血清Flotillin表達(dá)對(duì)阿爾茨海默病的早期診斷價(jià)值

朱琳琳 陳曉宏 朱婷 季晶俊 李海燕 (上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，上海 200120)

阿爾茨海默病(AD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為記憶力減退、運(yùn)動(dòng)障礙及持續(xù)性認(rèn)知能力下降等，并伴隨著一系列精神病癥狀〔1〕。AD患者數(shù)量逐漸增加，其腦功能和認(rèn)知功能在患病期間也會(huì)受到不同程度的損害，給社會(huì)和家庭都帶來了沉重的負(fù)擔(dān)〔2〕。精神狀態(tài)量表(MMSE)因其簡便、省時(shí)的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于臨床診斷和評(píng)價(jià)AD認(rèn)知損害程度，但其評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)易受到患者年齡、教育和語言的影響，可能會(huì)出現(xiàn)假陽性，需和其他指標(biāo)聯(lián)合使用〔3，4〕。浮艦蛋白(Flotillin)最初是在軸突再生過程中被發(fā)現(xiàn)的，研究表明Flotillin與海馬神經(jīng)元的分化及軸突的再生有密切聯(lián)系〔5〕。但是目前仍未有關(guān)于血清Flotillin mRNA對(duì)AD早期診斷價(jià)值的研究。本研究分別通過檢測AD患者血清中Flotillin mRNA水平，并對(duì)患者進(jìn)行MMSE評(píng)分，分析和探討二者的關(guān)系，為臨床評(píng)估AD發(fā)生的早期危險(xiǎn)性提供一定的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年8月至2019年12月于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院就診的52例AD早期患者為研究對(duì)象(AD組)，年齡60～84歲；同期選取68例健康體檢者作為對(duì)照(對(duì)照組)，年齡60～87歲。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。本研究中患者均由主治醫(yī)師明確診斷，本試驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，受試對(duì)象均由專業(yè)人員詳細(xì)告知研究內(nèi)容并自愿參加，同時(shí)簽署知情同意書。

表1 兩組一般資料比較

納入標(biāo)準(zhǔn)：①美國國立老化研究院和AD協(xié)會(huì)診斷標(biāo)準(zhǔn)〔6〕；②無攻擊行為和自殺傾向者；③臨床資料齊全者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有自身免疫性和內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者；②腦血管病、腦外傷及軀體疾病等原因?qū)е碌陌V呆患者；③有精神障礙性疾病家族史；④精神活性藥物濫用史。收集受試者一般資料，包括性別、年齡、體重指數(shù)、受教育年限、吸煙史、飲酒史。

1.2主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒(貨號(hào)：R1200-100)購自北京索萊寶科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：KL266)購自上海康朗生物科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(貨號(hào)：RR820A)購自北京百奧創(chuàng)新科技有限公司；Rox reference dye(貨號(hào)：XY320)購自上海信裕生物科技有限公司。ABI 7700型實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.3研究方法

1.3.1樣品采集及保存 分別采集兩組受試者檢查當(dāng)天清晨空腹靜脈血樣5 ml，3 000 r/min離心15 min后收集血清，置于-80℃保存待測。

1.3.2血清Flotillin mRNA水平測定 采用RNA提取試劑盒提取兩組受試者血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄得cDNA。采用qRT-PCR儀對(duì)目的基因Flotillin和內(nèi)參GAPDH進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系共10 μl：cDNA模板(50 ng/μl)1 μl，正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μl，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)5 μl，Rox reference dye(50×)0.2 μl，雙蒸水(ddH2O)3 μl，引物由上海生工生物公司設(shè)計(jì)并合成。Flotillin：正向：5′-GAATTCATGTTTTCACCTGTGG-3′，反向5′-CTGCAGCAAATAGTCCTGATCGTCG-3′;GAPDH:正向:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAA-3′,反向5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。反應(yīng)條件：95℃ 10 min；94℃ 5 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。采用2-ΔΔCt法對(duì)受試者血清中Flotillin mRNA表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

1.3.3MMSE評(píng)分〔7〕采用簡易MMSE評(píng)分進(jìn)行認(rèn)知功能評(píng)定。MMSE評(píng)分由20題30項(xiàng)內(nèi)容組成，分為5個(gè)方面，分別是定向力、記憶力、計(jì)算力、回憶、語言。受試者由一位固定醫(yī)師進(jìn)行MMSE測試。MMSE≥21分為輕度，MMSE 10～20分為中度，MMSE≤9分為重度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析、受試者工作特征(ROC)曲線、多因素Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清Flotillin mRNA水平及MMSE評(píng)分比較 AD組血清Flotillin mRNA水平高于對(duì)照組，MMSE總評(píng)分、定向力評(píng)分、記憶力評(píng)分、計(jì)算力評(píng)分、回憶評(píng)分、語言評(píng)分均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組血清Flotillin mRNA水平及MMSE評(píng)分比較

2.2AD早期患者血清中Flotillin mRNA水平與MMSE總評(píng)分的相關(guān)性 AD早期患者血清中Flotillin mRNA水平與MMSE總評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.586，P=0.000)。見圖1。

圖1 AD早期患者血清中Flotillin mRNA水平與MMSE總評(píng)分相關(guān)性

2.3血清中Flotillin mRNA水平對(duì)AD的診斷價(jià)值 以血清中Flotillin mRNA水平為檢驗(yàn)變量繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，血清Flotillin mRNA診斷AD的曲線下面積(AUC)為0.842(95%CI：0.767～0.917)，截?cái)嘀禐?.486，特異性為88.2%，敏感度為69.2%。見圖2。

圖2 血清中Flotillin mRNA水平對(duì)AD診斷價(jià)值的ROC曲線

2.4影響AD發(fā)生的Logistic回歸分析 以血清Flotillin mRNA水平與MMSE總評(píng)分為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示Flotillin mRNA高表達(dá)、MMSE低評(píng)分是影響AD發(fā)生的危險(xiǎn)因素。見表3。

表3 影響AD發(fā)生的多因素分析

3 討 論

AD病因迄今未明，免疫功能、感染、環(huán)境、精神狀態(tài)、神經(jīng)遞質(zhì)含量及文化程度等因素均可能是其誘發(fā)因素〔8〕?；颊甙l(fā)病后其認(rèn)知和判斷能力逐漸喪失、智力衰退、存在意識(shí)模糊和行為失常等情況，生活自理能力也隨之下降，為社會(huì)和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)〔9，10〕。但目前AD尚無較靈敏和特異的診斷方法，因此，尋找其早期診斷指標(biāo)顯得尤為重要。

MMSE評(píng)分是臨床智能精神檢查方法中與輕度AD相關(guān)性最好的方法，其方法較為簡便，僅需5～10 min，且評(píng)定人員只需短期訓(xùn)練即可操作，可作為大樣本流行病學(xué)調(diào)查的篩查工具〔11，12〕。但因其易受教育程度的影響，執(zhí)行功能難度低、敏感度較差，不能單獨(dú)用于AD的診斷〔13〕。丁非凡等〔14〕研究中AD患者的MMSE評(píng)分顯著高于對(duì)照組，與本研究結(jié)果一致。提示AD患者認(rèn)知功能減退，且癡呆較為嚴(yán)重，標(biāo)準(zhǔn)中MMSE≥21分為輕度，而部分健康受試者M(jìn)MSE總評(píng)分未得滿分，可能是由于其年齡較高，神經(jīng)系統(tǒng)開始老化，導(dǎo)致認(rèn)知功能略有減退，同時(shí)提示MMSE總評(píng)分與患者認(rèn)知功能具有較高的相關(guān)性。

Flotillin是脂筏的一種腳架蛋白，可參與人體的一些重要生理功能，包括輔助內(nèi)吞，參與T細(xì)胞的激活及其受體的補(bǔ)充，神經(jīng)元分化及軸突的再生等，同時(shí)還參與腫瘤進(jìn)程及某些神經(jīng)組織退化疾病〔15，16〕。研究表明，氧化應(yīng)激損傷在AD的發(fā)病中起著重要作用，腦內(nèi)的氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡是氧化應(yīng)激發(fā)生的直接原因，而Aβ在AD患者腦實(shí)質(zhì)中大量沉積，對(duì)神經(jīng)元造成一系列的毒性作用導(dǎo)致患者發(fā)病〔17〕。而Flotillin可以為淀粉樣前體蛋白(APP)生成Aβ提供平臺(tái)，其表達(dá)增加可使Aβ大量生成，超出患者清除能力，增加患者腦損傷〔18，19〕。本研究結(jié)果提示Flotillin mRNA與AD的發(fā)生、發(fā)展可能有密切聯(lián)系，其可能是通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元分化和軸突的再生在AD的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用〔15〕，也可能是由于Flotillin作為脂筏的主要組成成分和標(biāo)記物，影響APP生成Aβ，對(duì)其腦神經(jīng)元造成毒性作用，增加其腦損傷。除此之外，本研究結(jié)果中血清Flotillin mRNA水平與MMSE評(píng)分的相關(guān)性，進(jìn)一步提示Flotillin mRNA與AD有密切的聯(lián)系，對(duì)其認(rèn)知功能的損害可能有重要意義。本研究中血清Flotillin mRNA診斷AD的特異性較高，但敏感度較低，提示血清Flotillin mRNA作為診斷AD指標(biāo)時(shí)，可能不易與其他疾病相混淆。

綜上所述，血清Flotillin mRNA水平在AD患者中明顯升高，且與MMSE評(píng)分有一定的相關(guān)性。血清Flotillin mRNA可能有助于疾病早期診斷，對(duì)評(píng)價(jià)AD的早期危險(xiǎn)性有重要意義。進(jìn)一步研究Flotillin mRNA水平與AD的關(guān)系，可能對(duì)克雅病、瘋牛病等其他神經(jīng)組織疾病的發(fā)病機(jī)制及治療研究有重要意義。然而本研究樣本量有限，臨床應(yīng)用的可靠性仍然未知。且Flotillin mRNA影響AD的具體作用機(jī)制仍不明確，需加大樣本量進(jìn)一步深入探究。