基質(zhì)金屬蛋白酶-28 與特發(fā)性肺纖維化

嚴(yán)梅，黃金霞，楊朝

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川；2.蘇州科技城醫(yī)院，江蘇 蘇州）

0 引言

特發(fā)性肺纖維化( Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF) 是一種原因不明的慢性進(jìn)行性纖維化性間質(zhì)性肺炎，表現(xiàn)為漸進(jìn)性呼吸困難和肺功能惡化，肺組織學(xué)和/或影像學(xué)表現(xiàn)為普通型間質(zhì)性肺炎( usual interstitial pneumonia，UIP)[1]。IPF 的死亡率較高，中位生存期僅為3-5 年[2]。其發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cells，AECs) 的損傷和異常修復(fù)，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的異常沉積以及纖維細(xì)胞的增殖和活化[3-5]共同參與IPF 的發(fā)病過程，導(dǎo)致肺部結(jié)構(gòu)破壞和呼吸功能的喪失。

基質(zhì)金屬蛋白酶( matrixmetalloproteinases，MMPs) 是一類依賴于Zn2+和Ca 2+的蛋白水解酶，其催化活性位點(diǎn)中具有保守的鋅結(jié)合基序，能夠降解ECM[6]，且在細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、血管生成、組織再生和免疫應(yīng)答中起重要作用[7]?；|(zhì)金屬蛋白酶-28 ( matrix metalloproteinase28，MMP-28) 是MMPs 家族中最新的成員之一，目前有關(guān)MMP-28 研究正處于起步階段，對于MMP-28 的結(jié)構(gòu)、表達(dá)、功能以及調(diào)節(jié)等機(jī)制尚未完全闡明。據(jù)報道，MMP-28 在皮膚癌、肝癌和某些心臟疾病(如急性心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛) 中表達(dá)上調(diào)[8-12]。而MMP-28 在IPF 的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及潛在應(yīng)用價值尚未見報道，現(xiàn)對MMP-28 的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)及其在肺纖維化中的作用進(jìn)行綜述。

1 MMP-28 的結(jié)構(gòu)

MMPs 是一類結(jié)構(gòu)上高度保守的鋅依賴性內(nèi)肽酶，至少包含三個結(jié)構(gòu)域，信號肽與前肽區(qū)結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域以及通過鉸鏈區(qū)連結(jié)的血紅素結(jié)合蛋白樣C 末端結(jié)構(gòu)域，三個區(qū)域各有特殊功能[13-14]。MMP-28 最初是從人類角化上皮和睪丸的cDNA 文庫中克隆而來，相對分子量為59Kd，可編碼520 個氨基酸序列。對MMPs 的氨基酸序列進(jìn)行對比后發(fā)現(xiàn)，MMP-28 與MMP-19 具有同源相似性，推斷其為MMP-19 的一個亞族[15]。MMP-28 包含了所有MMP 典型的結(jié)構(gòu)域，疏水信號肽結(jié)構(gòu)域后緊接著包含PRCGVTD 的前肽結(jié)構(gòu)域，前肽序列C 末端有一其獨(dú)有的弗林蛋白酶激活序列RRKKR，表明MMP-28 可被弗林蛋白在細(xì)胞內(nèi)激活[15-16]。MMP-28 的催化結(jié)構(gòu)域是可溶性MMP 所具有的典型結(jié)構(gòu)，但在催化序列HEIGHTLGLTH 中含有其他MMPs 所沒有的蘇氨酸[17]。另外還包括鉸鏈區(qū)及其后的血紅素樣結(jié)構(gòu)域。此外，MMP-28 的啟動子在結(jié)構(gòu)上具有特異性，其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)沒有TATAbox 或cCAAT 序列，且具有“半胱氨酸開關(guān)”。MMP-28 的啟動子需特異性結(jié)合sp 家族的轉(zhuǎn)錄因子GT-box 序列才能進(jìn)一步啟動其活性[18]。因此，與MMPs 中其它的成員相比，MMP-28 在結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性，但又有明顯的不同之處，提示其在機(jī)體生理及病理過程內(nèi)具有獨(dú)特功能。

2 MMP-28 與特發(fā)性肺纖維化

IPF 是一種起始原因不明的異常生物學(xué)進(jìn)程，過量的ECM 沉積于肺內(nèi)，導(dǎo)致反復(fù)的AECs 損傷、肺組織修復(fù)以及周圍血管新生重構(gòu)異常，使肺泡正常功能喪失，最終引起肺組織變形、瘢痕組織形成及肺功能受損[19]。IPF 患者的血和肺組織中MMP-28 水平升高及肺纖維化動物模型的肺組織中MMP-28 含量增加均提示MMP-28 與肺纖維化相關(guān)[20,23]。另外研究還發(fā)現(xiàn)MMP-28 在博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中表達(dá)上調(diào)，而MMP-28-/-小鼠不會出現(xiàn)肺纖維化表現(xiàn)，提示了它的促纖維化作用[20]。

2.1 來源

MMP-28 在人的基底部皮膚、基底上部的角化細(xì)胞、精原細(xì)胞以及神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育過程中高表達(dá)[15]。在肺內(nèi)同樣有著MMP- 28 群體的存在，在小鼠體外肺組織以及流感病毒感染模型中，已經(jīng)證明MMP-28 由促進(jìn)上皮細(xì)胞存活的Club 細(xì)胞表達(dá)[21-22]。而在IPF 患者肺組織中，免疫組化顯示MMP-28 在AECs 表達(dá)強(qiáng)陽性，提示AECs 分泌MMP-28[23]。Maldonado 等人同樣發(fā)現(xiàn)MMP-28主要由上皮細(xì)胞表達(dá)，特別是AECs 和支氣管上皮細(xì)胞(bronchial epithelial cells，BECs)，且定位于BEC 頂端和細(xì)胞質(zhì)以及AECs 細(xì)胞質(zhì)和核內(nèi)[20,24]。

2.2 作用機(jī)制

2.2.1 促進(jìn)炎癥反應(yīng)

在肺纖維化的早期炎癥階段，主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞脫落、炎癥細(xì)胞浸潤和細(xì)胞因子調(diào)控失衡，巨噬細(xì)胞是最早分泌炎癥因子參與IPF 致病過程的細(xì)胞之一。按其功能可分為M1 型和M2 型，Ml 型分泌促炎因子和趨化因子，而M2 型分泌抗炎因子并清除肺內(nèi)炎性細(xì)胞，發(fā)揮其抗炎作用，M1/M2 失衡參與肺部炎癥反應(yīng)的調(diào)控[25]。在一項動物模型試驗中，敲除MMP-28 基因的小鼠肺組織MMP-28 表達(dá)水平下降，巨噬細(xì)胞M2 表型極化降低，且與野生型小鼠相比，博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化程度減弱[26]。Manicone 等人發(fā)現(xiàn)暴露于慢性香煙煙霧的MMP-28-/- 小鼠炎癥反應(yīng)減弱，且不發(fā)生肺氣腫，部分原因可能是由于巨噬細(xì)胞M2 型水平降低，提示MMP-28 可促進(jìn)肺部慢性炎癥及組織重構(gòu)[27]。為了闡述調(diào)控巨噬細(xì)胞表達(dá)MMP-28 的信號分子，研究人員用LPS 及 poly(I：C) 刺激巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)MMP-28 表達(dá)增加依賴于TRIF- 和I 型IFN，且MMP-28-/-小鼠巨噬細(xì)胞中CCL 2、CCl 4、cxcl 10 和IL 6 的表達(dá)增加，提示巨噬細(xì)胞整合了TRF-和I 型IFN 依賴性信號通路通過調(diào)節(jié)MMP-28 的表達(dá)參與了ECM 的修飾[28]。

2.2.2 促進(jìn)細(xì)胞增殖

反復(fù)的AECs 損傷和AEC 層的破壞可觸發(fā)肺組織纖維化反應(yīng)，受損的上皮細(xì)胞不能參與正常的組織重塑以及重建正常上皮屏障，且肌成纖維細(xì)胞的異常增殖以及循環(huán)細(xì)胞進(jìn)入肺組織，促進(jìn)了纖維化進(jìn)程[29]。Saarialho 等人發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞損傷后，TNF-α 通過NF-kB 通路產(chǎn)生的級聯(lián)效應(yīng)調(diào)節(jié)MMP-28 的產(chǎn)生[30]。此外，MMP-28 在AECs 中的過表達(dá)顯著提高了其生長和增殖速率，與之相反的是，當(dāng)MMP-28 基因沉默時，其生長和增殖率顯著降低。同樣，將人MMP-28 轉(zhuǎn)染大鼠AECs 后，其生長和增殖率也顯著升高。對于原代人BECs，沉默MMP-28 基因也觀察到細(xì)胞生長和增殖率顯著降低[20]。因此，MMP-28 在IPF 表達(dá)增加，并且以一種催化劑依賴的方式促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖及表型的轉(zhuǎn)化從而發(fā)揮促纖維化作用。

2.2.3 促進(jìn)間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

肺纖維化發(fā)病過程中的關(guān)鍵因素還包括肺泡上皮的損傷和成纖維細(xì)胞相互作用以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[31]。EMT 通過其上游相關(guān)信號通路引起纖維化效應(yīng)，其中TGF-β 及其有關(guān)蛋白是最重要的細(xì)胞因子，而MMP-28可通過誘導(dǎo)TGF-β 的表達(dá)介導(dǎo)EMT 的發(fā)生，干預(yù)或阻斷EMT 的相關(guān)效應(yīng)分子，可抑制肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，為延緩IPF 進(jìn)展提供了一個新思路[32-33]。通過在A549 肺腺癌細(xì)胞中表達(dá)重組MMP-28，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面E- 鈣粘蛋白丟失，潛在TGF-β 復(fù)合物水解增多和活性TGF-β 水平的增加，均導(dǎo)致了穩(wěn)定且不可逆的EMT，而MMP 抑制劑GM6001 或中和TGF- 活性的抗體可阻止導(dǎo)致EMT產(chǎn)生的一系列級聯(lián)反應(yīng)。一旦EMT 發(fā)生，細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化不能被MMP 抑制劑逆轉(zhuǎn)[34]。并且MMP-28 也可以通過激活Notch3 信號通路促進(jìn)EMT 的發(fā)生[35]。

2.2.4 抑制細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡抵抗是肺纖維化進(jìn)行性發(fā)展的重要原因之一，其中損傷的AECs 持續(xù)累積會影響細(xì)胞干性，從而出現(xiàn)細(xì)胞凋亡或衰老失控，另外在損傷修復(fù)階段，肌成纖維細(xì)胞持續(xù)存在且存在凋亡缺陷，當(dāng)衰老組織細(xì)胞不能被免疫細(xì)胞清除，大量累積并分泌細(xì)胞因子改變微環(huán)境，對肺纖維化有促進(jìn)作用[36-38]。Manicone 等人在兩個肺上皮細(xì)胞系(A549 和BEAS-2b) 中培育了正常表達(dá)的野生型和無催化活性的突變型MMP-28 細(xì)胞系，不論在血清剝奪或者使用蛋白酶抑制劑十字孢堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的實驗中，觀察到MMP-28 的過度表達(dá)對細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。此外，與野生型小鼠相比，來自流感感染MMP-28-/- 小鼠的肺組織中caspase-3/7 活性增加，這種活性局限于氣道上皮，但與病毒載量的變化無關(guān)。因此，確定了MMP-28 在促進(jìn)肺上皮細(xì)胞存活中的新作用[22]。同樣，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MMP-28 的上調(diào)通過激活TGF-β 來誘導(dǎo)細(xì)胞生長并減少膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。此外，TGF-β抑制劑則減弱了MMP-28 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用[39]。

2.2.5 促進(jìn)細(xì)胞遷移

在各種損傷因素的刺激下，肺組織多種細(xì)胞被激活，經(jīng)過上皮細(xì)胞基膜的間隙遷移至肺泡損傷處，并在該處沉積、增殖以及分泌ECM，啟動損傷修復(fù)過程，最終導(dǎo)致肺纖維化[40-41]。在劃痕愈合試驗中高表達(dá)的MMP-28 增強(qiáng)了上皮細(xì)胞通過I 型膠原包被的Boyden 室進(jìn)行的細(xì)胞遷移，且抑制鈣粘蛋白的表達(dá)，促進(jìn)纖維連接蛋白的表達(dá)，而用shRNA 沉默MMP-28 基因得到相反的結(jié)果。為了更深入了解其作用機(jī)制，用單氨基酸替代產(chǎn)生的無催化活性MMP-28 突變體則無增強(qiáng)細(xì)胞增殖和遷移的能力，因此IPF 中表達(dá)的MMP-28 可能以催化依賴的方式增強(qiáng)了上皮細(xì)胞的存活、增殖、遷移和EMT[42]。另外分子間伴侶Furin 通過與MMP-28 前肽結(jié)構(gòu)域的YL 基序相互作用，可促進(jìn)上皮細(xì)胞MMP-28 的分泌，將MMP-28 cDNA 轉(zhuǎn)染COS-1 細(xì)胞后，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，證明Furin 共轉(zhuǎn)染促進(jìn)細(xì)胞的遷移[43]。

3 MMP-28 抑制劑的應(yīng)用

MMPs 的抑制劑主要分為兩大類，一類為天然組織抑制因子-金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPS)。TIMP 是一種多基因家族的編碼蛋白質(zhì)，在ECM 降解調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用，分別為TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4，MMPS 與TIMPS 的平衡失調(diào)與肺纖維化的發(fā)生有關(guān)[44-45]。在肺纖維化動物模型中，TIMP-1 和TIMP-2 被誘導(dǎo)高表達(dá)[46]。對TIMPS 基因敲除小鼠的研究表明，TIMPS 可通過控制細(xì)胞功能來限制ECM 的沉積和減少ECM 的豐度[47-48]。博萊霉素誘導(dǎo)的TIMP1-/-小鼠其肺纖維化反應(yīng)與野生型小鼠相比無明顯差異，但TIMP1-/- 小鼠的炎癥明顯增加，提示TIMP1 在限制肺損傷后的炎癥中起著關(guān)鍵作用[49]。因此，未來可將調(diào)控 MMPs 與 TIMPs 之間的平衡作為控制纖維化疾病的新靶點(diǎn)。

另外一類MMPs 抑制劑包括Kruppel 樣因子9(KLF9)，KLF9是參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的鋅指蛋白之一，通過多種信號途徑以及與細(xì)胞內(nèi)不同蛋白的相互作用，影響細(xì)胞的增殖及凋亡。KLF9 與MMP-28 的啟動子區(qū)可特異性結(jié)合，實時定量PCR 和雙熒光素酶試驗表明KLF9 可直接抑制MMP-28 轉(zhuǎn)錄，而體內(nèi)增強(qiáng)的MMP-28 表達(dá)可減弱由異位KLF9 引起的細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的降低，因此KLF9 通過抑制MMP-28 轉(zhuǎn)錄顯著抑制細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。將KLF9 應(yīng)用于IPF 患者延緩肺纖維化的進(jìn)程尚需進(jìn)一步驗證[50]。

同時，一些合成的MMP 抑制劑也被開發(fā)出來，但大多數(shù)為廣譜抑制劑，同時對多個MMP 都有作用，并可能引起不良的肌肉骨骼副作用，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受限。目前多西環(huán)素是美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的唯一一種MMP 抑制劑，將其應(yīng)用于IPF 治療尚未進(jìn)行大規(guī)模的臨床驗證[51]。新一代的生物合成MMP 抑制劑可能顯示出更高的MMP 特異性和更少的副作用，并且可能有助于針對特定的MMP，減少不受限制的組織重塑，從而用于MMP 病理相關(guān)疾病的治療。

4 展望

IPF 已成為嚴(yán)重威脅人類健康與生命的疾病之一，近年來有逐漸增多趨勢，具有高發(fā)病率及高病死率，臨床上缺乏有效的治療方案。目前有關(guān) MMP-28 的研究尚處于初始階段，關(guān)于其在肺纖維化過程中的致病機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。相信隨著對MMP-28的深入研究，將會為臨床上IPF 的發(fā)病機(jī)制乃至治療提供新思路。