H19靶向miR-130-5p調(diào)控自然殺傷細(xì)胞對(duì)前列腺癌細(xì)胞的殺傷作用

石濤 高艷 凡磊 周本正 丁志勇 張大虎

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽醫(yī)院(襄陽市第一人民醫(yī)院) 1泌尿外科，湖北 襄陽 441000；2綜合內(nèi)科)

前列腺癌(PCa)是男性泌尿生殖系統(tǒng)中發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，現(xiàn)在的治療方式有手術(shù)治療，放射照射及化學(xué)治療，內(nèi)分泌治療等，隨著分子生物學(xué)及免疫學(xué)的發(fā)展，基因治療和免疫治療成為新的治療方法〔1〕。自然殺傷(NK)細(xì)胞具有獨(dú)立殺傷能力，是腫瘤免疫的第一道防線，且是細(xì)胞免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，在PC細(xì)胞中低表達(dá)，免疫水平下降〔2〕。所以增強(qiáng)機(jī)體殺傷癌細(xì)胞的能力對(duì)PC的發(fā)生發(fā)展，治療和預(yù)后具有重要意義。長鏈非編碼RNA是一類無法編碼蛋白質(zhì)的RNA，可通過調(diào)控miRNA發(fā)揮作用，研究發(fā)現(xiàn)H19在多腫瘤中異常表達(dá)，通過其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長鏈非編碼RNAH19影響生長、增殖、分化凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移等過程〔3〕。H19在PC中發(fā)揮抑癌基因作用，可作為PC診斷、治療、預(yù)后及藥物敏感性的生物標(biāo)記物〔4〕。但H19對(duì)NK細(xì)胞的殺傷作用的影響機(jī)制目前還不清楚。miRNA是一種內(nèi)源性的非編碼RNA，同樣具有抑癌或促癌作用，研究發(fā)現(xiàn)miR-130-5p在PC細(xì)胞中低表達(dá)，過表達(dá)可抑制PC-3細(xì)胞的增殖和遷移，延緩PC的進(jìn)展〔5〕。但miR-130-5p對(duì)NK細(xì)胞的殺傷作用的影響機(jī)制還尚未清楚，H19是否與miR-130-5p有關(guān)也尚未見報(bào)道，本文旨在研究H19與miR-130-5p的調(diào)控關(guān)系及影響NK細(xì)胞對(duì)PC細(xì)胞的殺傷作用。

1 材料與方法

1.1材料 NK細(xì)胞、PC細(xì)胞DU-145、PC-3和人正常前列腺上皮細(xì)胞(RWPE)-1購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibico公司；Lipofectamine TM 2000購自Sigma公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒、噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、放射免疫沉淀(RIPA)裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗體購自上海煊翎生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) NK細(xì)胞、PC細(xì)胞DU-145、PC-3和人正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每天換液一次，待細(xì)胞融和至80 %左右時(shí)，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，選取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 取對(duì)數(shù)生長期的PC-3細(xì)胞和NK細(xì)胞，同時(shí)接種兩種細(xì)胞進(jìn)行PC-3細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)。將si-NC，si-H19、pcDNA3.1、pcDNA3.1-H19、miR-NC、miR-130-5p、anti-miR-NC、anti-miR-130-5p質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)染至正常培養(yǎng)的PC細(xì)胞中；將si-NC，si-H19、miR-NC、miR-130-5p質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)染至PC-3細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞中；將si-H19分別與anti-miR-NC、anti-miR-130-5p質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)染至PC-3細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞中；以上細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集待用。

1.2.3MTT檢測細(xì)胞增殖 在各組細(xì)胞培養(yǎng)至48 h時(shí)加入20 μl(5 g/L)的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h；棄去多余培養(yǎng)基并加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)振蕩反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值×100%。每組重復(fù)3次。

1.2.4ELISA法檢測IFN-γ和TNF-α的表達(dá)水平 各組細(xì)胞，離心取上清，按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.2.5qRT-PCR檢測miR-130-5p和H19的表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，研磨充分后加入Trizol試劑提取總RNA，微量核酸測定儀檢測RNA純度和濃度。使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說明配制反應(yīng)體系，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次，循環(huán)條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60℃延長5 min。相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.2.6Western印跡檢測HLA-G蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解，4℃，12 000 r/min離心15 min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。每個(gè)蛋白樣品重復(fù)3次。

1.2.7熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)檢測H19和miR-130-5p及miR-130-5p和HLA-G的靶向調(diào)控 TargetScan數(shù)據(jù)庫顯示H19和HLA-G 3′UTR區(qū)域有miR-130-5p結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建野生型(WT)和突變型(MUT)基因靶點(diǎn)H19和HLA-G的3′UTR-熒光素酶表達(dá)載體(WT-H19、WT-HLA-G、MUT-H19和MUT-HLA-G)，取對(duì)數(shù)生長期PC-3細(xì)胞接種于24孔板(5×104個(gè)/孔)，待細(xì)胞生長至80 %融合時(shí)，用LipofectamineTM2000將WT-H19、WT-HLA-G、MUT-H19和MUT-HLA-G組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-130-5p。依據(jù)說明書要求，使用熒光素酶報(bào)告基因檢測儀進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.00軟件行t檢驗(yàn)，方差分析。

2 結(jié) 果

2.1H19、miR-130-5p在PC細(xì)胞DU-145、PC-3和人正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1中的表達(dá) 相較于人正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1，PC細(xì)胞DU-145、PC-3中miR-130-5p的表達(dá)水平顯著降低；H19的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 H19和miR-130-5p的表達(dá)

2.2干擾H19表達(dá)的PC-3細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)后對(duì)PC-3細(xì)胞存活率及對(duì)NK細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響 si-NC組比較，si-H19組PC-3細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)后H19的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與si-NC組比較，si-H19組PC-3細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)后對(duì)PC-3細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)。與si-NC組比較，si-H19組PC-3細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)后NK細(xì)胞中IFN-γ、TNF-α的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與si-NC組比較，si-H19組PC-3細(xì)胞HLA-G蛋白的表達(dá)水顯著降低(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 抑制H19表達(dá)的PC-3細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)后對(duì)PC-3細(xì)胞存活率及對(duì)NK細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響

圖1 抑制H19對(duì)HLA-G蛋白表達(dá)的影響

2.3H19靶向調(diào)控miR-130-5p的表達(dá) 通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測到H19與miR-130-5p存在結(jié)合位點(diǎn)見圖2。轉(zhuǎn)染野生型H19基因表達(dá)載體WT-H19后，與miR-NC組比較，miR-130-5p組WT-H19前列腺癌PC-3細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染突變型H19基因表達(dá)載體MUT-H19后，與miR-NC組比較，miR-130-5p組MUT-H19前列腺癌PC-3細(xì)胞的熒光素酶活性差異不顯著。見表3。與pcDNA3.1組(0.45±0.04)比較，pcDNA3.1-H19組PC-3細(xì)胞中miR-130-5p的表達(dá)水平(0.15±0.01)顯著降低；與si-NC組(0.48±0.04)比較，si-H19組PC-3細(xì)胞中miR-130-5p的表達(dá)水平顯著升高(0.75±0.04，P<0.05)。

圖2 H19和miR-130-5p的互補(bǔ)序列

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.4過表達(dá)miR-130-5p的PC-3細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)后對(duì)PC-3細(xì)胞存活率及對(duì)NK細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響 miR-NC組比較，miR-130-5p組PC-3細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)后miR-130-5p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與miR-NC組比較，miR-130-5p組PC-3細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)后對(duì)PC-3細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)。miR-NC組比較，miR-130-5p組PC-3細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)后NK細(xì)胞中IFN-γ、TNF-α的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與miR-NC組比較，miR-130-5p組PC-3細(xì)胞HLA-G蛋白的表達(dá)水顯著降低(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 過表達(dá)miR-130-5p對(duì)HLA-G蛋白表達(dá)的影響

表4 過表達(dá)miR-130-5p的PC-3細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)后對(duì)PC-3細(xì)胞存活率及對(duì)NK細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響

2.5抑制miR-130-5p表達(dá)的PC-3細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)后能逆轉(zhuǎn)干擾H19增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)PC-3細(xì)胞的殺傷作用 與si-NC組比較，si-H19組PC-3細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)后miR-130-5p的表達(dá)水平顯著升高；與si-H19+anti-miR-NC組比較，si-H19+anti-miR-130-5p組PC-3細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)后miR-130-5p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與si-NC組比較，si-H19組PC-3細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)后對(duì)PC-3細(xì)胞存活率顯著降低；與si-H19+anti-miR-NC組比較，si-H19+anti-miR-130-5p組PC-3細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)后對(duì)PC-3細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05)。與si-NC組比較，si-H19組PC-3細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)后NK細(xì)胞中IFN-γ、TNF-α的表達(dá)水平顯著升高；與si-H19+anti-miR-NC組比較，si-H19+anti-miR-130-5p組PC-3細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)后NK細(xì)胞中IFN-γ、TNF-α的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與si-NC組比較，si-H19組PC-3細(xì)胞HLA-G蛋白的表達(dá)水顯著降低；與si-H19+anti-miR-NC組比較，si-H19+anti-miR-130-5p組PC-3細(xì)胞HLA-G蛋白的表達(dá)水顯著升高(P<0.05)。見表5，圖4。

表5 抑制miR-130-5p表達(dá)的PC-3細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)后能逆轉(zhuǎn)干擾H19增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)PC-3細(xì)胞的殺傷作用

1～4：si-NC組、si-H19組、si-H19+anti-miR-NC組、si-H19+anti-miR-130-5p組圖4 抑制miR-130-5p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)干擾H19對(duì)HLA-G蛋白表達(dá)的影響

2.6miR-130-5p靶向調(diào)控HLA-G的表達(dá) 通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測到HLA-G與miR-130-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖5。轉(zhuǎn)染野生型HLA-G基因表達(dá)載體WT-HLA-G后，與miR-NC組比較，miR-130-5p組WT-HLA-G前列腺癌PC-3細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染突變型HLA-G基因表達(dá)載體MUT-HLA-G后，miR-NC組比較，miR-130-5p組MUT-HLA-G前列腺癌PC-3細(xì)胞的熒光素酶活性差異不顯著，見表6。與miR-NC組(0.86±0.04)比較，miR-130-5p組PC-3細(xì)胞中HLA-G的表達(dá)水平顯著降低(0.51±0.02，P<0.05)；與anti-miR-NC組(0.89±0.04)比較，anti-miR-130-5p組PC-3細(xì)胞中HLA-G的表達(dá)水平顯著升高(1.19±0.05，P<0.05)。見圖6。

圖5 HLA-G得3'UTR含有miR-130-5p的互補(bǔ)序列

表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

1～4：miR-NC組、miR-130-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-130-5p組圖6 HLA-G和miR-130-5p的互補(bǔ)序列及HLA-G蛋白的表達(dá)

3 討 論

隨著對(duì)PC腫瘤免疫學(xué)等研究的深入，靶向免疫治療被認(rèn)為是PC較有前景的治療方式〔6〕。NK細(xì)胞無需特異性抗原就可以直接殺傷靶細(xì)胞，可溶解細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子，有強(qiáng)的抵御腫瘤的能力〔7〕。但腫瘤細(xì)胞仍能逃避NK細(xì)胞的殺傷，因此增強(qiáng)NK細(xì)胞抗腫瘤活性和提高NK細(xì)胞特異性殺傷力對(duì)于腫瘤的治療至關(guān)重要〔8〕。研究發(fā)現(xiàn)抑制IL-6能增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)PC的免疫殺傷能力，抑制了腫瘤的生長〔9〕。硼替佐米能增強(qiáng)PC細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞殺傷作用的敏感性〔10〕。而非編碼RNA在免疫細(xì)胞活化和功能中也發(fā)揮重要作用，長鏈非編碼RNA(LncRNA)AK036396通過Fcnb能夠有效調(diào)控粒細(xì)胞樣髓源性抑制細(xì)胞免疫抑制功能進(jìn)而影響機(jī)體抗腫瘤免疫〔11〕。LncRNA H19在PC中呈現(xiàn)高表達(dá)，抑制其表達(dá)可有效抑制PC細(xì)胞的糖代謝和生長〔12〕。本研究結(jié)果也顯示在PC細(xì)胞中H19高表達(dá)，而且還發(fā)現(xiàn)干擾H19表達(dá)可以促進(jìn)NK細(xì)胞釋放IFN-γ和TNF-α，抑制與NK細(xì)胞共培養(yǎng)的PC-3細(xì)胞的存活，即增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)PC-3細(xì)胞的殺傷作用。

miRNA參與各種免疫細(xì)胞的產(chǎn)生、增殖、發(fā)育及免疫應(yīng)答過程中，通過調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因的表達(dá)發(fā)揮著重要的調(diào)控作用〔13〕。降低miR-378和miR-30e的表達(dá)可增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷能力〔14〕。而miR-130-5p對(duì)NK細(xì)胞的影響未見報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)miR-130b-5p在腎癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，參與腎癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，可作為腎癌腫瘤標(biāo)志物〔15〕。miR-130b-5p通過靶向RASAL1促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲〔16〕。miR-130b過表達(dá)可通過增殖阻斷基因和細(xì)胞衰老激活的表觀遺傳調(diào)控有效誘導(dǎo)PC細(xì)胞生長停滯〔17〕。miR-130b通過下調(diào)MMP2抑制前列腺癌轉(zhuǎn)移〔5〕。本研究結(jié)果顯示PC細(xì)胞中miR-130-5p低表達(dá)，過表達(dá)miR-130-5p抑制PC-3細(xì)胞的存活，即增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷力。

HLA-G屬于非經(jīng)典的HLA-Ⅰ類分子，一種免疫調(diào)節(jié)分子，在多種腫瘤中異常表達(dá)，參與腫瘤免疫逃逸機(jī)制〔18〕。HLA-G能與NK表面受體結(jié)合，參與調(diào)控NK細(xì)胞免疫功能，抑制NK細(xì)胞的殺傷作用，調(diào)節(jié)NK細(xì)胞表面受體及細(xì)胞因子的表達(dá)〔19〕。腫瘤細(xì)胞中HLA-G表達(dá)可抑制NK細(xì)胞的殺傷活性〔20〕。且因HLA-G診斷PC的敏感度和特異度較高，可作為PC的早期篩查和診斷的有效腫瘤標(biāo)志物〔21〕。研究發(fā)現(xiàn)萬珂通過下調(diào)HLA-Ⅰ類分子的表達(dá)可增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)PC的殺傷能力〔22〕。HLA-G多是通過miRNA介導(dǎo)調(diào)控發(fā)揮作用，研究發(fā)現(xiàn)在人絨癌JEG-3細(xì)胞中miR-133負(fù)性調(diào)控HLA-G的表達(dá)〔23〕，miR-152也能靶向調(diào)控HLA-G的表達(dá)〔24〕。LncRNA HOTAIR通過抑制胃癌細(xì)胞中的miR-152來促進(jìn)HLA-G的表達(dá)〔25〕。本研究發(fā)現(xiàn)H19靶向調(diào)控miR-130-5p的表達(dá)，而miR-130-5p靶向調(diào)控HLA-G的表達(dá)，干擾H19表達(dá)和過表達(dá)miR-130-5p均抑制HLA-G蛋白的表達(dá)，說明H19可通過miR-130-5p間接調(diào)控HLA-G的表達(dá)。