胃癌干細胞標志物的研究進展

代俊澤 金海峰 (延邊大學 醫(yī)學院，吉林 延吉 3300；附屬醫(yī)院內(nèi)科教研室)

胃癌(GC)在全部惡性腫瘤中的致死率常年居高不下(排名前3)。早期GC的發(fā)生發(fā)展通常沒有明顯病癥，這就造成了許多患者發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)處于晚期，無法進行治療或治療無效。有調(diào)查顯示，在2018年GC新病例超過1 000 000例，并估計有783 000例患者死亡〔1〕。隨著近代醫(yī)學的日益更新，對腫瘤本質(zhì)的掌握也更加透徹，于是出現(xiàn)了癌癥干細胞(CSC)理論。近年愈來愈多的實驗也表明，胃干細胞的定位與GC發(fā)生地點相互吻合，意味著可以從干細胞疾病的治療方向入手來治療GC。目前，GC的治療仍以傳統(tǒng)的放射線療法和化學療法為主，但此方案的短板是不能完全消除CSC。因此，探索穩(wěn)定性高、特異性強并檢測難度小的GC干細胞(GCSC)標志物，或許能為消滅癌癥、根治GC提供一種全新的方案。此文針對現(xiàn)階段研究較多或較成熟的GCSC標志物作一綜述，提出較新穎、潛力大的治療方案。

1 CSC

大多數(shù)腫瘤是由一個細胞亞群結(jié)合而來，這個亞群最大的特點就是具有干細胞特性，稱為CSC。CSC對整個腫瘤的生命起關(guān)鍵作用，采用自我無限增殖方式來影響腫瘤的啟動、發(fā)展及治療后復發(fā)概率。CSC的起源包括以下幾種：①惡性腫瘤的實質(zhì)細胞；②協(xié)助或誘發(fā)腫瘤擴散的細胞；③因耐藥性而誘發(fā)或復發(fā)的因素〔2〕。相關(guān)研究數(shù)據(jù)〔3，4〕也表明，CSC可誘導腫瘤的發(fā)生，并在隨后的轉(zhuǎn)移、治療(放療或化療)中起決定性作用。綜上可見，CSC是腫瘤增殖引發(fā)劑之一，現(xiàn)階段普遍認同通過此靶點治療效果優(yōu)于傳統(tǒng)治療方案。

2 GCSC標志物

現(xiàn)階段GCSC標志物主要包括造血干細胞抗原(CD133)等(表1)。其中主要參與癌癥發(fā)生、發(fā)展的有CD133、富含亮氨酸重復序列的G蛋白耦聯(lián)受體(Lgr)5、上皮細胞黏附因子(EpCAM)等；CD44、miRNA、性別決定區(qū)Y框蛋白(SOX)2對胃癌的轉(zhuǎn)移及侵襲影響較大；作用于癌癥預后主要有CD44、三磷酸腺苷酶結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白G亞家族成員(ABCG)2等；CD24、乙醛脫氫酶(ALDH)1等可增強癌癥組織對藥物的耐藥性。以上通常可用于鑒別和分離GCSC。

表1 GCSC相關(guān)生物學標記物

2.1CD133 CD133約120 kD，是一種單拷貝基因產(chǎn)物，主要局限于腫瘤組織表達，在癌后病變的階段沿黏膜內(nèi)癌和結(jié)締組織之間的邊界表達〔5〕。它被普遍發(fā)現(xiàn)于多種惡性腫瘤的，鑒于此并在相關(guān)實驗中加以使用〔6～8〕。以GC為例，陸瑞祺等〔9〕的研究發(fā)現(xiàn)，在原發(fā)性GC的黏膜和黏膜下層細胞膜上均可見CD133的表達，并且表達程度相較于癌旁正常胃組織顯著上移(P<0.05)。并且CD133+子集細胞可以在人類GC中分離、純化和擴增。此外，也具有如提高體內(nèi)的致瘤能力等。因此，可以表達一些干細胞標記。

此外，CD133還是良好的預后標志〔10〕。Chen等〔11〕實驗顯示，高水平的CD133患者的預后較低水平患者明顯降低(P<0.001)，由此說明，CD133可成為獨立預后因素，Liu等〔12〕實驗表明，CD133+可以預測GC患者的存在或即將出現(xiàn)的臨床病理特征和較差的生存率。此外，CD133也可能在GC的病理生理，整合和補充中起關(guān)鍵作用。

5-氟尿嘧啶(Fu)化療是GC晚期的一種首選治療方案，但其有效性受到耐藥性的限制。同時也存在實驗〔13，14〕表明，CD133可以通過調(diào)節(jié)GC細胞中磷酸肌醇3-激酶/Akt/p70S6K途徑介導的P-gp和Bcl-2家族的表達來抑制5-Fu誘導的凋亡。Xu等〔15〕實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)5-Fu的化療后，剩余的GC組織中B淋巴瘤Mo-MLV插入?yún)^(qū)(BMI)1(參與CSC維持的關(guān)鍵分子)的表達增加了。并且，基于5-Fu的新輔助治療后接受手術(shù)的GC患者BMI1表達與無病生存之間存在直接關(guān)系。由此，提示BMI1也是一種潛在的應用價值較大的靶向治療方向。

以上研究均證明CD133可作為GC鑒別、診斷及預后的重要生物指標，并對GC患者開發(fā)新的治療方案起到一定的作用，但涉及的具體調(diào)節(jié)機制仍需進一步探究。

2.2CD44 CD44基因高度保守，相對分子質(zhì)量為85～200 kD，位于第11號染色體上。CD44家族包括普遍表達的標準CD44(CD44s)和在角質(zhì)形成細胞(CD44v3-v10)，上皮細胞(CD44v8-v10)及活化的淋巴細胞和巨噬細胞(CD44v6)中具有特定分布的CD44剪接變體(CD44v)。

Mayer等〔16〕最先發(fā)現(xiàn)，CD44的表達在GC患者中預示著癌癥發(fā)展惡劣。這一點在后來相關(guān)研究〔17，18〕中也得到了證實。此外，大量實驗〔19～21〕進一步觀察到CD44及CD44v6具有正向調(diào)節(jié)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移的意義，且與GC患者預后較差有關(guān)。這顯示CD44和CD44v6可能均是GC患者有效的鑒別或預后的生物標志物。AT-hook2(HMGA2)是一種高遷移率的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑，可在CSC中介導運動性和自我更新。Sun等〔22〕實驗發(fā)現(xiàn)，HMGA2可通過調(diào)節(jié)CD44的表達來促進GCSC誘導和細胞運動。因此，在GC中靶向HMGA2可對治療提供了新的方向。

目前，隨著生物材料工程學的進步，允許在水凝膠中設計模仿重要腫瘤樣特征的三維(3D)培養(yǎng)物，從而揭開傳統(tǒng)2D塑料表面無法觀察到的癌細胞行為。在3D培養(yǎng)物中，GC細胞失去了標準CD44同種型(CD44s)的表達，而獲得了CD44變體6(CD44v6)的表達。并且這種剪接開關(guān)是可逆的，由于營養(yǎng)缺乏而加速，并在較低的初始細胞密度下延遲，提示環(huán)境脅迫誘導的應答。進一步顯示它依賴于水凝膠基質(zhì)的機械性能，并伴隨著上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，代謝和血管生成的基因上調(diào)〔23〕。這項研究提供了一種新的模型系統(tǒng)來研究CD44功能障礙，其在癌癥中的作用已受到關(guān)注數(shù)十年。

2.3CD24 CD24又命名為熱穩(wěn)定抗原(HSA)，為一種細胞黏附分子存在或表達于許多B淋巴細胞和分化神經(jīng)母細胞表面。CD24在不同種腫瘤中的表達也不盡相同，如宮頸癌中表達程度顯著大于乳腺癌。

Wang等〔24〕和Zhao等〔25〕實驗發(fā)現(xiàn)，CD24可促進細胞侵襲并調(diào)節(jié)GC細胞中E-鈣黏蛋白，纖連蛋白和維生素D受體的表達進而促進GC發(fā)生并促進侵襲來誘導GC發(fā)展。同時，Jiao等〔26〕研究也發(fā)現(xiàn)，CD24參與人GC細胞系A(chǔ)GS的增殖，侵襲和化學敏感性，而CD24蛋白表達的下調(diào)降低了GC細胞的轉(zhuǎn)移潛能并增加了化學敏感性。Xu等〔15〕的研究證明，5-FU耐藥的人GCSC樣細胞的 CD133和CD44高表達及CD24低表達參與GC的發(fā)生發(fā)展及治療后復發(fā)。以上研究均證明CD24 高表達可作為GC細胞中的CSC標志，同時表達水平的高低也可被認為是獨立的預后因素。此外，在Jia等〔27〕實驗發(fā)現(xiàn)，CD24基因中的P-534位點影響了GC總體生存，提示可從此位點入手，為臨床胃癌的診斷、預后等提供了新思路。

2.4Lgr5 Lgr5是Wnt通路的靶基因?？捎糜跇擞浳干掀ぷ婕毎gr5在胃CSCs的維持中具有至關(guān)重要的作用〔28，29〕，有可能是GC潛在治療靶點。Simon等〔30〕和Liu等〔31〕實驗發(fā)現(xiàn)，Lgr5高表達與總生存率低顯著相關(guān)，且Lgr5+GC患者的中位生存期(28.0±8.6)個月比Lgr5-患者(54.5±6.3)個月短，提示高Lgr5與GC患者預后不良有關(guān)。大量研究〔32～34〕表明，形成腫瘤球的標本中GC細胞表達高Lgr5。Lgr5陽性GC細胞的選擇性耗竭導致GC細胞的生長明顯被抑制，提示Lgr5非常有希望成為GC潛在干細胞標志物。此外，相關(guān)研究〔35～37〕發(fā)現(xiàn)，高表達的Lgr5與腫瘤的TNM階段、大小、浸潤深度等并無聯(lián)系，與患者年齡與GC類型存在很大的關(guān)系。Lgr5可能參與了GC發(fā)生過程中的腸上程度皮化生。這種病理分型的差異，對制定GC恰當治療方案具有現(xiàn)實意義。

同時，Lgr5的表達具有空間性和時間性〔30〕。在非腫瘤性胃黏膜中，LGR5+細胞主要定位在黏液頸部。在腸上皮化生中，LGR5+細胞主要定位隱窩底部，但在GC中，LGR5陽性細胞定位于腫瘤中央?yún)^(qū)域和管腔表面部位。LGR5在GC的腫瘤中心表達與腫瘤的局部生長(T類)和淋巴結(jié)擴散(N類)顯著相關(guān)，這也為GC的靶向治療方法提供了新思考方向。

2.5EpCAM EpCAM由GA-733-2基因編碼，其胞內(nèi)區(qū)域有26個氨基酸殘基，胞外區(qū)域有265個氨基酸殘基組成的兩個生長因子樣結(jié)構(gòu)，分子量為40 kD。

Warneke等〔38〕實驗發(fā)現(xiàn)，EpCAM信號通路中的所有成員均在GC中表達。并且，該表達彼此之間以及與各種臨床病理患者特征(包括患者的存活)顯著相關(guān)。由此說明，EpCAM信號通路是GC中比較理想的治療靶標。其他相關(guān)實驗〔39～42〕也表明，GC組織中的EpCAM表達上調(diào)，并與GC的大小及擴散呈現(xiàn)一定聯(lián)系，可能預示預后較差。這意味著EpCAM可能作為一種新的預后因素。Chen等〔43〕調(diào)查進一步證實，EpCAM與腫瘤的進一步惡化發(fā)展相關(guān)，低表達更有利于患者的預后。因此，它可作為獨立的預后因素。以上均說明 EpCAM可作為 CSC 標志物在預后方面的價值，對GC具有重要意義。

2.6ABCG2 ABCG2被稱為與人類腫瘤中多藥耐藥性相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，能夠拮抗部分化療藥物的抗腫瘤作用〔44，45〕。它屬于ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族的一位成員。

在Wang等〔46〕調(diào)查中，通過對NCBI GEO數(shù)據(jù)庫中19 826個樣本進行分析，觀察到ABCG2經(jīng)常在GCCG中異常表達，并與GC的臨床病理特征和不良的預后有關(guān)。同時還發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的GC啟動子CRKL與ABCG2呈顯著正相關(guān)，很可能是上游CRKL的靶標，提示可以從此方向進一步研究其用于GC診斷和治療。研究表明〔47〕，ABCG2 表達異常增高，這也就意味著腫瘤患者術(shù)后復發(fā)概率很大，并且在治療后整個也會遇到許多問題。

SP細胞是腫瘤起始細胞的一個細胞亞群。ABCG2賦予了SP細胞的大部分形態(tài)，即CSC。通過Nishii等〔48〕實驗，GCSP細胞接種產(chǎn)生的Oct3和Sox2的表達增加，提示ABCG2聯(lián)合SP細胞檢測可進一步純化GCSC。

2.7CHI3L1 殼多糖酶3樣蛋白1長度約40 kD，是一種分泌型糖蛋白。Geng等〔49〕實驗發(fā)現(xiàn)，在GC發(fā)展過程中CHI3L1發(fā)生上調(diào)，并且與GC的浸潤深度，TNM分期表現(xiàn)正相關(guān)性。CHI3L1與CD44v3結(jié)合可激活Erk，Akt和β-catenin信號傳導，從而增強GC轉(zhuǎn)移。Chen等〔50〕相關(guān)實驗也證實，CHI3L1 可作為GC患者的潛在生物標志物和潛在治療靶標。

GC早期診斷可為患者提供了內(nèi)鏡下微創(chuàng)切除的機會。在Min等〔51〕的研究中發(fā)現(xiàn)，正常人群標本中CHI3L1的受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)為0.788，將血漿CHI3L1水平與臨床因素結(jié)合，使AUC進一步提高至0.887。提示血漿CHI3L1可作為GC患者內(nèi)鏡下可切除的潛在生物標志物。

2.8Musashi-1 Musashi-1簡稱Msi-1，分子量為39 kD，Msi-1最早于果蠅中被檢測出。已證實對感覺器官相關(guān)細胞的分化有一定影響。研究也發(fā)現(xiàn)Msi-1在人類胃腸道干細胞中均有一定表達。綜上，Msi-1是胃腸道干細胞的潛在表面標志物之一〔52〕。

Kuang等〔53〕相關(guān)實驗發(fā)現(xiàn)，Msi-1和增殖細胞核抗原(PCNA)陽性細胞僅限于正常胃腺的峽部。GC中Msi-1和PCNA的表達高于高度上皮內(nèi)瘤變(U=798.0，P<0.05；U=688.0，P<0.01)。且Msi-1的表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤轉(zhuǎn)移階段呈一定影響關(guān)系(χ2=12.62，P<0.01；χ2=11.24，P<0.05)。其他大量實驗〔54～56〕也發(fā)現(xiàn)胃黏膜不同程度病變、癌前病變(包括腸上皮化生和異型增生)和侵襲性GC中MUSASHI-1的表達均增加。由此可以發(fā)現(xiàn)，Msi-1(+)細胞可能在GC癌前病變或發(fā)生早期過程中起著決定作用，并可能參與GC侵襲和轉(zhuǎn)移，可作為GC患者預后及診斷的標志。

2.9ALDH1 ALDH1由5.3×104個堿基對構(gòu)成，主要分布于消化、內(nèi)分泌及生殖系統(tǒng)中，而在大腦及小腦中還沒有發(fā)現(xiàn)ALDH1的表達〔57〕。它定位于9號染色體長臂上的21區(qū)。

ALDH1存在6種亞型，不同亞型的表達與GC預后、侵襲及轉(zhuǎn)移的密切性也不同。Wakamatsu 等〔58〕實驗發(fā)現(xiàn)，ALDH1的表達與晚期臨床病理因素顯著相關(guān)。在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性部位的GCSC標記比較表明，彌漫型淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中ALDH1陽性率明顯高于原發(fā)性腫瘤(P<0.001)；相關(guān)研究〔59～61〕表明ALDH1A1、ALDH1B1的高水平表達mRNA可能是GC中良好的預后標志物。高轉(zhuǎn)錄水平ALDH1A2、ALDH1A3、ALDH1L1會促進GC的進展和轉(zhuǎn)移，提示也可作為GC預后不良生物標志物。同時Li等〔62〕研究表明，ALDH1A3和ALDH1L1的高表達與總體生存率(OS)惡化呈現(xiàn)明顯相關(guān)，提示ALDH1A3和ALDH1L1是GC中ALDH1活性的潛在主要貢獻者。因此，理論上不同高程度表達的ALDH1同工酶均可作為GC患者預后診斷的重要標志，但現(xiàn)實實驗中還是以ALDH1A3和ALDH1L1運用較多。

2.10miRNA 微小RNA是一類長20～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，通過降解核糖核酸或抑制翻譯的方式進而調(diào)節(jié)一系列分化、發(fā)育等。

Peng等〔63〕實驗發(fā)現(xiàn)miRNA-194具有致癌性，在GC中異常上調(diào)，并通過抑制融合抑制因子(SUFU)的表達而激活Wnt信號通路來上調(diào)腫瘤的增殖和遷移。但是在其他相關(guān)實驗〔64～66〕結(jié)果顯示miRNA-194在GC組織中表達下調(diào)。鑒于其結(jié)果的不一致，應綜合因素進一步完善實驗。雖然存在結(jié)果的不一致性，但實驗結(jié)論均支持miRNA-194在GC中作為診斷或預后標志物的潛力。

大量實驗〔67～70〕發(fā)現(xiàn)，miR-214可作為GCSC標志物。miR-214在GC中顯著下調(diào)。大致機制是通過靶向腫瘤相關(guān)成纖維細胞(CAFs)中的成纖維細胞生長因子(FGF)9和調(diào)節(jié)GC細胞中的EMT過程來降低CAFs對GC的促腫瘤作用，提示CAFs中的miRNA-214/FGF9是GC治療方法的潛在靶標。此外，Jiang等〔71〕通過對從GEO數(shù)據(jù)庫獲得的GC患者miRNA，mRNA和circRNA表達譜分析發(fā)現(xiàn)，共存在5種不同的表達譜(P<0.05)，即Hsa-miR-1，hsa-miR-142-3p，hsa-miR-95，hsa-miR-133a，hsa-miR-375。表達譜中前四者在GC中上調(diào)，最后一個在GC中下調(diào)。同時，相關(guān)實驗〔72～74〕也發(fā)現(xiàn)，其他miRNA(miR-103a-3p、miR-124、miR-29b、hsa-miR-194等)均對GC組織具有一定影響。以上研究均提示各種特定miRNA具有作為GC預后生物標志物的臨床潛力。

2.11SOX2 SOX2是Sox家族(B組B1亞組)成員之一，呈現(xiàn)單外顯子結(jié)構(gòu)，定位在3號染色體長臂。

近年來，越來越多實驗〔75～77〕發(fā)現(xiàn)，SOX2的異常表達與GC的發(fā)生發(fā)展及不良預后有密切關(guān)系。在Wang等〔78〕和Chen等〔79〕實驗也證實了在GC發(fā)展過程中，SOX2逐漸下調(diào)。SOX2水平低與病理分期和臨床結(jié)果有關(guān)。多變量分析表明SOX2蛋白表達是GC的獨立預后指標。同時，高SOX2表達水平的患者預示著治療效果更好。Luo等〔80〕實驗顯示外源表達的SOX2抑制細胞增殖，SOX2過表達的細胞表現(xiàn)出細胞周期停滯和凋亡現(xiàn)象。遷移實驗分析表明SOX2在GC細胞中具有抗轉(zhuǎn)移作用。在SOX2過表達的GC細胞中細胞周期蛋白(CCN)D1和二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)被下調(diào)，并與SOX2誘導的抗癌作用有關(guān)。以上均說明SOX2是GC的有希望和有利的轉(zhuǎn)移生物標志物，可被用于評估GC結(jié)果的新指標。

2.12Nanog 同源域蛋白Nanog定位于人染色體上12p13區(qū)，是維持多潛能胚胎干細胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子?，F(xiàn)階段證實其在絕大多數(shù)腫瘤中表達水平都明顯提高，并對這些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)具有密切影響〔81,82〕。

劉劼等〔83〕通過檢測(免疫組化SP法)，詳細分析了GC、癌旁、癌前病變組織。實驗顯示Nanog陽性率在癌前病變組織(23.3%)<癌旁組織(38.8%)

2.13Oct-4 Oct-4是POU5F1基因(POU家族)編碼的一種特異蛋白質(zhì)。這種基因所表達的蛋白質(zhì)可以作為未分化細胞的標記，并且是胚胎干細胞具有強大更新作用的關(guān)鍵原因〔86,87〕。

Javanbakht等〔88〕研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中的Oct-4 mRNA水平與正常組織相比呈一定上升趨勢。其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.001)等因素也會影響Oct-4的表達。提示Oct-4的高表達也與GC的進展和不良預后有關(guān)。田浩等〔89〕的研究中證實，Oct-4 mRNA高表達水平(P<0.001)能獨立預測患者較差的OS。

DNA結(jié)合蛋白抑制劑ID-1(ID1)在腫瘤發(fā)展及胚胎干細胞自我更新速度和多能性中起著至關(guān)重要的作用。Li等〔90〕實驗發(fā)現(xiàn)ID1在GC中起癌基因的作用，并通過靶向Nanog和Oct-4調(diào)節(jié)GC細胞的干細胞樣特性。提示ID1、Nanog及Oct-4均可作為新興治療靶標的切入點。