視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞中谷氨酸受體2的表達(dá)分析

楊 梅，胡秋梅，黃艷明

(1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院眼科，重慶 400037；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院眼科，重慶 400042)

α-氨基-3羧基-5甲基-4異惡唑丙酸受體(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid receptor，AMPAR)是一類離子型谷氨酸受體(Glutamate receptors，GluR)，由谷氨酸受體GluR1、GluR2、GluR3、GluR4 4個(gè)亞單位組成，在細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中形成[1]。其中，GluR2有阻止鈣離子通道開(kāi)放的作用，在基因表達(dá)、RNA編輯、AMPAR的合成和運(yùn)輸方面均起到重要的調(diào)控作用[2-3]。有研究認(rèn)為，如果神經(jīng)元的GluR2表達(dá)下降，其更容易受到谷氨酸神經(jīng)毒性的損傷[3]。因此，GluR2是神經(jīng)保護(hù)的重要調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，已經(jīng)成為了該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。研究顯示，在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell，RGC)、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞、雙極細(xì)胞等神經(jīng)元中均有GluR2的表達(dá)，且其在神經(jīng)元樹(shù)突棘的形成、突觸的形成及神經(jīng)元的存活中均發(fā)揮著重要的病理生理作用[4-6]。除了神經(jīng)元外，視網(wǎng)膜中還有大量的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，包括小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞、Müller細(xì)胞等，對(duì)維持視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和功能也起著重要的作用。其中，Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜中數(shù)量最多的膠質(zhì)細(xì)胞，是連接RGC與微環(huán)境之間的橋梁，對(duì)RGC有重要的營(yíng)養(yǎng)支持和神經(jīng)保護(hù)作用[7-8]。但關(guān)于Müller細(xì)胞中有無(wú)GluR2表達(dá)尚未可知。本研究主要探討GluR2在Müller細(xì)胞中的表達(dá)情況，旨在為視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)功能提供新的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

新生(1～2 d)的SD大鼠由陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：SCXK(PLA)20120031。主要試劑：高糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國(guó))，胎牛血清(BI公司，以色列)，0.25%胰蛋白酶(Gibco公司，美國(guó))，小鼠抗波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體、兔抗GluR2多克隆抗體、小鼠抗GAPDH單克隆抗體(Abcom公司，英國(guó))，DAPI(上海碧云天公司，中國(guó))，熒光二抗(594)標(biāo)記羊抗小鼠IgG(Thermo公司，英國(guó))，RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 Müller細(xì)胞原代培養(yǎng) 參考本課題組前期發(fā)表的文獻(xiàn)進(jìn)行SD新生大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞原代培養(yǎng)[9]。新生大鼠腹腔注射4.3%的水合氯醛麻醉后，斷頭處死，無(wú)菌操作取出眼球后浸泡在高糖DMEM+1%雙抗的培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)過(guò)夜。0.25%胰蛋白酶液消化1 h，加入含10%胎牛血清的DMEM終止消化，在高倍顯微鏡下分離視網(wǎng)膜，加入DMEM完全培養(yǎng)基(含1%雙抗、10%胎牛血清)，反復(fù)吹打，制成細(xì)胞懸液，用70 μm濾網(wǎng)過(guò)濾，調(diào)整細(xì)胞密度按3×105/mL接種于培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，第2天換液，繼續(xù)培養(yǎng)6～8 d，細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)予以傳代，細(xì)胞傳至3～4代可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 免疫熒光染色Vimentin鑒定Müller細(xì)胞純度[9-10]4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，PBS緩沖液洗3次，每次5 min；0.1%Triton打孔15 min，PBS緩沖液洗3次，每次5 min；10%山羊血清封閉30 min。加入一抗(小鼠抗Vimentin單克隆抗體、兔抗GluR2多克隆抗體)，4 ℃過(guò)夜，PBS緩沖液洗3次，每次5 min；加入熒光二抗(1∶300)，室溫避光孵育1 h，PBS緩沖液洗3次，每次5 min，DAPI染色15 min。Vimentin是Müller細(xì)胞的特異性蛋白，Vimentin陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞即為Müller細(xì)胞，Müller細(xì)胞純度=Vimentin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/DAPI總數(shù)×100%。

1.2.3 Real-Time PCR檢測(cè)GluR2 mRNA表達(dá) 參照文獻(xiàn)[11]提取RNA，按Takara試劑盒(RR047A，日本)說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。依次加入無(wú)核酸酶、高純水2 μL，Mix 5 μL，oligol(dT)18引物，上下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，GAPDH作為內(nèi)參。GluR2上游引物序列：AATCTCCTCCTACACGGCTAACTT，下游引物序列：GACTCTGGCTACTCCTTCTGC；GAPDH上游引物序列：GACATCAAGAAGGTGGTGAAGC，下游引物序列：TGTCATTGAGAGGACCTGCCAGC，所有引物購(gòu)于重慶擎科生物技術(shù)有限公司。qPCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃、10 min，變性95 ℃、15 s，循環(huán)39次，退火57 ℃、1 min，延伸65 ℃、5 min，Bio-RAD CFX Maestro軟件(美國(guó))對(duì)Real-Time PCR結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量。

1.2.4 Western blot檢測(cè)GluR2蛋白表達(dá) 文獻(xiàn)報(bào)道大鼠的腦皮質(zhì)有GluR2 mRNA和蛋白表達(dá)[12-13]，因此本研究將其作為陽(yáng)性對(duì)照組，傳代培養(yǎng)到第3代的Müller細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組。具體方法參考文獻(xiàn)[14]，配制8% SDS-PAGE膠，以40 μg/μL的蛋白濃度上樣電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入一抗(兔抗GluR2多克隆抗體1∶5 000，小鼠抗GAPDH單克隆抗體1∶5 000)，4 ℃搖床孵育過(guò)夜。分別加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，ECL顯色，Omega Lum G凝膠成像儀曝光，GAPDH作為內(nèi)參，分別用Image J軟件測(cè)量GluR2條帶和GAPDH條帶的灰度值，GluR2蛋白表達(dá)OD值=GluR2條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 傳代培養(yǎng)的Müller細(xì)胞中GluR2免疫熒光表達(dá)

Müller細(xì)胞免疫熒光純度鑒定結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的Müller細(xì)胞傳至3代后，95%以上的細(xì)胞可表達(dá)Müller細(xì)胞的特異性蛋白Vimentin，細(xì)胞純度>95%，見(jiàn)圖1a。Müller細(xì)胞免疫熒光雙染色結(jié)果顯示，同一細(xì)胞中有Vimentin和GluR2 2種熒光陽(yáng)性表達(dá)，GluR2的熒光主要表達(dá)在細(xì)胞膜及胞漿中(圖1b)。

a:Müller細(xì)胞純度鑒定；b：Müller細(xì)胞的Vimentin和GluR2共染色 綠色：Vimentin；紅色：GluR2；DAPI：核(藍(lán)色)圖1 Müller細(xì)胞免疫熒光染色

2.2 Müller細(xì)胞中GluR2 mRNA和蛋白表達(dá)

Real-Time PCR結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照組GluR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量為(100±17.34)%，實(shí)驗(yàn)組為(86.47±19.23)%，2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2a。Western blot結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照組GluR2蛋白相對(duì)表達(dá)量為(100±14.28)%，實(shí)驗(yàn)組為(82.82±11.34)%，2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2b、c。

a:GluR2 mRNA表達(dá)；b和c：GluR2蛋白表達(dá)圖2 Müller細(xì)胞中GluR2 mRNA和蛋白表達(dá)水平

3 討論

視網(wǎng)膜中主要有3種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，即小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞和Müller細(xì)胞，其中，Müller細(xì)胞數(shù)量最多，也是視網(wǎng)膜中特有的，具有重要的病理、生理作用的細(xì)胞，一直是視網(wǎng)膜、視神經(jīng)等疾病研究的熱點(diǎn)。Müller細(xì)胞橫跨整個(gè)視網(wǎng)膜組織，維持著視網(wǎng)膜的基本結(jié)構(gòu)，是視網(wǎng)膜整個(gè)內(nèi)環(huán)境的重要組成部分，可以調(diào)控細(xì)胞外谷氨酸的濃度及pH，維持RGC所處視網(wǎng)膜的整個(gè)微環(huán)境平衡[15]。Müller細(xì)胞分泌的神經(jīng)生長(zhǎng)因子，如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子等，對(duì)視網(wǎng)膜中的神經(jīng)元具有重要的神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)再生作用[16]。而Müller細(xì)胞的過(guò)度膠質(zhì)激活又會(huì)形成膠質(zhì)瘢痕，從而進(jìn)一步損傷與之密切接觸的視網(wǎng)膜神經(jīng)元，造成RGC等細(xì)胞的死亡、軸突再生困難等。

GluR1、GluR2、GluR3、GluR4的跨膜區(qū)和胞外結(jié)構(gòu)非常相似，但是胞質(zhì)側(cè)的C端卻不完全相同，由于C端可以和不同的蛋白相互作用，因此這4種亞單位所發(fā)揮的作用也不同[17]。有研究表明，GluR2具有較低的鈣離子通透性，而GluR1、GluR3、GluR4則具有較高的鈣離子通透性[18]。而在一些視網(wǎng)膜疾病中，這 4種亞單位表達(dá)也有差異。有研究在糖尿病視網(wǎng)膜病變動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)外叢狀層GluR2的表達(dá)增加，而GluR1的表達(dá)沒(méi)有明顯變化[19]。以上結(jié)果說(shuō)明，GluR2在某些視網(wǎng)膜疾病中是一個(gè)特殊的病理角色，進(jìn)一步研究其病理機(jī)制具有重要的意義。

本研究首次發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)的視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞有GluR2的表達(dá)，雖然其表達(dá)水平較腦皮質(zhì)組織水平稍低，但鑒于Müller細(xì)胞在視網(wǎng)膜中的重要地位，我們推測(cè)，Müller細(xì)胞的GluR2可能也具有十分重要的病理、生理作用，但需要進(jìn)一步從分子機(jī)制、信號(hào)通路、物質(zhì)交換等多層面研究探討。