膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎發(fā)生后不同時(shí)間大鼠骨骼的變化

陳文雙 許碧蓮 林長(zhǎng)纓 田佳 張新樂(lè)

(1廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 湛江 524023；2廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)可導(dǎo)致不可逆的關(guān)節(jié)破壞、畸形，甚至殘疾、死亡。RA在疾病發(fā)展和治療過(guò)程中容易并發(fā)骨質(zhì)疏松(OP)〔1〕。

OP是以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，致使骨的脆性增加及易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病。RA伴有兩種形式的OP，一種是關(guān)節(jié)周圍的骨質(zhì)丟失，另一種是全身性O(shè)P。RA的動(dòng)物模型有多種，其中較為經(jīng)典的是弗氏完全佐劑(IFA)誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎和Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠模型，而CIA大鼠模型在病理學(xué)上的變化，更接近人類的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎〔2〕。本研究旨在探討CIA發(fā)生后不同時(shí)間大鼠骨骼的變化。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡雌性SD大鼠70只，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量(164±20) g。

1.2藥品及儀器 牛源性Ⅱ型膠原蛋白購(gòu)自四川大學(xué)，IFA購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。viva Micro-CT 40(SCANCO Medical AG，瑞士)，雙能X線骨密度儀(Hologic，Inc，USA)，858 Mini Bionix型材料測(cè)試機(jī)及測(cè)試系統(tǒng)(MTS，美國(guó))。

1.3CIA模型建立及分組〔3〕隨機(jī)取24只大鼠作為對(duì)照組，46只用于建立CIA模型。暴露大鼠背部皮膚，取配制好的Ⅱ型膠原蛋白乳劑(1.5 g/L)，在脊柱兩旁皮內(nèi)多點(diǎn)注射，每只注射乳劑0.4 ml。1 w后，加強(qiáng)免疫1次。正常對(duì)照組按相同方法注射0.05 mol/L醋酸0.4 ml。自初次免疫3 w后篩選出成功發(fā)生關(guān)節(jié)炎(兩后肢關(guān)節(jié)炎指數(shù)≥4)的大鼠24只為CIA組，然后在CIA發(fā)生后4、8、12、16 w隨機(jī)處死6只取材。

1.4病理組織學(xué)檢查 取右踝關(guān)節(jié)進(jìn)行固定、脫鈣、包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色后在顯微鏡下觀察組織病理變化，進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分統(tǒng)計(jì)〔4〕。

1.5Micro-CT測(cè)量 將右側(cè)股骨沿長(zhǎng)軸置于固定器內(nèi)，使各樣本放置的角度保持一致。采用viva Micro-CT 40對(duì)股骨進(jìn)行掃描，對(duì)選定股骨距生長(zhǎng)板遠(yuǎn)端1.0 mm、層厚3.0 mm的松質(zhì)骨為興趣測(cè)量區(qū)域進(jìn)行圖像分析，得到骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)、連接密度(Conn.D.)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)、體積骨密度(vBMD)等定量參數(shù)〔5〕。

1.6骨密度(BMD)及骨生物力學(xué)檢測(cè)〔6〕將測(cè)完micro-CT的右側(cè)股骨用雙能X線吸收法(DXA)BMD儀測(cè)出骨礦含量(BMC)和骨面積(area)，然后用BMC/area進(jìn)行計(jì)算，即可算出面積骨密度(aBMD)。

將測(cè)完BMD的股骨置于(MTS)試驗(yàn)機(jī)上，測(cè)試采用三點(diǎn)彎曲法，用1 mm直徑的壓頭，跨距(L)為15 mm，加載速度為0.01 mm/s。儀器即時(shí)記錄每個(gè)時(shí)刻點(diǎn)的載荷和橈度變化值，再進(jìn)一步換算得每個(gè)時(shí)刻點(diǎn)的應(yīng)力和應(yīng)變值，繪制應(yīng)力-應(yīng)變曲線，從曲線上直接獲取或依公式計(jì)算出最大載荷、斷裂載荷、彈性載荷、剛度等參數(shù)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析。方差齊時(shí)采用LSD 檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)采用Tamhane檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組踝關(guān)節(jié)病理學(xué)評(píng)分的變化比較 與對(duì)照組比較，CIA組CIA發(fā)生后4、8、12、16 w踝關(guān)節(jié)病理學(xué)評(píng)分明顯增加(P<0.01)。見表1。

表1 各組踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)評(píng)分的變化分)

2.2各組大鼠股骨骨密度的變化比較 與對(duì)照組比較，CIA組CIA發(fā)生后4、8、12、16 w股骨aBMD和vBMD均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組股骨骨密度比較

2.3各組大鼠股骨生物力學(xué)參數(shù)的變化 與對(duì)照組比較，CIA組CIA大鼠發(fā)生后4、8、12、16 w股骨生物力學(xué)參數(shù)最大載荷、斷裂載荷、彈性載荷、剛度均明顯降低(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠股骨生物力學(xué)參數(shù)的變化比較

2.4各組大鼠股骨松質(zhì)骨Micro-CT定量參數(shù)的變化 正常大鼠可見清晰的關(guān)節(jié)腔，滑膜組織無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)纖維組織增生，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，軟骨細(xì)胞分布均勻，骨纖維排列整齊。CIA發(fā)病大鼠軟骨表面完整性遭破壞，細(xì)胞分布不規(guī)則；可見軟骨細(xì)胞增生，軟骨和滑膜層粘連、纖維化；并有形成肉芽組織和血管翳。與正常對(duì)照組比較，CIA大鼠發(fā)生后4、8、12、16 w股骨松質(zhì)骨Micro-CT定量參數(shù)BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D均減少(P<0.01)，而Tb.Sp、SMI均明顯增大(P<0.01)。見圖1，表4。

圖1 各組大鼠股骨遠(yuǎn)端Micro-CT的三維圖

表4 各組大鼠股骨遠(yuǎn)端Micro-CT定量參數(shù)的變化

3 討 論

通過(guò)踝關(guān)節(jié)組織切片可觀察到：本研究中踝關(guān)節(jié)組織切片病理改變與RA臨床上出現(xiàn)的關(guān)節(jié)腫脹，滑膜充血、水腫，組織疏松，滑膜組織的不規(guī)則增厚和關(guān)節(jié)軟骨破壞等基本相似。本研究結(jié)果說(shuō)明CIA大鼠在病理學(xué)表現(xiàn)上與人類RA相似，提示本實(shí)驗(yàn)成功建立了CIA大鼠模型。隨著CIA發(fā)病時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠踝關(guān)節(jié)的病理改變更加明顯。

本實(shí)驗(yàn)采用Micro-CT對(duì)股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨進(jìn)行三維重建分析，通過(guò)Micro-CT直接觀察松質(zhì)骨的骨小梁形態(tài)、結(jié)構(gòu)及三維結(jié)構(gòu)，并獲得骨小梁的立體測(cè)量學(xué)的指標(biāo)。Micro-CT比二維體視學(xué)定量方法更準(zhǔn)確、更科學(xué)、更全面反映骨組織結(jié)構(gòu)，能獲得真正的各項(xiàng)同性的容積圖像，提高空間分辨率〔7〕。SMI是用于評(píng)價(jià)骨小梁的結(jié)構(gòu)形態(tài)，反映骨小梁桿狀和板狀的程度，理想板狀結(jié)構(gòu)為0，理想桿狀結(jié)構(gòu)為3，OP時(shí)，SMI數(shù)值增加，表明骨小梁由板狀轉(zhuǎn)變?yōu)闂U狀。Tb.Sp是指骨小梁之間的平均距離，反映骨小梁的結(jié)構(gòu)形態(tài)。Tb.Sp越大，表示骨小梁距離越大，OP越明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示隨著CIA發(fā)病時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠股骨松質(zhì)骨的骨丟失及骨三微結(jié)構(gòu)破壞越嚴(yán)重。

BMD的測(cè)定可作為OP的診斷、骨折發(fā)生的危險(xiǎn)性的預(yù)測(cè)及藥物療效的評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一〔8〕。BMD有aBMD和vBMD的表達(dá)方式。aBMD是利用DXA測(cè)出BMC和area，然后BMC除以area得出BMD，也就是常用的BMD。DXA BMD儀測(cè)定BMD具有高精度、無(wú)創(chuàng)傷、快捷等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上廣泛應(yīng)用，但是由于骨的厚度沒(méi)有得到校正，不能排除骨大小對(duì)BMC的影響。因此，有學(xué)者認(rèn)為BMD反映的并不是真正的BMD，僅是一個(gè)二維的估計(jì)值〔9〕。vBMD是通過(guò)Micro-CT對(duì)股骨進(jìn)行三維掃描，獲得骨骼的體積(V)和BMC，BMC除以V即獲得vBMD。vBMD排除了骨大小的影響，更真實(shí)反映BMD〔10〕。本研究結(jié)果提示CIA大鼠發(fā)生后4 w開始出現(xiàn)股骨骨質(zhì)量下降，骨折發(fā)生危險(xiǎn)性增加。vBMD的結(jié)果變化與踝關(guān)節(jié)病理學(xué)評(píng)分、骨量的變化基本一致，說(shuō)明vBMD比aBMD更真實(shí)反映BMD。提示隨著CIA發(fā)病時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠股骨vBMD的降低越明顯。文獻(xiàn)報(bào)道，RA病人早期就出現(xiàn)BMD降低，但BMD流失與關(guān)節(jié)炎的持續(xù)性并沒(méi)有相關(guān)性〔11〕。股骨頸BMD的減小是RA疾病特征之一，股骨頸BMD不僅是一個(gè)全身性骨質(zhì)疏松的指標(biāo)，也是系統(tǒng)評(píng)價(jià)RA病人的一個(gè)指標(biāo)，還可以有效衡量RA治療和康復(fù)情況〔12〕。

骨生物力學(xué)是以工程力學(xué)為基礎(chǔ)，研究骨組織在外界作用下的力學(xué)特性和骨組織在受力后的生物學(xué)效應(yīng)，是對(duì)骨質(zhì)量進(jìn)行評(píng)定的一種可靠手段。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CIA發(fā)生后4 w大鼠開始出現(xiàn)股骨的生物力學(xué)性能降低，骨質(zhì)量下降，使其在遭受外力的情況下本身的抵抗性能減弱，易于發(fā)生骨折。隨著CIA發(fā)病時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠股骨生物力學(xué)性能的降低越嚴(yán)重。

綜上，CIA發(fā)生后4 w大鼠開始出現(xiàn)股骨松質(zhì)骨的骨量減少，骨三維結(jié)構(gòu)破壞，BMD下降，骨生物力學(xué)性能降低，說(shuō)明CIA發(fā)生后4 w大鼠開始出現(xiàn)OP，而且隨著CIA發(fā)病時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠發(fā)生的OP越嚴(yán)重。臨床研究顯示，68%的RA患者在患病第一年就會(huì)出現(xiàn)骨質(zhì)丟失，骨量的丟失與關(guān)節(jié)進(jìn)展性損害相關(guān)〔13〕。此外，研究報(bào)道，隨著患者年齡、病程及 DAS28 評(píng)分增高，患者發(fā)生 OP 的風(fēng)險(xiǎn)也增加。隨著RA病程的延長(zhǎng)，患者并發(fā)OP的發(fā)病率明顯高于健康人群，而且OP的病情不斷加重，更容易導(dǎo)致脆性骨折〔14〕。