加熱溫度對海鱸魚肌肉品質的影響

吳燕燕，李金星,2，王悅齊，陳勝軍，鄧建朝

(1 中國水產科學研究院南海水產研究所，農業(yè)農村部水產品加工重點實驗室，廣東 廣州 510300；2 廣東海洋大學食品學院，廣東 湛江524088)

海鱸魚(Lateolabraxjaponicus)又名花鱸、七星鱸等，國外主要分布于地中海和大西洋及其近岸水域[1]，國內主要分布于南海、東海和渤海等沿海地區(qū)。中國海鱸魚養(yǎng)殖可以追溯到20世紀60年代，70年代實現(xiàn)批量生產[2]。近年來中國海鱸魚的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，2019年海鱸養(yǎng)殖產量已達18萬t[3]。海鱸魚肉質細膩、味道鮮美、少有魚骨、富含蛋白質和不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質[4-5]，深受消費者喜愛。熱處理是肉制品加工的一種簡單且廣泛應用的加工方式，通過滅活病原體來提高食物的食用質量和衛(wèi)生質量，可以改變肉的組織結構、賦予特殊的風味和色澤、確保食品安全的同時延長貨架期[6-7]。計紅芳等[8]研究加熱溫度對鵝肉理化性質、質構與微觀結構的影響，發(fā)現(xiàn)鵝肉較適宜的加熱溫度為90 ℃～95 ℃。王科瑜等[9]研究了不同中心溫度的蒸制過程中大口黑鱸品質的變化，從色差、質構、風味物質和感官評價方面綜合考慮，加熱溫度65 ℃～75 ℃，魚肉品質突出。海鱸魚肌肉特性受熱加工處理的影響較大，然而不同加熱溫度對海鱸魚肌肉特性的影響及其機制的研究卻鮮見報道。

以海鱸魚為研究對象，研究加熱溫度對海鱸魚肌肉特性的影響，旨在為海鱸魚的合理加工利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與主要儀器

鮮活海鱸魚，購自當?shù)爻校课操|量約400～600 g，體長25～35 cm。超微量Ca2+-ATP酶測試盒、總巰基測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；Bradford蛋白質量濃度測定試劑盒、SDS-PAGE試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(2X)及BeyoColorTM彩色預染蛋白，購自上海碧云天生物技術有限公司。

主要試驗設備儀器：3K30臺式高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；T50均質機(德國IKA公司)；Powerpac@ Basic基礎電泳儀(美國Bio-Rad公司)；GB204電子天平(瑞士METTLLER公司)；DHG-9145A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；Sunrise-basic Tacan SUNRISE吸光酶標儀(瑞士TECAN公司)；QTS-25質構儀(英國CNS FARNELL公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

快速擊暈海鱸魚，去除鰓、鱗、皮和內臟后用清水沖洗魚體，沿背脊取出兩片魚肉，將魚肉切成2 cm×2 cm×1 cm 的樣品備用。將數(shù)字溫度計(精確度為0.1 ℃)的探頭插入蒸煮袋中海鱸魚魚片的幾何中心，立即放入溫度分別為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃的恒溫水浴鍋和100 ℃沸水浴鍋中隔水加熱，直至魚肉中心溫度分別達到40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃。取出魚塊并冷卻至室溫后，經真空密封袋包裝后放置在超低溫(-80 ℃)下保存，保存時間不超過5 d。

1.2.2 色澤和質構的測定

取魚背部、腹部、尾部的魚肉，去皮，修整為2 cm×2 cm×1 cm的長方塊，采用色差儀于室溫下測定魚塊正反面的L*值(亮度值)、a*值(紅度值)、b*值(黃度值)。每個溫度測定3個樣品，每個樣品測定3次；使用質地多面分析法(TPA) 測試模式；通過二次壓縮法測量質構。使用的平底柱形探頭直徑4 mm，觸發(fā)點負載5.0 g，設置目標值4.00 mm，測試速度1.00 mm/s。每組試驗重復測量10次，去除數(shù)據異常值后取平均值。

1.2.3 水分含量和加熱失重率的測定

水分含量的測定：按照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》[10]方法中的直接干燥法測定。

加熱失重率測定：加熱前，用濾紙擦拭魚片表面并稱重；加熱后，冷卻至室溫，用濾紙吸干魚片表面并再次稱重；依據魚片樣品在烹飪前后的質量變化計算失重率。每個溫度測定3個樣品，每個樣品重復測定3次，取平均值。

1.2.4 肌原纖維蛋白的提取及濃度測定

參考Benjakul等[11]的方法并略有修改，取魚肉1.0 g，加入10 mL預先冷卻(0 ℃～ 4 ℃)的KCl 溶液(0.1 mol /L，pH 7.0)，在冰水浴條件下均質(10 000 r /min)分散2 min，每均質10 s停10 s，以防過熱。然后將分散液在4 ℃下以12 000 r /min的速度離心15 min， 去除上清液，所得沉淀加入8倍體積 KCl 溶液(0.6 mol /L，pH 7.0)，再均質勻漿，于4 ℃冰箱內靜置1 h，在4 ℃條件下15 000 r /min離心20 min。取上清液，按照上海碧云天生物技術有限公司Bradford蛋白濃度測定試劑盒所提供的方法，借助酶標儀測定肌原纖維蛋白質量濃度。

1.2.5 總巰基含量和 Ca2+-ATP酶活性的測定

使用南京建成生物工程研究所的總巰基測定試劑盒及酶標儀測量肌原纖維蛋白的總巰基含量；參照該所超微量Ca2+-ATP酶測試盒所提供的方法，配合使用酶標儀測定肌動球蛋白Ca2+-ATP酶的活性。

1.2.6 表面疏水性的測定

參照Chelh等[12]的方法并略做修改。取1 mL肌原纖維蛋白溶液，加入0.2 mL溴酚藍(1 mg/mL)溶液，室溫靜置10 min，然后以4 000 r/min的速度離心15 min，取上清液稀釋2倍，在波長595 nm處測定樣品的吸光度值，空白用磷酸鹽緩沖液替代蛋白液。表面疏水性用溴酚藍可結合的暴露出包埋在蛋白質構象內部的疏水性氨基酸殘基的量來表示，計算公式：

B=200 ×(A0-A1)/A0

(1)

式中：B—溴酚藍結合量，μg；200—溴酚藍溶液中所含溴酚藍的質量，μg；A1—空白組吸光度；A0—樣品組吸光度。

1.2.7 肌原纖維蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的方法參考Fritz等[13]略做修改。將質量濃度約1.00 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液與上樣緩沖液(2X)等體積混勻，煮沸5 min，12 000 r/min離心5 min，收集上清液作為待測樣品。采用5%濃縮膠、12%分離膠，上樣量為15 μL。濃縮膠電壓80 V，電泳時間約15 min，分離膠電壓120 V，電泳時間1.5～2 h，電泳完畢后進行染色2～4 h，搖床脫色4 h，最后用凝膠成像系統(tǒng)掃凝膠圖譜并分析條帶。

1.2.8 海鱸魚肉片感官評測

參考魏涯等[14]的方法，對不同中心溫度的海鱸魚片進行感官評定。選擇5男5女共10名有感官評分經驗的人從氣味、色澤、質地、多汁性和嫩度5個方面進行感官評定，每個指標感官評分以10分計，評價標準見表1。

表1 感官評分標準

2 結果與分析

2.1 加熱溫度對海鱸魚肉色澤的影響

魚肉的顏色是評價魚肉品質的重要指標之一。L*值、a*值、b*值將色澤量化，避免感官評價人為因素的干擾，得到更加清晰可靠的數(shù)據。魚肉顏色(圖1)隨著魚塊中心溫度的升高，L*值、a*值、b*值總體呈現(xiàn)增加的趨勢。姜啟興等[15]也得到相似的結論。當中心溫度達到60 ℃時，a*值和b*值增大的趨勢明顯加快，而L*值的增大趨勢減慢。這可能是由于中心溫度在60 ℃以下時，隨著溫度的升高，肌球蛋白逐漸變性，所以魚肉的顏色逐漸變白；但當溫度達到 60 ℃后，基本上所有的肌球蛋白已完全變性，溫度到 70 ℃以上時主要是肌動蛋白發(fā)生變性。由于在魚肉中肌動蛋白含量比起肌球蛋白含量相對較少，因此，當溫度超過 60 ℃以后，色澤的變化就非常緩慢，導致L*值增加的速度由快到慢。另外，加熱會降低肌紅蛋白的穩(wěn)定性，70 ℃以上時亞鐵肌紅蛋白氧化成高鐵肌紅蛋白導致a*值明顯增加。L*值越大，a*值越小，魚肉顏色越明亮，色澤越佳，結合b*值，當中心溫度達到70 ℃時，魚肉色澤較理想。

2.2 加熱溫度對海鱸魚肌肉質構的影響

隨著溫度的升高，魚肉的硬度、內聚性和咀嚼性的變化趨勢基本一致，魚肉彈性呈現(xiàn)下降趨勢，質構整體發(fā)生了顯著變化(圖2)。

圖1 不同加熱溫度對海鱸魚肉色差的影響

圖2 不同加熱溫度對海鱸魚肉質構特性的影響

硬度表現(xiàn)為人體的觸覺柔軟或堅硬，使食品達到一定變形所需要的力或食品保持形狀的內部結合力[16]。硬度在40 ℃～70 ℃迅速上升，70 ℃～90 ℃增大趨于緩慢，可能是因為魚肉纖維受熱收縮，有大量汁液流出，導致魚肉變硬[17-18]，這與水分含量趨勢一致(圖4)。90 ℃～100 ℃時魚肉的硬度略有下降，是因為高溫破壞肌纖維的結構，促使肌纖維束變松散，從而導致魚肉硬度的降低。

咀嚼性作為一項綜合的質構評價參數(shù)是魚肉硬度、凝聚力和彈性的集中體現(xiàn)。在70 ℃以下時，隨著溫度的升高，咀嚼性逐漸增加，可能是肌原纖維蛋白的變性、肌間膠原蛋白的收縮以及肌動球蛋白的脫水收縮綜合作用的結果。而在70 ℃以上時其值降低可能是由于膠原蛋白在70 ℃左右開始形成凝膠，咀嚼性下降。由此可見，熱加工對海鱸魚肉的咀嚼性具有雙面效應。

內聚性表示魚肉凝聚程度或保持其完整性的能力[19]。當中心溫度從40 ℃升高到70 ℃，內聚性不斷提高，魚肉口感更加細膩[20]，70 ℃達到最佳。但在70 ℃～80 ℃，內聚性呈下降趨勢，80 ℃～100 ℃下降趨勢減弱，說明一旦中心溫度超過 70 ℃，繼續(xù)加熱會使魚肉的內聚性降低，使魚肉蛋白變性成為凝膠，肉質變得松散和粗糙。

彈性是變形樣品在去除變形力后恢復到變形前條件下的高度或體積比率。隨著中心溫度的升高，彈性一直呈下降趨勢。初期肌球蛋白變性導致彈性下降較快，可能是由于肌球蛋白變性引起的肌肉橫向收縮所致[21]。60 ℃以上時肌球蛋白完全變性，肌動蛋白開始變性，因肌動蛋白含量較少致使彈性下降緩慢，此外，結締組織也會發(fā)生收縮，彈性未發(fā)生明顯變化。彈性在90 ℃～100 ℃時再次下降，是因為高溫蒸煮(100 ℃)引起的嚴重蛋白質變性和肌肉結構收縮所致。

綜上，70 ℃處理時魚肉具有較低的硬度，較高的咀嚼性、內聚性和彈性。

2.3 加熱溫度對海鱸魚肉失重率的影響

加熱影響了魚肉的組織結構，從而導致蛋白溶出和水分流失，表現(xiàn)為魚肉失重率的增加[22-23]。為了保證試驗過程魚肉受熱均勻，采用在蒸煮袋內隔水加熱的條件下進行，這樣魚肉組織傳熱速度快且受熱均勻。由圖3可見，魚肉失重率隨加熱溫度的升高而增加，當中心溫度低于60 ℃時，失重率在10%以下。在溫度較低條件下，組織表層蛋白變性較慢，肌原纖維開始受熱收縮，但是肌束膜和肌內膜未收縮，所以魚肉組織內自由水和水溶性蛋白不會大量流失。當中心溫度大于60 ℃時，失重率顯著增加，中心溫度為100 ℃時失重率最高為23.27%。在60 ℃～100 ℃的溫度范圍內，肌束膜的膠原蛋白變性導致肌束膜強烈收縮、孔隙增大，造成失重率升高的不僅僅是自由水的流失，還包括吸附水和部分結合水以及從肌纖維細胞中溶出的少量肌漿蛋白、脂肪和熱溶性膠原蛋白形成的“明膠”溶出物[24]。

圖3 不同加熱溫度對海鱸魚肉失重率的影響

2.4 加熱溫度對海鱸魚肉水分含量的影響

魚肉加熱后的水分含量是表示肌肉持水力的重要指標[25]。海鱸魚加熱過程中溫度對水分含量的影響見圖4。

圖4 不同加熱溫度對海鱸魚肉水分含量的影響

水分含量與中心溫度呈負相關。當中心溫度由40 ℃升高至100 ℃，水分含量由 76.89%降至 73.71%，失水率為3.18%。熱處理促使肌肉收縮，也降低了魚肉蛋白的保水性，從而導致水分含量持續(xù)下降[26]。中心溫度為80 ℃～90 ℃，失水率的下降趨勢較平緩，這可能是因為魚肉中膠原蛋白在此溫度下受熱變性轉變成可溶于水的明膠，而此時膠原蛋白并未完全溶出，導致明膠吸水，從而彌補了水分的部分流失[27]。

2.5 加熱溫度對海鱸魚肉肌原纖維蛋白質量濃度的影響

蛋白質是肌肉組織的主要組成成分，具有重要的結構支撐作用，在各種生理功能方面還充當著重要角色，而蛋白質的降解和變性對魚肉的風味、口感等產生重要的影響[28]。肌原纖維蛋白占肌肉總蛋白的60%～70%，是魚肉肌肉組織的主要結構蛋白，與肉制品的加工特性和持水特性密切相關。因此，研究加熱過程中肌原纖維蛋白質量濃度的變化是至關重要的。不同質量濃度的蛋白質標準品的吸光度所得到的標準曲線為Y=0.556 9x+0.554 4(R2=0.994 1)，加熱溫度對于肌原纖維蛋白質量濃度的影響如圖5所示。隨著中心溫度的上升，肌原纖維蛋白質量濃度不斷減少，當中心溫度從40 ℃上升至100 ℃時，肌原纖維蛋白的質量濃度從1.14 mg/mL降至0.38 mg/mL，僅為40 ℃時的30%左右，可見加熱溫度對于肌原纖維蛋白質量濃度影響顯著。

圖5 不同加熱溫度對海鱸魚肉肌原纖維蛋白質量濃度的影響

2.6 加熱溫度對海鱸魚肉總巰基含量的影響

總巰基包括活性巰基和隱藏的巰基，是魚肉蛋白中反應活性最強的功能性基團之一，對溫度敏感，易發(fā)生氧化，或與二硫鍵交換而引起其含量下降[29-30]。蛋白質結構的穩(wěn)定性和易變性大都與巰基和二硫鍵密切相關，因此可以通過測定總巰基含量的變化來反映蛋白質在加熱過程中的變性和氧化程度。隨著溫度升高，總巰基含量下降，下降的原因是加熱破壞了肌原纖維蛋白的空間結構，使巰基暴露被氧化成二硫鍵，導致蛋白的完全變性和聚集(圖6)。此外，蛋白質聚合體也會對部分巰基起到掩蓋作用。

圖6 不同加熱溫度對海鱸魚肉總巰基含量的影響

2.7 Ca2+-ATP酶活性的變化

Ca2+-ATPase酶活性是評估蛋白質品質的重要指標，與蛋白質的凝膠特性有關。在水浴加熱過程中，溫度必然影響酶活性，海鱸魚的肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase酶活性隨著溫度的升高不斷降低(圖7)。

圖7 不同加熱溫度肌原纖維蛋白 Ca2+-ATPase酶活性的變化

Ca2+-ATPase酶活性源于肌球蛋白的球狀頭部結構，加熱使肌原纖維蛋白發(fā)生了構象上的變化，肌球蛋白的頭部結構也發(fā)生改變，蛋白質發(fā)生聚集和變性，從而導致酶活性急劇下降[27]。當中心溫度在40 ℃～50 ℃時，迅速失活，可能是疏水性氨基酸和巰基相互作用的結果。溫度達到60 ℃以上時，酶活力基本保持不變，酶的活性也幾乎檢測不到。

2.8 加熱溫度對海鱸魚肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

疏水鍵是疏水側鏈為了避開水相而聚集在一起的一種相互作用，疏水作用對蛋白質三級結構的穩(wěn)定性[23]和蛋白質功能特性具有重要意義?？梢杂娩宸铀{與蛋白質的結合量來表征熱處理對肌原纖維蛋白疏水性的影響(圖8)。隨著溫度的升高，溴酚藍的結合量以60 ℃為分界點先上升后下降，說明肌原纖維表面的疏水性也是如此。但表面疏水性仍比加熱初期大，最后趨于穩(wěn)定。產生這種現(xiàn)象的原因主要是加熱使蛋白質側鏈展開，致使位于蛋白質內部的疏水性氨基酸暴露在表面，從而增加了肌原纖維蛋白的疏水性[31-32]。而繼續(xù)加熱時肌球蛋白發(fā)生聚集，掩蓋了一部分疏水基團，減少了疏水性氨基酸殘基與水相的接觸，因而疏水作用呈現(xiàn)出略有下降的趨勢。

圖8 不同溫度對海鱸魚肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

2.9 肌原纖維蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

圖9可知，不同加熱溫度下海鱸魚肌原纖維蛋白的變化，隨著中心溫度的不斷提高，蛋白條帶色澤由深到淺甚至消失，說明蛋白質發(fā)生解聚或降解。分子質量為130～240 kDa的蛋白質條帶明顯變淺，說明肌球蛋白重鏈(MHC)發(fā)生變性。肌動蛋白條帶深度顯著減弱，說明在加熱的過程中肌動蛋白逐漸變性，但當中心溫度達到100 ℃時還有極少部分的肌動蛋白未發(fā)生變性，這與上文分析的肌原纖維蛋白的質量濃度變化趨勢一致。當中心溫度為70 ℃和80 ℃時，分子質量為50～70 kDa，發(fā)生蛋白質聚集現(xiàn)象，形成聚集體[33]。

圖9 不同加熱溫度下海鱸魚肉肌原纖維蛋白的電泳圖

2.10 感官評價分析

由圖10感官評分結果可見，加熱溫度較低時(40 ℃、50 ℃)，魚肉腥味較重、色澤呈透明狀，魚肉未熟；加熱溫度在60 ℃時魚肉只有外層部位熟了，中心部位仍未熟不可食用，魚肉有腥味也有輕微香味，肉色呈青灰白；隨著加熱溫度的升高，腥味變淡且有魚肉蛋白的香味，質地變軟，色澤為熟化后的白色，肉也鮮嫩多汁，魚肉的感官評分值增加，當加熱溫度70 ℃時，魚肉已熟，多汁性和鮮嫩度最佳；80 ℃的顏色僅次于70 ℃，但是多汁性和嫩度略次于70 ℃；90 ℃～100 ℃是魚片氣味最佳的加熱溫度范圍，但是色澤呈白色偏黃。綜合色澤、氣味、嫩度、質地和多汁性，海鱸魚肉加熱溫度達到70 ℃時魚肉的品質最佳。

圖10 不同加熱溫度下海鱸魚片的感官評分

3 結論

研究了不同加熱溫度對海鱸魚肌肉品質的影響，表明加熱溫度對魚肉品質有較大的影響。隨著海鱸魚肉中心溫度的升高，魚肉的水分含量明顯下降，加熱失重率大幅上升，導致魚肉得率下降；加熱使魚肉中肌原纖維蛋白質量濃度、Ca2+-ATPase酶活性和總巰基含量也呈下降趨勢，表面疏水性呈先升高再下降的趨勢，但總體仍是呈上升趨勢，表明魚肉蛋白逐漸變性；另外，通過對比各中心溫度下魚肉的質地特性、色差值和氣味、色澤、質地、多汁性、嫩度5方面的感官評價得分，70 ℃時魚肉的品質最佳，適合作為海鱸魚肉的煮制終點溫度；該研究也為海鱸魚的熱加工產品開發(fā)提供參考。