微小RNA-20和線粒體融合蛋白1在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)情況及臨床意義

王曉健，鐘建明，劉小丹，曾慶芳

贛州市腫瘤醫(yī)院門診部，江西 贛州 341000

子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率居中國(guó)女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第2位，嚴(yán)重威脅女性的生命健康[1]。目前子宮內(nèi)膜癌的臨床治療效果并不理想，主要原因在于多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，腫瘤細(xì)胞已發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，臨床上迫切需要尋找子宮內(nèi)膜癌標(biāo)志物，以便進(jìn)行早期診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)。研究顯示，微小RNA（microRNA，miRNA）-20在肝癌、肺癌等多種腫瘤組織中均存在異常表達(dá)[2]。線粒體融合蛋白1（mitofusin 1，MFN1）是一種腫瘤相關(guān)蛋白，通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，MFN1可能是miRNA-20的靶基因，因此推測(cè)miRNA-20可能通過(guò)影響MFN1基因表達(dá)，調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，但具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步分析[3]。本研究檢測(cè)了子宮內(nèi)膜癌組織中miRNA-20和MFN1的表達(dá)水平，并探討了miRNA-20和MFN1表達(dá)情況與子宮內(nèi)膜癌患者臨床特征的關(guān)系，旨在為子宮內(nèi)膜癌的早期診斷、高危人群篩選及治療新靶點(diǎn)的尋找提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月至2019年1月于贛州市腫瘤醫(yī)院接受手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查確診為子宮內(nèi)膜癌；②接受手術(shù)治療，且術(shù)前未行放化療等抗腫瘤治療；③臨床資料和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入66例子宮內(nèi)膜癌患者。同時(shí)選取60例接受子宮全切術(shù)的子宮肌瘤患者作為對(duì)照。子宮內(nèi)膜癌患者的平均年齡為（52.10±8.29）歲；平均體重指數(shù)為（22.10±2.10）kg/m2；絕經(jīng)37例，未絕經(jīng)29例。子宮肌瘤患者的平均年齡為（50.38±9.11）歲；平均體重指數(shù)為（22.40±1.92）kg/m2；絕經(jīng)35例，未絕經(jīng)25例。子宮內(nèi)膜癌患者和子宮肌瘤患者的年齡、體重指數(shù)、絕經(jīng)情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。收集子宮內(nèi)膜癌患者的子宮內(nèi)膜癌組織66例和子宮肌瘤患者的正常子宮內(nèi)膜組織60例。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)miRNA-20的相對(duì)表達(dá)量

取子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本進(jìn)行研磨，加入1 ml Trizol試劑后經(jīng)氯仿抽提，加入異丙醇沉淀后獲得總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）兩步法將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火和延伸20 s，循環(huán)40次。miRNA-20上游引物為5'-CAAATGCTCATAGTGCAGGTAG-3'，下游引物在逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中；以β-actin為內(nèi)參，上游引物為5'-GGCGGCAACACCATGTACCCT-3'，下游引物為 5'-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3'。采用 2-△△Ct法計(jì)算 miRNA-20 的相對(duì)表達(dá)量[4]。

1.3 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)MFN1的表達(dá)情況

石蠟切片經(jīng)梯度乙醇脫蠟及水化，蒸餾水沖洗，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗2次，每次3 min，然后進(jìn)行抗原修復(fù)。為降低內(nèi)源性過(guò)氧化物酶造成的非特異性背景染色，采用H2O2室溫孵育10 min，然后PBS沖洗3次。滴加適當(dāng)比例稀釋的羊抗兔MFN1抗體（1∶1000），37℃溫箱中孵育30 min，4℃孵育過(guò)夜；滴加堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗后，37℃溫箱中孵育30 min，PBS沖洗3次；1 ml二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）混勻后滴加到切片上，孵育10 min后顯色，自來(lái)水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察[5]。

1.4 隨訪發(fā)法

所有患者均采用門診和電話等方式進(jìn)行隨訪。術(shù)后2年內(nèi)，每3個(gè)月隨訪1次，術(shù)后2～7年，每6個(gè)月隨訪1次，隨訪截止時(shí)間為2020年6月。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織中miRNA-20和MFN1表達(dá)情況的比較

子宮內(nèi)膜癌組織中miRNA-20的相對(duì)表達(dá)量為（0.65±0.12），明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織的（1.03±0.17），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-14.597，P＜0.01）。子宮內(nèi)膜癌組織中MFN1的陽(yáng)性表達(dá)率為48.48%（32/66），明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織的80.00%（48/60），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.467，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜癌組織中miRNA-20相對(duì)表達(dá)量的比較

不同年齡、體重指數(shù)、絕經(jīng)情況、病理類型的子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜癌組織中miRNA-20的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜癌組織中miRNA-20的相對(duì)表達(dá)量分別明顯低于FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

2.3 不同臨床特征子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜癌組織中MFN1陽(yáng)性表達(dá)率的比較

不同年齡、體重指數(shù)、絕經(jīng)情況、病理類型的子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜癌組織中MFN1的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜癌組織中MFN1的陽(yáng)性表達(dá)率分別明顯低于FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表2）

表1 不同臨床特征子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜癌組織中miRNA-20相對(duì)表達(dá)量的比較（n=66）

表2 不同臨床特征子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜癌組織中MFN1陽(yáng)性表達(dá)情況的比較（n=66）

2.4 預(yù)后因素分析

截至2020年6月，66例子宮內(nèi)膜癌患者的生存率為81.82%（54/66），中位生存期為77個(gè)月。以子宮內(nèi)膜癌患者的FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、miRNA-20相對(duì)表達(dá)量和MFN1表達(dá)情況作為自變量，以患者預(yù)后作為因變量進(jìn)行Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miRNA-20相對(duì)表達(dá)量和MFN1表達(dá)情況均是子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的影響因素（P＜0.01）。（表3）

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)病率僅次于宮頸癌的婦科惡性腫瘤，近年來(lái)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率呈逐年上升且年輕化趨勢(shì)。雖然子宮內(nèi)膜癌的治療技術(shù)與方法不斷發(fā)展，但對(duì)于中晚期子宮內(nèi)膜癌的治療效果仍欠佳，特別是晚期和復(fù)發(fā)的子宮內(nèi)膜癌患者，其治療效果不理想[6-8]。因此，進(jìn)一步探索子宮內(nèi)膜癌中具有特異性和敏感性的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)是對(duì)子宮內(nèi)膜癌進(jìn)行早期診斷、改善治療效果的關(guān)鍵。

miRNA可通過(guò)與靶基因3'端的完全或不完全互補(bǔ)結(jié)合而抑制目的基因的翻譯及表達(dá)。相關(guān)研究已證實(shí)，miRNA在不同類型腫瘤中均可呈異常表達(dá)并參與個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖、代謝、凋亡、遷移和侵襲等細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程[9-11]。線粒體分解蛋白與線粒體融合蛋白的相對(duì)平衡是保證線粒體功能正常的基礎(chǔ)，而線粒體功能可決定多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用。早期胚胎發(fā)育及卵母細(xì)胞成熟分裂的過(guò)程中，MFN1蛋白表達(dá)顯著增加，囊胚期MFN1蛋白的表達(dá)量處于最高峰，進(jìn)而參與卵母細(xì)胞的成熟分裂和組織的發(fā)育過(guò)程，這也提示MFN1與細(xì)胞的增殖、分裂具有密切聯(lián)系[12-15]。

本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中miRNA-20的相對(duì)表達(dá)量和MFN1的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織。超過(guò)半數(shù)的miRNA定位于或靠近染色體腫瘤區(qū)域，這些區(qū)域多存在基因缺失或異常擴(kuò)增，能夠調(diào)控多種重要的癌基因或抑癌基因，因此miRNA-20表達(dá)量下降可能影響相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。MFN1蛋白表達(dá)水平的升高可增強(qiáng)線粒體融合功能，進(jìn)而通過(guò)降低蛋白磷酸化水平和抑制胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2活化或周期蛋白的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，因此子宮內(nèi)膜癌組織中MFN1蛋白表達(dá)水平下降可提示細(xì)胞異常生長(zhǎng)，細(xì)胞異常增殖誘發(fā)癌變。

本研究結(jié)果還顯示，F(xiàn)IGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜癌組織中miRNA-20的相對(duì)表達(dá)量和MFN1的陽(yáng)性表達(dá)率分別明顯低于FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。該結(jié)果提示子宮內(nèi)膜癌組織中miRNA-20及MFN1的表達(dá)水平越低，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展越快。miRNA-20主要包裹在微小體、凋亡小體及其他外泌體中，能夠在化學(xué)修飾作用下與血漿小分子物質(zhì)形成蛋白復(fù)合體及囊泡，進(jìn)入機(jī)體并被轉(zhuǎn)運(yùn)至受體細(xì)胞，再通過(guò)內(nèi)吞、融合及結(jié)合受體等方式影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長(zhǎng)需要線粒體不斷裂變、聚變，生長(zhǎng)過(guò)程需要消耗較多能量，而MFN2介導(dǎo)線粒體融合過(guò)程中重要蛋白質(zhì)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)，MFN1作為MFN2的替補(bǔ)蛋白，MFN2高表達(dá)時(shí)，MFN1低表達(dá)。

表3 子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后影響因素的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析（n=66）

本研究的多因素分析結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miRNA-20相對(duì)表達(dá)量和MFN1表達(dá)情況均是子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的影響因素（P＜0.01）。研究證實(shí)，miRNA-20能夠調(diào)控抑癌基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、β-聯(lián)蛋白（β-catenin）等細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡[16-18]。因此，miRNA-20可能通過(guò)影響細(xì)胞的正常凋亡影響子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。MFN1具有細(xì)胞周期阻滯作用，可抑制細(xì)胞增殖和集落形成，削弱腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。因此MFN1低表達(dá)時(shí)，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞異常增殖，從而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，miRNA-20和MFN1在子宮內(nèi)膜癌組織中呈低表達(dá)，且其表達(dá)情況與患者的臨床特征和預(yù)后具有一定的關(guān)系。miRNA-20和MFN1有望成為子宮內(nèi)膜癌早期診斷、惡性程度及轉(zhuǎn)移潛能的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)，并有可能成為潛在的治療靶點(diǎn)，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步研究。