間受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、有效成囊率和卵子利用率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果與劉曉妍等[20]研究結(jié)果一致，該研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)授精密度為1～4個卵子時，授精前剝除部分卵丘細(xì)胞不會影響IVF的受精結(jié)局；當(dāng)COC授精密度>5個以后，研究組的正常受精率、有效成囊率和卵子利用率均顯著高于對照組的相應(yīng)指標(biāo)，異常受精率也顯著低于對照組；當(dāng)COC授精密度>10個時，研究組的受精率、正常受精率、異常受精率、有效成囊率和卵子利用率與對照組的差異愈加顯著(P<0.01)。結(jié)果表明，卵丘顆粒細(xì)胞的高密度存在可能產(chǎn)生了有害的代謝物質(zhì)影響了受精和胚胎發(fā)育，通過切除COC上部分卵丘顆粒細(xì)胞降低其密度后，能有效改善胚胎學(xué)結(jié)局，同時這種改善作用隨著授精密度增加更加顯著。

IVF治療的臨床結(jié)局是醫(yī)患共同關(guān)心的問題。本研究發(fā)現(xiàn)研究組和對照組的生化妊娠率、臨床妊娠率、宮外孕率、流產(chǎn)率、種植率和活產(chǎn)率等比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，兩組的新生兒孕周、出生體重和出生缺陷率也相似，說明IVF授精過程中降低卵子周圍顆粒細(xì)胞的密度不會對胚胎移植結(jié)局造成影響。

本研究未全部剝除而只是部分切除卵丘顆粒細(xì)胞，是因為卵丘顆粒細(xì)胞對卵母細(xì)胞與精子結(jié)合有重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，卵丘顆粒細(xì)胞具有參與精子與卵母細(xì)胞的相互識別、維持精子運動活力、引導(dǎo)精子到卵母細(xì)胞、誘導(dǎo)精子獲能和頂體反應(yīng)、防止透明帶硬化、提高精子的體外受精等能力。Fatechi等[21]和Li等[22]的研究表明，卵丘顆粒細(xì)胞的存在增加卵母細(xì)胞的體外受精率、卵裂率和胚胎后續(xù)發(fā)育能力，這說明卵丘顆粒細(xì)胞的存在不僅影響精卵結(jié)合，而且對卵母細(xì)胞的成熟以及受精卵的進(jìn)一步發(fā)育具有重要的影響。另有研究發(fā)現(xiàn)，全部除去卵丘顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞形成雌雄原核的能力受到了損傷，并有較高的多精受精率，提示卵丘顆粒細(xì)胞的存在有助于雌雄原核的形成及防止多精受精。

綜上所述，本研究結(jié)果表明通過切除COC上的卵丘顆粒細(xì)胞以降低其密度，能夠改善患者IVF治療時的胚胎學(xué)結(jié)局。