miR-101在口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)及對(duì)細(xì)胞增殖與侵襲的影響

楊珊 汪茂青 何科

(1川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 南充 637000；2成都醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院；3成都市第七人民醫(yī)院)

口腔鱗狀細(xì)胞癌是一種常見(jiàn)的口腔頜面惡性腫瘤，約占人口腔惡性腫瘤80%以上。遺傳因素、外部環(huán)境等相互作用導(dǎo)致了口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生與發(fā)展，主要表現(xiàn)為癌基因的激活與抑癌基因的失活〔1～3〕。miRNA是一類(lèi)能與靶基因的3′-非翻譯區(qū)(UTR)特異性結(jié)合的非編碼RNA分子，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控靶基因表達(dá)，參與細(xì)胞的生物學(xué)行為。目前人體已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過(guò)2 000種的miRNA，miRNA可作為癌基因或者抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔4，5〕。miR-101是近期發(fā)現(xiàn)的一種在口腔鱗狀細(xì)胞癌中低表達(dá)的miRNA〔6〕，且研究還發(fā)現(xiàn)miR-101與腫瘤細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)密切相關(guān)〔7〕，提示miR-101與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有重要關(guān)系。本研究探討miR-101對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌KB細(xì)胞增殖與侵襲的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞株 KB細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；兔抗人鋅指結(jié)合蛋白(ZEB)1及GAPDH多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于南通碧云天生物技術(shù)有限公司；重組質(zhì)粒pmir GLO ZEB1 3′UTR-Wt及pmir GLO ZEB1 3′UTR-Mut購(gòu)于廣州銳博生物技術(shù)有限公司；miR-101 mimics、miR-101NC購(gòu)于上海吉馬生物技術(shù)有限公司；Trizol總RNA提取試劑盒，LipofectamineTM3000脂質(zhì)體，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(第一鏈cDNA合成試劑盒)購(gòu)于大連寶生生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞周期試劑盒購(gòu)于南京凱基生物技術(shù)有限公司。Applied Biosystems 7500熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；NanoDrop ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；Epics-XLⅡ流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 室溫條件下Opti-MEM培養(yǎng)基分別稀釋LipofectamineTM3000、miR-101 mimics及miR-101NC，將Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋好的LipofectamineTM3000分別與Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋好的miR-101 mimics及miR-101NC混勻，在室溫下放置30 min，使其形成miRNA-LipofectamineTM3000復(fù)合物。接著將復(fù)合物加入生長(zhǎng)融合度達(dá)到70%左右的KB細(xì)胞中，培養(yǎng)6 h，換新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)至48 h，最后采用Realtime-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中miR-101的表達(dá)。

1.4Realtime-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中miR-101表達(dá) 按“1.3”轉(zhuǎn)染KB細(xì)胞，收集細(xì)胞，并根據(jù)Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，焦碳糖二乙酯(DEPC)水溶解RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度及濃度，當(dāng)檢測(cè)出的RNA純度(OD260 nm/OD280 nm=1.8)良好時(shí)候，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件：30℃ 6 min，40℃ 20 min。最后進(jìn)行 Realtime PCR 分析，預(yù)變性95℃，15 min；變性95℃，20 s；退火60℃，34 s；40個(gè)循環(huán)。用2-△△Ct法分析miR-101表達(dá)量。

1.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將KB細(xì)胞平鋪于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，按“1.3”轉(zhuǎn)染細(xì)胞并培養(yǎng)48 h，加入MTT孵育4 h后去除上清液，每孔細(xì)胞中加入150 μl的二甲基亞砜于微量震蕩儀震蕩10 min，于酶標(biāo)儀560 nm處測(cè)定OD值。

1.6細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆能力 將KB細(xì)胞平鋪于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，按“1.3”轉(zhuǎn)染細(xì)胞并培養(yǎng)48 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕洗滌2次，加入4%多聚甲醛固定10 min，加入Gimsa染液染色15 min，顯微鏡下觀察。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 將KB細(xì)胞鋪于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，按“1.3”轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h，每組收集1×106/ml個(gè)細(xì)胞，按流式細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，加入Rnase混勻孵育1 h，再加入碘化丙啶(PI)染液孵育30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 用DMEM培養(yǎng)液稀釋Matrigel膠，并將稀釋好的Matrigel膠平鋪于8 μm的transwell小室的上室，下室加入10%胎牛血清的培養(yǎng)基。將按“1.3”轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h的單細(xì)胞懸浮液接種于transwell上室，培養(yǎng)48 h后，取出小室。Transwell上室的細(xì)胞用棉簽輕輕擦去，下室用多聚甲醛固定細(xì)胞，并用1%結(jié)晶紫染色5 min，200倍顯微鏡下觀察穿過(guò)濾膜的細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取平均值，即為細(xì)胞的侵襲數(shù)目。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中ZEB1蛋白的表達(dá) 按“1.3”轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞并加入細(xì)胞裂解液在冰上裂解細(xì)胞，4℃離心，收集上清液。BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，取30 ng蛋白樣品上樣，進(jìn)行12%十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳，轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜40 min。2%的牛血清蛋白(BSA)溶液室溫下孵育1 h，兔抗ZEB1及GAPDH多克隆抗體溶液4℃過(guò)夜孵育，第二天室溫孵育二抗，最后根據(jù)化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒說(shuō)明書(shū)在凝膠成像系統(tǒng)中曝光各蛋白條帶，并分析條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)分析 將miR-101 mimics+ pmir GLO ZEB1 3′UTR-Wt，miR-101 NC+ pmir GLO ZEB1 3′UTR-Wt，miR-101 mimics+ pmir GLO ZEB1 3′UTR-Mut，miR-101 NC+ pmir GLO ZEB1 3′UTR-Mut四組miR-101與ZEB1的重組載體轉(zhuǎn)入KB細(xì)胞中，并根據(jù)雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)每組細(xì)胞的熒光素酶活性，計(jì)算公式：相對(duì)熒光值=螢火蟲(chóng)熒光素酶熒光值/海腎熒光素酶熒光值。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-101 mimics轉(zhuǎn)染情況的測(cè)定 與miR-101 NC組(0.32±0.03)比較，miR-101 mimics組miR-101表達(dá)量(1.45±0.14)顯著上升(P=0.000)。

2.2miR-101對(duì)KB細(xì)胞活力、細(xì)胞克隆形成能力的影響 與miR-101NC組比較，miR-101 mimics組細(xì)胞活力顯著降低、細(xì)胞克隆數(shù)目顯著減少(P=0.000)，見(jiàn)表1。

表1 miR-101 mimics對(duì)KB細(xì)胞活力、細(xì)胞克隆能力的影響

2.3miR-101對(duì)KB細(xì)胞周期的影響 與miR-101NC組比較，miR-101 mimics組G1期顯著延長(zhǎng)，S期和G2期均顯著縮短(P=0.000)。見(jiàn)圖1、表2。

圖1 miR-101對(duì)KB細(xì)胞周期的影響

表2 miR-101對(duì)KB細(xì)胞周期的影響

2.4miR-101對(duì)KB細(xì)胞侵襲能力的影響 與miR-101NC組〔(185.32±18.94)個(gè)〕比較，miR-101 mimics組細(xì)胞侵襲數(shù)目〔(48.73±4.87)個(gè)〕顯著減少(P=0.000)。見(jiàn)圖2。

圖2 miR-101對(duì)KB細(xì)胞侵襲能力的影響(HR，×400)

2.5報(bào)告基因分析 miR-101 mimics+ pmir GLO ZEB1 3′UTR-Wt組熒光強(qiáng)度顯著低于其他所有轉(zhuǎn)染組(P=0.000)。見(jiàn)表3。

表3 報(bào)告基因分析

2.6miR-101對(duì)KB細(xì)胞中ZEB1蛋白及mRNA表達(dá)的影響 與miR-101NC組(1.00±0.10、0.43±0.04)比較，miR-101 mimics組ZEB1 mRNA和蛋白表達(dá)量(0.25±0.02、0.10±0.01)中顯著下調(diào)(P=0.000)。見(jiàn)圖3。

圖3 miR-101對(duì)KB細(xì)胞中ZEB1蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

近些年來(lái)已發(fā)現(xiàn)了2 000多種miRNA，并證實(shí)這些miRNA雖然僅僅占人類(lèi)基因組的1%，卻控制著人類(lèi)將近30%基因的表達(dá)。miR-101是僅存在于脊椎動(dòng)物中的高度保守的miRNA，存在兩個(gè)前體，分別為miR-101-1及miR-101-2，分別定位于人1號(hào)和9號(hào)染色體中。研究顯示miR-101通過(guò)作用于絲氨酸/蘇氨酸激酶(PKC)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖與分化，還能夠調(diào)控依賴(lài)PKC的Polycomb抑制復(fù)合物2及甲基化的核小體組蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔8〕。而且Miao等〔9〕研究表明miR-101基因多態(tài)位點(diǎn)(rs578481、rs705509)與口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。Troiano等〔6〕采用meta分析1 200例來(lái)自亞洲的口腔鱗狀細(xì)胞癌患者中miRNA的表達(dá)，結(jié)果表明腫瘤組織中miR-21，miR-455-5p，miiR-155-5p，miR-372，miR-373，miR-29b，miR-1246，miR-196a及miR-181等9個(gè)miRNA表達(dá)量上調(diào)，miR-204，miR-101，miR-32，miR-20a，miR-16，miR-17及miR-125b等7個(gè)miRNA表達(dá)量下調(diào)，且這16個(gè)miRNA的差異性表達(dá)與患者的總生存率及無(wú)病生存率密切相關(guān)，提示這些特異性miRNA的表達(dá)量能夠預(yù)示口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的預(yù)后。本研究說(shuō)明miR-101 mimics對(duì)KB細(xì)胞增殖具有抑制作用。腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖與細(xì)胞周期的不可控制密切相關(guān)，miR-101 mimics能顯著抑制KB細(xì)胞的侵襲能力。

miRNA主要通過(guò)與靶基因mRNAUTR配對(duì)結(jié)合，進(jìn)而降解或者抑制靶基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為〔10～12〕。ZEB蛋白是一種核轉(zhuǎn)錄因子，包括ZEB1及ZEB2兩個(gè)成員。其中ZEB1定位于人10號(hào)染色體短臂，可轉(zhuǎn)錄高達(dá)32種的miRNA〔13，14〕。研究顯示ZEB1是EMT重要的調(diào)控因子，能促進(jìn)EMT的發(fā)生。另外研究也顯示miR-101與EMT密切相關(guān)，miR-101能夠通過(guò)調(diào)控ZEB1表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，提示ZEB1可能是miR-101的下游靶基因〔7，15〕。本研究說(shuō)明ZEB1是miR-101下游靶基因，miR-101通過(guò)負(fù)性調(diào)控ZEB1表達(dá)進(jìn)而抑制KB細(xì)胞增殖與侵襲。