• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    一株降解頁巖氣采出水耐鹽菌的分離鑒定與特性

    2020-12-23 06:30:46張永紅宋興福于建國
    關鍵詞:生長質(zhì)量

    金 艷, 張永紅, 宋興福, 連 偉, 何 化, 于建國

    (1. 華東理工大學資源與環(huán)境工程學院,國家環(huán)境保護化工過程環(huán)境風險評價與控制重點實驗室,上海 200237;2. 中國石油工程建設有限公司西南分公司,成都 610041)

    一般將含有大量有機物同時總?cè)芙夤腆w(TDS)在10~150 g/L 的廢水稱為高鹽有機物廢水[1],如農(nóng)藥、制藥、制革、石油、石化和紡織等行業(yè)排放的一些生產(chǎn)廢水,均具有此特征[2-4]。廢水中的高鹽度不僅會抑制微生物的代謝功能,還會影響處理效果,因此很多研究人員通過分離和富集得到耐鹽菌去處理各種含鹽廢水[5-8]。頁巖氣采出水也屬于難處理的高鹽有機廢水,其主要來源于頁巖氣壓裂過程中的大量返排液[9],其中不僅含有原壓裂液的化學物質(zhì),而且由于長時間接觸地層巖石而混入大量懸浮物、油脂、天然放射性物質(zhì)、重金屬、酚類、酮類等多種污染物[10-12]。由于頁巖氣采出水中各種污染物成分復雜,且含鹽量高,如不進行合理的無害化處理,會對周圍環(huán)境造成很大危害。生化法較之物理法和化學法有著經(jīng)濟、高效的優(yōu)點[13],如果能篩選出降解頁巖氣采出水的高效耐鹽菌,對經(jīng)濟有效地處理頁巖氣采出水具有重要作用。

    嗜鹽微生物是一類新型的且應用前景廣闊的微生物資源,其結(jié)構組成、生理特性和代謝途徑極為特殊,一般情況下高鹽濃度會引起質(zhì)壁分離和細胞活性喪失,但嗜鹽細菌在高鹽環(huán)境下卻能正常生存生長,一些極端耐鹽菌甚至在非高鹽條件下無法存活[14-15]。耐鹽微生物的投加能夠改善鹽度對微生物活性的抑制作用,大幅提高有機物的降解效果,在高鹽廢水處理工藝中具有巨大的應用潛力[16-17]。本文篩選、分離出一株對頁巖氣采出水具有一定降解能力的耐鹽菌,并對此菌株進行一系列的生理生化鑒定及生長特性研究。

    1 材料及方法

    1.1 實驗材料

    1.1.1 培養(yǎng)基 七水硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O):分析純,上海凌峰化學試劑有限公司;磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、氯化銨(NH4Cl)、氯化鈉 (NaCl)、六水氯化鎂 (MgCl2·6H2O)、氯化鉀 (KCl),均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;無水葡萄糖(Anhydrous glucose):分析純,上海天蓮化工科技有限公司;酵母膏(Yeast):分析純,北京奧博星生物技術有限責任公司;瓊脂(Agar):分析純,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。1.1.2 實驗儀器 采用掃描電子顯微鏡SEM(ZEISS EVO18,德國卡爾蔡司光學有限公司)對菌株形貌進行分析。采用總有機碳TOC 分析儀(elementar vario TOC,德國elementar 公司)分析處理前后廢水中有機物濃度。分光光度計(MAPADA UV-6100s,中國美譜達儀器有限公司)。采用恒溫振蕩培養(yǎng)箱、無菌操作臺、高壓滅菌鍋、離心機等進行菌的分離與純化。

    1.2 實驗方法及分析方法

    1.2.1 培養(yǎng)基配制 耐鹽培養(yǎng)基:FeSO4·7H2O 0.05 g/L;NaH2PO40.45 g/L; NH4Cl 0.3 g/L; NaCl 40 g/L;MgCl2·6H2O 0.5 g/L;KCl 0.3 g/L;無水葡萄糖 1 g/L;酵母膏 0.2 g/L;其余為去離子水,pH 6.5~7.0。

    固 體 培 養(yǎng) 基 : FeSO4·7H2O 0.05 g/L; NaH2PO40.45 g/L; NH4Cl 0.3 g/L; NaCl 40 g/L; MgCl2·6H2O 0.5 g/L;KCl 0.3 g/L;無水葡萄糖 1 g/L;酵母膏 0.2 g/L;瓊脂20 g/L;其余為去離子水,pH 6.5~7.0。

    廢水培養(yǎng)基:廢水中添加氮、磷,氮源是尿素,磷源為K2HPO4,投加量為m(C)∶m(N)∶m(P)=100∶5∶1。

    1.2.2 耐鹽菌篩選與分離

    (1)耐鹽菌群初篩

    初篩菌株主要來源于污泥樣品和廢水樣品,污泥樣品包括海泥、氣田采出水排放口污泥和堿減量高鹽廢水池底泥等,廢水樣品包括頁巖氣返排液、氣田水、煤化工高鹽廢水、精細化工高鹽廢水等。

    分別取10 g 污泥樣品或10 mL 高鹽廢水樣品于含有100 mL耐鹽菌培養(yǎng)基的滅菌三角瓶中,30 ℃下振蕩進行富集培養(yǎng),5~7 d 后再取10 mL 加入100 mL耐鹽菌培養(yǎng)基中繼續(xù)富集培養(yǎng),反復4~5 個周期后,獲得耐鹽菌群。

    (2)耐鹽菌純化分離

    制作固體平板培養(yǎng)基,用接種環(huán)采用涂布劃線接種法將富集液接種至已滅菌的平板培養(yǎng)基中,置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~4 d,當培養(yǎng)基中長出菌落后,挑取不同菌落分別進行單菌落的反復劃線及培養(yǎng),直到形成單一菌落。

    (3)高效降解耐鹽菌篩選

    將分離出來的純菌液,定量投加至待降解廢水中,然后置于30 ℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中,180 r/min振蕩,培養(yǎng)24 h 后進行離心處理,然后取上清液測定化學需氧量(COD)。

    1.2.3 耐鹽菌形態(tài)觀察 采用電鏡對篩選出的菌株進行形態(tài)觀察。將菌液先進行預處理,然后進行噴金處理,再進行電鏡掃描。

    電鏡前預處理方法:取篩選出的培養(yǎng)菌液1 mL置于1.5 mL 的離心管中,以10 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心3 min,棄上清液,加 900 μL 雙蒸水(ddH2O)和 100 μL 甲醛,充分打散,靜置25 min,以10 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心3 min,棄上清液,再依次用體積分數(shù)為30%、50%、70%、100%乙醇進行充分打散和離心去除上清液。

    1.2.4 耐鹽菌生長特性研究 取培養(yǎng)24 h 后的處于穩(wěn)定期的菌液,定量接種于高溫滅菌后的不同NaCl 鹽濃度嗜鹽培養(yǎng)基中,然后置于30 ℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中,180 r/min 振蕩,培養(yǎng)一定時間后,取樣,用分光光度計于600 nm 波長處測光密度值,即OD600。OD600是溶液在600 nm 波長處的吸光度值,利用細菌的吸光度來測量細菌培養(yǎng)液的濃度,從而估計細菌的生長情況,細菌生長比較好的時期一般是在 OD600為 1 時。

    1.2.5 耐鹽菌總有機碳(TOC)降解研究 取培養(yǎng)24 h后的處于穩(wěn)定期的菌液,分別定量接種于待降解的廢水中,然后置于30 ℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中,180 r/min振蕩,培養(yǎng)24 h 后測量其TOC。

    TOC 測試預處理:取樣品于12 000 r/min 轉(zhuǎn)速下超速離心5 min 后加入TOC 測量管中。用10 mL去離子水加入TOC 測量管中作為清洗液。選用總有機碳-總碳(TIC-TC)模式進行自動測量和分析。

    1.2.6 分析方法 TOC 含量采用TOC 測定儀;氨氮含量采用納氏試劑分光光度法;溶解固體總量(TDS)含量采用重量法;氯離子濃度采用滴定法。

    1.3 廢水水質(zhì)

    頁巖氣采出水取自四川省宜賓市H24#礦區(qū),其水質(zhì)分析如表1 所示。本廢水特點為有機物含量高,鹽含量高,屬于NaCl 體系。

    表 1 廢水水質(zhì)分析Table 1 Analysis of wastewater

    2 結(jié)果與討論

    2.1 優(yōu)勢單菌的分離與篩選

    采集氣田采出水、頁巖氣返排液、煤化工高鹽廢水、精細化工中高鹽廢水等高鹽廢水水樣和周邊土樣若干,通過富集、篩選、純化,分離出47 株可在質(zhì)量分數(shù)為8%NaCl 體系中生長良好的耐鹽菌。將這些菌株分別投加到頁巖氣壓裂返排液中,進行降解實驗,其結(jié)果如圖1 所示。

    圖 1 不同耐鹽菌的TOC 去除率Fig. 1 TOC removal rate of different salt-tolerant bacteria

    由圖1 可知,菌株編號為CF3P、206BP、206BW、206B-H-W、206F-H-G、202B-H-W、CNM 和 CFP 菌株的TOC 去除率均能達到50%以上,其中206BP 的降解效果最好,因此選取206BP 菌株作為降解頁巖氣采出水的優(yōu)勢菌株,并對其生理化學特性進行分析。

    2.2 菌株鑒定

    2.2.1 菌落形態(tài) 將編號為206BP 的菌株接種至選擇性固體培養(yǎng)基平板上,觀察菌落形態(tài),如圖2 所示。在平板上培養(yǎng)3 d 后,206BP 菌株的單菌落形狀呈圓形,菌落光滑,顏色為不透明淡粉色,直徑約為2~3 mm。接種后的液體培養(yǎng)基在搖床中培養(yǎng)1 d 后的菌液呈渾濁淡粉色,延長培養(yǎng)時間顏色無明顯變化。

    2.2.2 菌株形態(tài) 采用SEM 觀察得到的菌株206BP

    形態(tài)如圖3 所示,菌株細胞呈橢圓形,表面有不規(guī)整的凹凸狀,直徑大小約為2.0 μm,產(chǎn)生的芽孢直徑大小約為 0.3~0.6 μm。

    圖 2 菌株206BP 的菌落形態(tài)和液體培養(yǎng)基外觀Fig. 2 Characteristics of 206BP bacterial colony and appearance of liquid medium

    圖 3 菌株206BP 電鏡掃描圖Fig. 3 SEM of strain 206BP

    2.2.3 菌株生化特性 實驗中對菌株206BP 進行生理生化實驗,結(jié)果見表2。

    表 2 菌株206BP 生理特征Table 2 Physiological properties of strain 206BP

    實驗結(jié)果表明,該菌株為革蘭氏染色陽性菌,可產(chǎn)生分解尿素的尿素酶和硫化氫氣體,能夠水解利用淀粉,不能分解蛋白質(zhì)中的色氨酸生成吲哚,不能液化明膠,可還原硝酸鹽。

    2.2.4 16S rDNA 堿基序列與系統(tǒng)發(fā)育樹 DNA 提取結(jié)果見圖4,實驗中菌株總DNA 的條帶整齊明亮,無降解現(xiàn)象。聚合酶鏈式反應(PCR)后,在1 000 bp 左右處有明顯的產(chǎn)物條帶,條帶整齊明亮。

    圖 4 菌株 206BP 的 (a)DNA 條帶和 (b)PCR 產(chǎn)物條帶Fig. 4 (a) DNA and (b) PCR result of strain 206BP

    PCR 結(jié)果分析:通過 PCR 擴增得到 1 000 bp 左右條帶,序列為:5’—CTCTGTCACCTCATGCG GCTGGCTTCAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGG TGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTG TGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGC ATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTT CATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAAC TGAGAACGGTTTTATGGGATTGGCTAAACCTC GCGGTCTTGCAGCCCTTTGTACCGTCCATTGTA GCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATG ATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTT TGTCACCGGCAGTCATCTTAGAGTGCCCAACT GAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCT CGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACA CGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCAC TCTGTCCCCCGAAGGGGAAAGCCCTATCTCTA GGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGG TTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCT CCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTT GAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGC GGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAA GGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATC GTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATC CTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGTGT CAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACT GGTGTTCCTCCAAATATCTACGCATTTCACCGC TACACTTGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACT CAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGT TGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAA ACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTC CGGACACGCTGCCACCTACGTATTACCGCGGC TGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTT AGGTACCGTCAAGGCGCCGCCCTATTC—3’。對該基因進行局部相似性基本查詢工具(BLAST)中的Blastx 程序分析,發(fā)現(xiàn)GenBank 中該基因與其菌株的16S 氨基酸序列相似性較高。

    選取與之相近的其他21 種菌株通過clustalw2.0建立系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖5。系統(tǒng)發(fā)育分析表明16S rDNA 與Bacillus purgationiresistens 等菌株直系同源物具有最高的相似性,相似性達到99%,該菌屬于芽孢桿菌屬。

    圖 5 菌株 206BP 的 16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 16S rDNA phylogenetic tree of strain 206BP

    2.3 菌株的生長特性

    2.3.1 菌株206BP 的生長曲線 將菌株206BP 擴增繁殖后,按1∶100 的體積比接種于含NaCl 質(zhì)量分數(shù)為4%的培養(yǎng)基中,在30 ℃、180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng),間隔1~4 h 取樣,用分光光度計在波長600 nm 處檢測菌懸液的吸光度,繪制菌株生長曲線,見圖6。

    圖 6 菌株206BP 生長曲線Fig. 6 Growth curve of strain 206BP

    由圖6 可知,在NaCl 質(zhì)量分數(shù)為4%的培養(yǎng)基中,菌株 206BP 在 0~5 h 處于生長延滯期,5~22 h 處于指數(shù)生長期,24 h 之后達到穩(wěn)定期,穩(wěn)定期時間較長。

    2.3.2 鹽度對菌株生長影響 嗜鹽菌根據(jù)其對鹽的依賴程度分為嗜鹽菌及耐鹽菌,而根據(jù)具體耐鹽程度不同又分為輕度耐鹽菌、中度耐鹽菌以及極端耐鹽菌,中度耐鹽菌在NaCl 質(zhì)量分數(shù)為3%~15% 范圍內(nèi)可很好地生長[18],極端耐鹽菌可在NaCl 質(zhì)量分數(shù)為15%~30% 范圍內(nèi)生長[19]。菌株在最佳耐鹽條件下可以生長良好,并且進行正常繁殖,但是在非適宜條件下,就會影響其正常的生長及繁殖。實驗中配制液體培養(yǎng)基NaCl 質(zhì)量分數(shù)分別為0、1%、2%、3%、 4%、 5%、 6%、 8%、 10%、 12%、 14%、 16%、18%、20%,菌株206BP 在不同NaCl 質(zhì)量分數(shù)下的生長曲線見圖7。

    由圖7 可知,在NaCl 質(zhì)量分數(shù)為0~20%條件下,菌株206BP 的生長情況差異明顯,當NaCl 質(zhì)量分數(shù)在 0~1%、5%~20%兩個區(qū)間時,菌株在培養(yǎng)14~16 h 后才進入指數(shù)生長期,當NaCl 質(zhì)量分數(shù)為8%時,直至19 h時進入指數(shù)生長期,值得注意的是,當NaCl 質(zhì)量分數(shù)大于10%時,菌株206BP 的生長始終處于停滯期,生長緩慢甚至幾乎不生長,而當NaCl 質(zhì)量分數(shù)為2%~4%時,菌株206BP 在培養(yǎng)12 h后即進入指數(shù)生長期,這與中度耐鹽菌特性吻合,菌株206BP 屬于中度耐鹽菌。

    圖 7 NaCl 不同質(zhì)量分數(shù)下菌株206BP 的生長曲線Fig. 7 Growth curve of strain 206BP in different w(NaCl)

    2.3.3 碳源及其濃度對菌株生長影響 實驗中選取葡萄糖、草酸、可溶性淀粉、蔗糖、抗壞血酸、木糖、半乳糖、甘露糖和果糖為菌株206BP 的唯一碳源來確定菌株對不同碳源的轉(zhuǎn)化利用情況,結(jié)果見圖8。

    圖 8 碳源對菌株206BP 生長的影響Fig. 8 Effects of carbon sources on growth of strain 206BP

    由圖8 可知,菌株206BP 對草酸的利用效果最差,在以草酸為唯一碳源時,菌株幾乎不生長,在接種培養(yǎng)24 h 后,OD600只有0.028;菌株對抗壞血酸、可溶性淀粉和半乳糖的利用效果也不理想,在接種培養(yǎng) 24 h 后,OD600分別為 0.106、0.198、0.484;以葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖和木糖為唯一碳源時菌株生長良好,接種培養(yǎng) 24 h 后,OD600分別為 1.045、0.965、1.086、1.042 和 0.889,其中果糖的 OD600比葡萄糖的OD600略高,考慮到葡萄糖的成本比果糖低,選擇葡萄糖為206BP 菌株培養(yǎng)基的最佳碳源。

    本文測定了不同葡萄糖質(zhì)量濃度(0、200、500、1 000、2 000、5 000 mg/L)對菌株生長的影響,結(jié)果見圖9。在不同質(zhì)量濃度葡萄糖條件下,生長曲線中穩(wěn)定期的OD600值隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的上升而上升,碳源作為微生物的大量營養(yǎng)物,其質(zhì)量濃度影響了菌株的生長總量。當葡萄糖質(zhì)量濃度為0~2 000 mg/L時,生長曲線的停滯期時間基本相同,當葡萄糖質(zhì)量濃度達到5 000 mg/L 時,停滯期延長,進入指數(shù)期的時間較其他質(zhì)量濃度條件推遲約5 h,表明碳源質(zhì)量濃度過高也會對菌株生長產(chǎn)生一定的抑制作用。

    圖 9 葡萄糖質(zhì)量濃度對菌株206BP 生長的影響Fig. 9 Effects of glucose mass concentration on growth of strain 206BP

    2.3.4 氮源及其濃度對菌株生長的影響 實驗中選擇 NaNO3、NH4Cl、CH3CO2NH4、(NH4)2SO4和尿素為氮源進行最佳氮源實驗,結(jié)果見圖10。

    圖 10 不同氮源對菌株206BP 生長的影響Fig. 10 Effects of nitrogen sources on growth of strain 206BP

    由圖10 可知,菌株206BP 對醋酸銨的利用效果最好,對NaNO3的利用效果最差。在以醋酸銨為氮源時,生長曲線穩(wěn)定期的OD600值明顯更大,表明醋酸銨有助于菌株生長總量的增加,這主要是因為醋酸銨內(nèi)含有一定比例的碳源。由于菌株對尿素、NH4Cl 和(NH4)2SO4利用效率差不多,從經(jīng)濟成本考慮,選擇尿素為最佳氮源,并考察不同氨氮質(zhì)量濃度對菌株生長的影響,實驗結(jié)果見圖11。

    由圖11 可知,不同尿素質(zhì)量濃度對菌株生長曲線的停滯期沒有影響,不同尿素質(zhì)量濃度時停滯期均為5 h 左右,對指數(shù)期的生長速率略有影響,質(zhì)量濃度高時生長速率大,對菌株生長總量也有一定影響,尿素不添加時,穩(wěn)定期OD600低于含氮源條件下的值,菌株接種后培養(yǎng)到32 h 時,尿素質(zhì)量濃度為0、10、50、100、200、300、600、1 200 mg/L 時對應的OD600分 別 為 0.739、 0.843、 0.873、 0.878、 0.861、0.864、0.865 和0.861,結(jié)果表明,當質(zhì)量濃度增加到50 mg/L 時,繼續(xù)增加尿素質(zhì)量濃度對菌株生長已經(jīng)沒有進一步的促進作用,因此選擇尿素最佳質(zhì)量濃度為50 mg/L。

    圖 11 尿素質(zhì)量濃度對菌株206BP 生長的影響Fig. 11 Effects of urea mass concentration on growth of strain 206BP

    2.3.5 初始pH 對菌株生長的影響 pH 是影響微生物生長的主要因素之一,實驗中考察不同pH 值對菌株206BP 的生長影響,結(jié)果見圖12。由圖可見,菌株可生長的pH 值在5~8 之間,當pH 值為5 時,菌體進入指數(shù)期的時間會延后,但是一旦適應后,穩(wěn)定期的OD600值比 pH 值為 7 時還要高 0.1,因此最佳 pH 值為5~7。

    圖 12 pH 值對菌株206BP 生長的影響Fig. 12 Effects of pH value on growth of strain 206BP

    3 結(jié) 論

    (1)以不同高鹽廢水和土壤樣品為菌源,從中分離純化出多株可耐高鹽菌,并篩選出對頁巖氣采出水中有機物具有最佳降解效果的優(yōu)勢菌株,該菌株大小約 2 μm,芽孢約 0.3~0.6 μm,菌株為革蘭氏染色陽性菌,菌株生長過程中產(chǎn)生分解尿素的尿素酶和硫化氫氣體,對淀粉能夠水解利用,不能分解蛋白質(zhì)中色氨酸生成吲哚,不能液化明膠,可還原硝酸鹽和亞硝酸鹽。

    (2)通過16S rDNA 基因分析和構建系統(tǒng)發(fā)育樹可知,菌株206BP 的16S rDNA 與Bacillus purgationir--esistens 等菌株直系同源物具有最高的相似性,屬于芽孢桿菌的一種,但是未找到一致序列,推斷為芽孢桿菌新型菌株。

    (3)不同因素對優(yōu)勢菌株生長影響實驗結(jié)果表明,該菌株在NaCl 質(zhì)量分數(shù)為0~8%下生長良好,屬于中度耐鹽菌;菌株生長的最佳pH 在5~7,最佳碳源為葡萄糖,最佳氮源為尿素。

    猜你喜歡
    生長質(zhì)量
    “質(zhì)量”知識鞏固
    碗蓮生長記
    小讀者(2021年2期)2021-03-29 05:03:48
    質(zhì)量守恒定律考什么
    共享出行不再“野蠻生長”
    生長在哪里的啟示
    華人時刊(2019年13期)2019-11-17 14:59:54
    做夢導致睡眠質(zhì)量差嗎
    野蠻生長
    NBA特刊(2018年21期)2018-11-24 02:48:04
    生長
    文苑(2018年22期)2018-11-19 02:54:14
    關于質(zhì)量的快速Q(mào)&A
    《生長在春天》
    狂野欧美白嫩少妇大欣赏| eeuss影院久久| 午夜久久久久精精品| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲av成人av| 麻豆成人av在线观看| 国产色婷婷99| 国产真实乱freesex| 男女视频在线观看网站免费| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产美女午夜福利| 99热网站在线观看| 少妇高潮的动态图| 成年女人毛片免费观看观看9| 在现免费观看毛片| 免费av毛片视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 免费看光身美女| 国内精品一区二区在线观看| 动漫黄色视频在线观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日韩一本色道免费dvd| 午夜福利欧美成人| 免费av毛片视频| 亚洲av.av天堂| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 日韩高清综合在线| 久9热在线精品视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 简卡轻食公司| 99精品久久久久人妻精品| 很黄的视频免费| 深爱激情五月婷婷| 婷婷精品国产亚洲av| 97热精品久久久久久| 99热网站在线观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| av天堂中文字幕网| 韩国av一区二区三区四区| 一本精品99久久精品77| 可以在线观看的亚洲视频| 日本 欧美在线| 亚洲精品色激情综合| 国产高潮美女av| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 欧美丝袜亚洲另类 | 色吧在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲三级黄色毛片| 久久久久久久久久久丰满 | 日本欧美国产在线视频| 丰满乱子伦码专区| 91麻豆精品激情在线观看国产| 精品人妻偷拍中文字幕| 免费观看在线日韩| 国产成人一区二区在线| 十八禁国产超污无遮挡网站| 免费观看的影片在线观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 深夜精品福利| 欧美bdsm另类| 精品人妻视频免费看| 我的老师免费观看完整版| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 欧美+日韩+精品| 午夜久久久久精精品| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲国产精品成人综合色| 99热只有精品国产| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 免费看光身美女| av专区在线播放| 亚洲av电影不卡..在线观看| 午夜爱爱视频在线播放| 性色avwww在线观看| 岛国在线免费视频观看| 综合色av麻豆| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| avwww免费| 久久欧美精品欧美久久欧美| ponron亚洲| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产精品98久久久久久宅男小说| 免费av观看视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 午夜久久久久精精品| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产日本99.免费观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国国产精品蜜臀av免费| 久久精品人妻少妇| 黄色配什么色好看| 韩国av一区二区三区四区| 日日夜夜操网爽| av在线老鸭窝| 国产精品永久免费网站| 欧美3d第一页| 在线免费观看不下载黄p国产 | 在线国产一区二区在线| 真人做人爱边吃奶动态| 十八禁国产超污无遮挡网站| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产成人a区在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产av麻豆久久久久久久| 免费av观看视频| 国产亚洲精品av在线| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产探花极品一区二区| 内射极品少妇av片p| 欧美最黄视频在线播放免费| 天堂网av新在线| 极品教师在线视频| 欧美高清性xxxxhd video| 性欧美人与动物交配| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 一区二区三区高清视频在线| 日本成人三级电影网站| 国产精品亚洲一级av第二区| 老司机福利观看| 99热这里只有是精品在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 日本免费a在线| 免费电影在线观看免费观看| 国产精品一区二区三区四区久久| 波多野结衣高清作品| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲av美国av| 亚洲av成人av| 久久久久久国产a免费观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 免费看美女性在线毛片视频| 极品教师在线免费播放| 麻豆国产97在线/欧美| 国产精品三级大全| 美女黄网站色视频| 免费高清视频大片| eeuss影院久久| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产91精品成人一区二区三区| 国产精品一及| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲av成人av| a级毛片免费高清观看在线播放| 嫩草影院新地址| 欧美成人a在线观看| 一本一本综合久久| bbb黄色大片| 久久精品国产亚洲网站| aaaaa片日本免费| 亚洲人成网站在线播| 日本一本二区三区精品| 免费人成在线观看视频色| 成人精品一区二区免费| 一个人看视频在线观看www免费| 不卡视频在线观看欧美| 色综合色国产| 国语自产精品视频在线第100页| 国产精品久久久久久久电影| 国产一区二区三区视频了| av在线观看视频网站免费| 无遮挡黄片免费观看| 精华霜和精华液先用哪个| 国产精品久久久久久精品电影| 精品午夜福利在线看| 精品久久国产蜜桃| 亚洲av一区综合| 俄罗斯特黄特色一大片| 91久久精品国产一区二区成人| 嫁个100分男人电影在线观看| 热99re8久久精品国产| 九九爱精品视频在线观看| 免费观看精品视频网站| 国产免费男女视频| 1000部很黄的大片| 久久人人精品亚洲av| 久久99热这里只有精品18| 亚洲熟妇熟女久久| 久久6这里有精品| 最近在线观看免费完整版| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产v大片淫在线免费观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产午夜精品论理片| 全区人妻精品视频| 国产av在哪里看| 草草在线视频免费看| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲精华国产精华精| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲国产色片| 免费看日本二区| 99久久成人亚洲精品观看| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲最大成人中文| 成人毛片a级毛片在线播放| av在线观看视频网站免费| 一进一出好大好爽视频| 最近视频中文字幕2019在线8| 一区二区三区四区激情视频 | 亚洲av免费高清在线观看| 国产人妻一区二区三区在| 99热这里只有是精品在线观看| 校园春色视频在线观看| 在线播放国产精品三级| 精品久久久久久久久久免费视频| 午夜日韩欧美国产| 熟女电影av网| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 欧美日韩综合久久久久久 | 成年女人永久免费观看视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 麻豆成人午夜福利视频| 日本黄色片子视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 日韩国内少妇激情av| 日韩精品青青久久久久久| 国产精品三级大全| 观看美女的网站| 午夜精品在线福利| 国产单亲对白刺激| 久久久精品大字幕| 日韩精品中文字幕看吧| 国产精品久久久久久久电影| 日韩精品青青久久久久久| 91麻豆精品激情在线观看国产| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 日本欧美国产在线视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产成人一区二区在线| 永久网站在线| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 日本欧美国产在线视频| 在线播放国产精品三级| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲成人免费电影在线观看| 久久精品国产自在天天线| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产精华一区二区三区| 欧美中文日本在线观看视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 黄色配什么色好看| 日日啪夜夜撸| 88av欧美| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美色视频一区免费| 亚洲男人的天堂狠狠| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲精品色激情综合| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲五月天丁香| 国产视频内射| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 人妻夜夜爽99麻豆av| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 偷拍熟女少妇极品色| 麻豆国产av国片精品| 国产色爽女视频免费观看| 成年版毛片免费区| 国产av在哪里看| 精品乱码久久久久久99久播| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲国产色片| 日本三级黄在线观看| 国产精品野战在线观看| 国语自产精品视频在线第100页| 日韩人妻高清精品专区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产高清视频在线观看网站| 99国产精品一区二区蜜桃av| 人妻少妇偷人精品九色| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产亚洲精品av在线| 在线观看免费视频日本深夜| 日日啪夜夜撸| 午夜a级毛片| 欧美性猛交黑人性爽| 国产成人福利小说| 啪啪无遮挡十八禁网站| 可以在线观看的亚洲视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 伦理电影大哥的女人| av天堂在线播放| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产一区二区激情短视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 成人av在线播放网站| 高清在线国产一区| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产免费一级a男人的天堂| 天堂动漫精品| 日日干狠狠操夜夜爽| 日韩亚洲欧美综合| 天堂网av新在线| 亚洲电影在线观看av| 日本免费一区二区三区高清不卡| 精品一区二区三区人妻视频| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 成人性生交大片免费视频hd| 中出人妻视频一区二区| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 日韩精品青青久久久久久| 欧美性猛交黑人性爽| 日韩高清综合在线| 国产成人av教育| 亚洲三级黄色毛片| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲真实伦在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 91久久精品国产一区二区成人| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 在线观看舔阴道视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲av免费在线观看| 精品久久久久久久末码| 九九爱精品视频在线观看| av福利片在线观看| 亚洲国产欧美人成| 女人被狂操c到高潮| 91狼人影院| av在线蜜桃| 久久精品国产清高在天天线| 欧美在线一区亚洲| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 两个人视频免费观看高清| 久久久久久久亚洲中文字幕| 免费看日本二区| 亚洲美女搞黄在线观看 | 99久久精品热视频| 精品午夜福利在线看| 久久人人爽人人爽人人片va| 一进一出好大好爽视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚州av有码| 露出奶头的视频| 天美传媒精品一区二区| 欧美成人性av电影在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 国产精品久久视频播放| 禁无遮挡网站| 国产淫片久久久久久久久| 99热6这里只有精品| 国产69精品久久久久777片| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 又爽又黄无遮挡网站| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲成人免费电影在线观看| 99热网站在线观看| 亚洲五月天丁香| 国产久久久一区二区三区| 亚洲欧美日韩东京热| 黄片wwwwww| 精品久久久久久久末码| 直男gayav资源| 又紧又爽又黄一区二区| 国产主播在线观看一区二区| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 校园春色视频在线观看| 亚洲最大成人中文| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美丝袜亚洲另类 | 美女黄网站色视频| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产色婷婷99| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久精品综合一区二区三区| 午夜免费激情av| 观看免费一级毛片| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| www日本黄色视频网| 色播亚洲综合网| 天堂影院成人在线观看| 一区二区三区激情视频| 波多野结衣高清作品| 99精品久久久久人妻精品| 国产av麻豆久久久久久久| 嫩草影视91久久| 色综合站精品国产| 能在线免费观看的黄片| 波多野结衣巨乳人妻| av在线观看视频网站免费| 午夜亚洲福利在线播放| 色视频www国产| 尾随美女入室| av国产免费在线观看| 毛片一级片免费看久久久久 | 国产精品不卡视频一区二区| 国产乱人视频| 天堂√8在线中文| 少妇人妻精品综合一区二区 | 最好的美女福利视频网| 亚洲av一区综合| 亚洲av不卡在线观看| 精品福利观看| 久久久成人免费电影| 国产亚洲av嫩草精品影院| 黄色欧美视频在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲色图av天堂| 有码 亚洲区| 99热6这里只有精品| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 成人国产麻豆网| 亚洲va在线va天堂va国产| 天堂网av新在线| 日日啪夜夜撸| 日韩亚洲欧美综合| 国产精品不卡视频一区二区| av国产免费在线观看| 嫩草影院入口| 精品国内亚洲2022精品成人| ponron亚洲| 精品免费久久久久久久清纯| 99久久成人亚洲精品观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 俄罗斯特黄特色一大片| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 欧美成人性av电影在线观看| 十八禁国产超污无遮挡网站| 久久久久久九九精品二区国产| 99九九线精品视频在线观看视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 嫩草影院新地址| 亚洲第一电影网av| 亚洲成人久久性| 深爱激情五月婷婷| 中出人妻视频一区二区| 国产老妇女一区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 校园春色视频在线观看| 亚洲电影在线观看av| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 日本三级黄在线观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 嫩草影院精品99| 亚洲欧美精品综合久久99| 熟女电影av网| 舔av片在线| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 午夜福利在线在线| 日本 欧美在线| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产高清视频在线播放一区| 最近中文字幕高清免费大全6 | 午夜精品一区二区三区免费看| 国产精品久久久久久久久免| 女同久久另类99精品国产91| a级毛片a级免费在线| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲国产精品成人综合色| 99热精品在线国产| 欧美日韩精品成人综合77777| 成年人黄色毛片网站| 国产精品99久久久久久久久| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产精品久久久久久久久免| 我的老师免费观看完整版| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产伦精品一区二区三区四那| 婷婷六月久久综合丁香| 桃色一区二区三区在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 搡老妇女老女人老熟妇| 日日夜夜操网爽| 亚洲综合色惰| 麻豆av噜噜一区二区三区| 免费在线观看影片大全网站| 丝袜美腿在线中文| 99久久精品一区二区三区| 国产免费av片在线观看野外av| 女人被狂操c到高潮| 亚洲成人久久性| 99国产精品一区二区蜜桃av| 赤兔流量卡办理| 国产精品人妻久久久影院| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 日韩精品青青久久久久久| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲熟妇熟女久久| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 免费在线观看影片大全网站| 国产黄色小视频在线观看| 赤兔流量卡办理| 天堂动漫精品| 高清在线国产一区| 日韩中字成人| 少妇人妻精品综合一区二区 | 高清日韩中文字幕在线| 亚洲精品456在线播放app | 亚洲va在线va天堂va国产| 国产精品国产高清国产av| 深夜精品福利| 中文字幕免费在线视频6| 久久精品人妻少妇| 春色校园在线视频观看| 天天一区二区日本电影三级| 日本a在线网址| 中国美白少妇内射xxxbb| 久久精品影院6| 国产 一区 欧美 日韩| avwww免费| 性欧美人与动物交配| 亚洲 国产 在线| 亚洲四区av| 婷婷精品国产亚洲av| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 男人狂女人下面高潮的视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 无人区码免费观看不卡| 麻豆久久精品国产亚洲av| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲经典国产精华液单| 天美传媒精品一区二区| 国产av麻豆久久久久久久| 国产黄a三级三级三级人| 国产在线男女| 床上黄色一级片| 日日夜夜操网爽| 99在线人妻在线中文字幕| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 婷婷丁香在线五月| 国产精品福利在线免费观看| 在现免费观看毛片| 久久香蕉精品热| 男女视频在线观看网站免费| 黄色配什么色好看| 久久亚洲真实| 日韩中文字幕欧美一区二区| 一边摸一边抽搐一进一小说| 在线观看免费视频日本深夜| 免费搜索国产男女视频| 国产精品亚洲美女久久久| 淫秽高清视频在线观看| 国产av麻豆久久久久久久| 国产男人的电影天堂91| 国产大屁股一区二区在线视频| 精品国产三级普通话版| 中文字幕免费在线视频6| 五月伊人婷婷丁香| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲乱码一区二区免费版| x7x7x7水蜜桃| 国产三级中文精品| 一进一出抽搐动态| 成人av一区二区三区在线看| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久精品91蜜桃| 一本一本综合久久| 不卡一级毛片| 在现免费观看毛片| 日本黄大片高清| 亚洲四区av| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国模一区二区三区四区视频| 免费av不卡在线播放| 色精品久久人妻99蜜桃| 一个人看的www免费观看视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 日韩国内少妇激情av| 91在线精品国自产拍蜜月| 日本熟妇午夜| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产精品国产高清国产av| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 黄色配什么色好看| 岛国在线免费视频观看| 少妇高潮的动态图| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产黄片美女视频| 午夜福利在线观看吧| 精品不卡国产一区二区三区| www.www免费av| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 在现免费观看毛片| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲成人久久爱视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 久99久视频精品免费| 欧美一区二区精品小视频在线| 日韩 亚洲 欧美在线| 神马国产精品三级电影在线观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产 一区精品| 精品日产1卡2卡| 黄色女人牲交| av在线老鸭窝| 国产成人福利小说| 最近最新中文字幕大全电影3|