Wee1激酶作為腫瘤治療靶點的研究進展△

劉智慧，孟峻

1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，呼和浩特 010000

2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，呼和浩特 010000

研究表明，細胞修復(fù)受損傷的DNA是通過細胞周期檢查點實現(xiàn)的[1]。在正常細胞中，受損的DNA通常于G1/S期檢查點進行修復(fù)，而大多數(shù)惡性腫瘤細胞于G1/S期檢查點存在修復(fù)缺陷，主要與TP53基因的失活有關(guān)。因此，在多數(shù)情況下，腫瘤細胞會依賴G2/M期檢查點來修復(fù)受損的DNA。G2/M期檢查點主要依賴于Wee1蛋白激酶和細胞分裂周期因子25（cell division cyclin 25，CDC25）對細胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin dependent kinase 1，CDK1，又稱CDC2）進行翻譯后修飾。Wee1在第15位酪氨酸殘基（tyrosine 15，Y15）處磷酸化CDK1，在DNA復(fù)制過程中造成G2/M期阻滯[2]。上述分子事件為細胞有絲分裂前的DNA修復(fù)提供了檢查點，但在DNA損傷的背景下抑制細胞周期檢查點會導(dǎo)致?lián)p傷持續(xù)，最終導(dǎo)致細胞凋亡，這是無法彌補的遺傳損傷。早期臨床研究主要集中在DNA損傷劑存在的情況下調(diào)節(jié)Wee1的活性和廢除G2期DNA損傷修復(fù)檢查點，利用有絲分裂災(zāi)難的概念作為抗腫瘤活性的機制。體外研究表明，Wee1在穩(wěn)定復(fù)制叉和同源重組修復(fù)中也起著重要作用[3]。Wee1在DNA修復(fù)中發(fā)揮了更大的作用，進一步支持了其作為惡性腫瘤治療中可行治療靶點的有效性。

1 Wee1在細胞周期和DNA 損傷修復(fù)中的作用

細胞周期檢查點與細胞周期阻滯和DNA損傷反應(yīng)的關(guān)系密切，對修復(fù)和維持基因組的完整性具有重要意義。p53主要通過ATM（ATR）/CHK1（CHK2）-p53/MDM2-p21通路誘導(dǎo)持續(xù)或永久性的G1期阻滯。但是，目前研究表明，多數(shù)腫瘤存在p53基因的突變和缺失，這就更加依賴于G2/M期的檢查點，而Wee1是G2/M期阻滯的關(guān)鍵激酶[4]。Wee1通過磷酸化CDK1、調(diào)節(jié)CDK1/細胞周期蛋白B（cyclin B）復(fù)合物的活性，從而實現(xiàn)對細胞周期的調(diào)控。作為G2/M期檢查點的組成部分，Wee1決定進入有絲分裂的時間點，并抑制細胞周期的早期進展，同時也參與細胞對DNA的損傷反應(yīng)[5-6]。Wee1還通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclin dependent kinase 2，CDK2）的磷酸化狀態(tài)維持DNA復(fù)制過程中復(fù)制叉的穩(wěn)定[7]。

2 Wee1蛋白激酶抑制劑

MK-1775是一種高效的、選擇性的Wee1小分子抑制劑，屬于吡唑嘧啶衍生物，其半抑制濃度（50%inhibiting concentration，IC50）為 5 nmol/L[8]。MK-1775與放療、化療相結(jié)合的多項臨床試驗（Ⅰ期和Ⅱ期）正在進行中，包括以下試驗：①作為肉瘤細胞和難治性實體瘤的單一療法[9-10]；②作為乳腺癌的單一療法[11]；③聯(lián)合吉西他濱、5-氟尿嘧啶、順鉑和卡鉑在卵巢癌和結(jié)腸癌中的應(yīng)用[12-13]；④聯(lián)合放射治療在膠質(zhì)母細胞瘤中的應(yīng)用[14]；⑤聯(lián)合吉西他濱在胰腺移植瘤中的應(yīng)用[15]。上述研究表明Wee1蛋白激酶抑制劑在臨床上既可作為單一治療方法，亦可與傳統(tǒng)的DNA損傷劑聯(lián)合使用。

3 Wee1蛋白激酶抑制劑對不同腫瘤細胞的靶向治療作用

3.1 Wee1蛋白激酶抑制劑與乳腺癌細胞

一項評估Wee1沉默對乳腺癌細胞系MCF-7（攜帶野生型p53）和MDA-MB-468（含突變型）抑瘤作用的研究發(fā)現(xiàn)，敲除Wee1基因?qū)毎蛲鲆蜃觩53、B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）和血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothlial growth factor，VEGF）的表達產(chǎn)生影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Wee1沉默可使MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌細胞株的活力降低50%以上；DNA含量測定結(jié)果顯示，沉默1周后，細胞的凋亡數(shù)量明顯增加；Wee1蛋白激酶抑制劑也誘導(dǎo)了乳腺癌細胞中p53的表達上調(diào)，并且兩種細胞株中VEGF和Bcl-2的表達水平均明顯降低[16]，表明抑制Wee1可導(dǎo)致乳腺癌細胞G2期阻滯消失，進而導(dǎo)致細胞凋亡，而乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-468對Wee1沉默的敏感性似乎與p53的表達水平一致。抑制Wee1會使p53缺陷的腫瘤細胞對放化療敏感，其原因可能是由p53突變的腫瘤細胞G1檢查點缺失和Wee1或CHK1抑制后G2檢查點缺失的聯(lián)合作用導(dǎo)致的，其共同促進細胞增殖，盡管存在未修復(fù)的DNA損傷。目前，針對人類表皮生長因子2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽性乳腺癌患者的治療策略是使用HER2受體靶向藥物曲妥珠單抗，但約70%的患者發(fā)生了對曲妥珠單抗抵抗的現(xiàn)象[17]。同時，新的證據(jù)表明，腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）與曲妥珠單抗抵抗密切相關(guān)，其促進了腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[18]。Sand等[19]的研究表明，MK-1775通過抑制腫瘤細胞的活性和增殖以及誘導(dǎo)其凋亡從而靶向曲妥珠單抗耐藥的HER2陽性乳腺癌細胞；該研究還發(fā)現(xiàn)，MK-1775是通過抑制黏蛋白1（mucin 1，MUC1）的表達從而靶向誘導(dǎo)CSC的形成。其中，MUC1是一種評價抗曲妥珠單抗功能性的生物標(biāo)志物，其裂解產(chǎn)物在腫瘤細胞和胚胎干細胞中充當(dāng)生長因子受體[20]。Mir等[21]發(fā)現(xiàn)Wee1抑制劑可以克服CSC對輻射的抵抗。Zhou等[22]證明了Wee1或CHK1靶向藥物與組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制劑聯(lián)合治療對某些白血病干細胞樣細胞有效。由此可以假設(shè)MK-1775也可以有效地靶向其他惡性腫瘤，但這些惡性腫瘤既往由于CSC亞群而表現(xiàn)出對一線治療的抵抗，因此仍需進一步驗證。

3.2 Wee1蛋白激酶抑制劑與黑色素瘤細胞

通過靶向關(guān)鍵細胞的途徑治療黑色素瘤已經(jīng)取得了重大進展，但許多患者對治療產(chǎn)生了耐藥性或治療后復(fù)發(fā)，因此仍需尋找其他靶點。微小RNA（microRNA，miRNA）-155對黑色素瘤細胞的生長具有抑制作用[23]。一項檢測黑色素瘤中miRNA-155表達情況的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)黑色素瘤中的miRNA-155的表達水平較低，但不能預(yù)測患者的預(yù)后情況；在小鼠實驗性轉(zhuǎn)移模型中發(fā)現(xiàn)miRNA-155、Wee1的表達情況與黑色素瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移有關(guān)[24]，確認了Wee1是miRNA-155的新靶點，表明miRNA-155的高表達和Wee1的沉默均可減少小鼠模型中黑色素瘤細胞的轉(zhuǎn)移，且其能夠通過調(diào)節(jié)Wee1激酶的表達從而調(diào)控黑色素瘤的轉(zhuǎn)移，Wee1也對細胞周期具有調(diào)節(jié)作用。miRNA-155、Wee1與其他驅(qū)動黑色素瘤生長和轉(zhuǎn)移的細胞過程的關(guān)系尚待今后的研究進一步闡明，為黑色素瘤的靶向治療提供新的理論依據(jù)。

3.3 Wee1抑制劑與結(jié)直腸癌細胞

結(jié)直腸癌是男性第二高發(fā)的惡性腫瘤，僅次于前列腺癌[25]。早期篩查可降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率[26]。然而，傳統(tǒng)化療藥物對晚期結(jié)直腸癌患者的治療效果不佳，導(dǎo)致晚期患者預(yù)后差。有研究表明，抑制Wee1的表達僅能增強DNA損傷相關(guān)藥物和放療對p53缺陷的腫瘤細胞的作用[27]。但也研究表明，Wee1對p53野生型和突變型腫瘤均具有化療增敏效果[28]。Yin等[29]通過分析Wee1抑制劑MK-1775對p53突變型結(jié)腸癌細胞HT29和SW480的抗腫瘤作用發(fā)現(xiàn)，MK-1775能明顯抑制結(jié)腸癌細胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。有研究已發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測結(jié)果顯示，MK-1775可以劑量依賴性地增加DNA損傷標(biāo)志物組蛋白H2A的一種亞型（γ-H2AX）。MK-1775還可提高HT29和SW480細胞對伊立替康的敏感性[30-31]，與相關(guān)研究結(jié)果一致[29]。雖然MK-1775單藥治療在p53突變的結(jié)腸癌細胞中可以起到抗腫瘤作用，但由于靶向細胞周期檢查點的藥物具有毒性，因此，治療劑量是一個重要問題。有研究采取了適當(dāng)?shù)牟呗砸蕴岣吣[瘤細胞對細胞毒性效應(yīng)的敏感性[32-33]。

3.4 Wee1抑制劑與肺癌細胞

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要病理類型。早期NSCLC以手術(shù)、輔助化療或放療為主，晚期NSCLC患者主要采取針對表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）/間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）/鼠類肉瘤病毒癌基因同源物 B1（v-raf murine sarcoma viraloncogene homolog，BRAF）等基因突變的靶向治療和免疫治療方法[34-35]。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）是EGFR突變的NSCLC的一線治療藥物。但是，治療后9～14個月，接受EGFR-TKI治療的患者不可避免地會產(chǎn)生耐藥性。有研究表明，在EGFR-TKI耐藥細胞系中，Wee1的表達水平較高，并且隨著G2/M細胞周期的延長，Wee1的表達水平逐漸增加；58.3%（7/12）的獲得性伊克替尼/吉非替尼耐藥患者的Wee1表達水平高于其初始表達水平；當(dāng)敲除EGFR-TKI耐藥的H1299和PC9/G2細胞的Wee1基因后，順鉑和吉西他濱對兩種細胞株的作用增強，主要體現(xiàn)在H1299組順鉑的IC50值由 8.64 μg/ml降至 3.10 μg/ml，而 PC9/G2 組順鉑的IC50值由3.66 μg/ml降至0.97 μg/ml；表明Wee1基因的敲除可增強EGFR-TKI耐藥的NSCLC的化療敏感性[36]。此外，Liu等[37]對663例NSCLC患者進行了Wee1基因多態(tài)性與化療療效相關(guān)性的研究，結(jié)果顯示，Wee1 rs3910384 G/G純合基因型晚期NSCLC患者經(jīng)順鉑和吉西他濱方案治療后，總生存期延長13.5個月，無進展生存期延長3.2個月，3年生存期延長13.5個月，說明Wee1 rs3910384 G/G純合基因型晚期NSCLC患者對順鉑和吉西他濱化療方案敏感。因此，Wee1 rs3910384 G/G純合基因型可作為一個潛在的工具來決定化療方案，以促進NSCLC患者個性化治療的實現(xiàn)。

3.5 Wee1抑制劑與胰腺癌細胞

胰腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDA）是一種致死性疾病，5年生存率低，缺乏有效的靶向治療方案是其主要原因[25]。盡管從PDA基因組測序中收集了大量的遺傳知識，但目前尚無美國食品藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的靶向治療PDA特定遺傳變異的有效方案。有研究證明，PDA細胞中RNA結(jié)合蛋白Hur的沉默會使PDA細胞對某些DNA損傷劑敏感，而Hur的過表達會引起抵抗，這與Hur對Wee1表達的快速上調(diào)有關(guān)[38]。當(dāng)DNA出現(xiàn)損傷時，Hur對Wee1表達的調(diào)節(jié)作用是通過促進CDK1的磷酸化從而激活G2/M期檢查點實現(xiàn)的。這種新的應(yīng)激反應(yīng)機制支持PDA的耐藥表型，并證明Wee1的快速翻譯可防止PDA細胞發(fā)生災(zāi)難性DNA損傷[38-39]。Kausar等[40]研究發(fā)現(xiàn)，MK-1775可使同源重組（homologous recombination，HR）功能正常的PDA細胞對吉西他濱化療敏感，盡管Wee1的抑制機制與G2/M期檢查點的取消有關(guān)，但此種機制可能不足以使HR功能正常的PDA細胞致敏。相反，根據(jù)研究結(jié)果更支持這樣的假設(shè)，即Wee1的抑制對化療的敏感性與HR的抑制有關(guān)，持續(xù)的輻射能夠使DNA發(fā)生損傷。因此，抑制HR的修復(fù)是MK-1775治療胰腺癌的一個重要作用機制，推斷MK-1775與化療聯(lián)合治療胰腺癌可能有效。

4 小結(jié)與展望

MK-1775在多種惡性腫瘤細胞中具有細胞毒性，其機制是由于DNA復(fù)制過程中DNA損傷后未及時修復(fù)而提前進入分裂期從而引起腫瘤細胞凋亡。MK-1775對Wee1的化學(xué)抑制作用可以加強各種DNA損傷劑的細胞毒性，并且在p53缺失的惡性腫瘤中表現(xiàn)得更加明顯，亦支撐了G1檢查點缺陷時腫瘤在很大程度上依賴G2檢查點逃避有絲分裂的致命性的觀點[41]。MK-1775單一用藥或與其他化療藥物聯(lián)合使用對多數(shù)惡性腫瘤均表現(xiàn)出較強的抗腫瘤活性。然而，目前仍存在一些問題，如當(dāng)Wee1抑制劑與DNA損傷藥物聯(lián)合使用時，Wee1的表達水平在聯(lián)合用藥的過程中是否能夠保持穩(wěn)定；MK-1775的療效是否與其他分子環(huán)境等有關(guān)。因此，未來的研究需要確定細胞周期檢查點、DNA損傷修復(fù)和DNA復(fù)制對Wee1抑制劑單獨用藥或與其他藥物聯(lián)合治療腫瘤時的作用。