一株降解頁巖氣采出水耐鹽菌的分離鑒定與特性

金 艷， 張永紅， 宋興福， 連 偉， 何 化， 于建國

（1. 華東理工大學資源與環(huán)境工程學院，國家環(huán)境保護化工過程環(huán)境風險評價與控制重點實驗室，上海 200237；2. 中國石油工程建設有限公司西南分公司，成都 610041）

一般將含有大量有機物同時總?cè)芙夤腆w（TDS）在10～150 g/L 的廢水稱為高鹽有機物廢水[1]，如農(nóng)藥、制藥、制革、石油、石化和紡織等行業(yè)排放的一些生產(chǎn)廢水，均具有此特征[2-4]。廢水中的高鹽度不僅會抑制微生物的代謝功能，還會影響處理效果，因此很多研究人員通過分離和富集得到耐鹽菌去處理各種含鹽廢水[5-8]。頁巖氣采出水也屬于難處理的高鹽有機廢水，其主要來源于頁巖氣壓裂過程中的大量返排液[9]，其中不僅含有原壓裂液的化學物質(zhì)，而且由于長時間接觸地層巖石而混入大量懸浮物、油脂、天然放射性物質(zhì)、重金屬、酚類、酮類等多種污染物[10-12]。由于頁巖氣采出水中各種污染物成分復雜，且含鹽量高，如不進行合理的無害化處理，會對周圍環(huán)境造成很大危害。生化法較之物理法和化學法有著經(jīng)濟、高效的優(yōu)點[13]，如果能篩選出降解頁巖氣采出水的高效耐鹽菌，對經(jīng)濟有效地處理頁巖氣采出水具有重要作用。

嗜鹽微生物是一類新型的且應用前景廣闊的微生物資源，其結(jié)構(gòu)組成、生理特性和代謝途徑極為特殊，一般情況下高鹽濃度會引起質(zhì)壁分離和細胞活性喪失，但嗜鹽細菌在高鹽環(huán)境下卻能正常生存生長，一些極端耐鹽菌甚至在非高鹽條件下無法存活[14-15]。耐鹽微生物的投加能夠改善鹽度對微生物活性的抑制作用，大幅提高有機物的降解效果，在高鹽廢水處理工藝中具有巨大的應用潛力[16-17]。本文篩選、分離出一株對頁巖氣采出水具有一定降解能力的耐鹽菌，并對此菌株進行一系列的生理生化鑒定及生長特性研究。

1 材料及方法

1.1 實驗材料

1.1.1 培養(yǎng)基 七水硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）：分析純，上海凌峰化學試劑有限公司；磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、氯化銨（NH4Cl）、氯化鈉 (NaCl)、六水氯化鎂 (MgCl2·6H2O)、氯化鉀 (KCl)，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；無水葡萄糖（Anhydrous glucose）：分析純，上海天蓮化工科技有限公司；酵母膏（Yeast）：分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；瓊脂（Agar）：分析純，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。1.1.2 實驗儀器 采用掃描電子顯微鏡SEM（ZEISS EVO18，德國卡爾蔡司光學有限公司）對菌株形貌進行分析。采用總有機碳TOC 分析儀（elementar vario TOC，德國elementar 公司）分析處理前后廢水中有機物濃度。分光光度計（MAPADA UV-6100s，中國美譜達儀器有限公司）。采用恒溫振蕩培養(yǎng)箱、無菌操作臺、高壓滅菌鍋、離心機等進行菌的分離與純化。

1.2 實驗方法及分析方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 耐鹽培養(yǎng)基：FeSO4·7H2O 0.05 g/L；NaH2PO40.45 g/L； NH4Cl 0.3 g/L； NaCl 40 g/L；MgCl2·6H2O 0.5 g/L；KCl 0.3 g/L；無水葡萄糖 1 g/L；酵母膏 0.2 g/L；其余為去離子水，pH 6.5～7.0。

固 體 培 養(yǎng) 基 ： FeSO4·7H2O 0.05 g/L； NaH2PO40.45 g/L； NH4Cl 0.3 g/L； NaCl 40 g/L； MgCl2·6H2O 0.5 g/L；KCl 0.3 g/L；無水葡萄糖 1 g/L；酵母膏 0.2 g/L；瓊脂20 g/L；其余為去離子水，pH 6.5～7.0。

廢水培養(yǎng)基：廢水中添加氮、磷，氮源是尿素，磷源為K2HPO4，投加量為m（C）∶m（N）∶m（P）=100∶5∶1。

1.2.2 耐鹽菌篩選與分離

（1）耐鹽菌群初篩

初篩菌株主要來源于污泥樣品和廢水樣品，污泥樣品包括海泥、氣田采出水排放口污泥和堿減量高鹽廢水池底泥等，廢水樣品包括頁巖氣返排液、氣田水、煤化工高鹽廢水、精細化工高鹽廢水等。

分別取10 g 污泥樣品或10 mL 高鹽廢水樣品于含有100 mL耐鹽菌培養(yǎng)基的滅菌三角瓶中，30 ℃下振蕩進行富集培養(yǎng)，5～7 d 后再取10 mL 加入100 mL耐鹽菌培養(yǎng)基中繼續(xù)富集培養(yǎng)，反復4～5 個周期后，獲得耐鹽菌群。

（2）耐鹽菌純化分離

制作固體平板培養(yǎng)基，用接種環(huán)采用涂布劃線接種法將富集液接種至已滅菌的平板培養(yǎng)基中，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，當培養(yǎng)基中長出菌落后，挑取不同菌落分別進行單菌落的反復劃線及培養(yǎng)，直到形成單一菌落。

（3）高效降解耐鹽菌篩選

將分離出來的純菌液，定量投加至待降解廢水中，然后置于30 ℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，180 r/min振蕩，培養(yǎng)24 h 后進行離心處理，然后取上清液測定化學需氧量（COD）。

1.2.3 耐鹽菌形態(tài)觀察 采用電鏡對篩選出的菌株進行形態(tài)觀察。將菌液先進行預處理，然后進行噴金處理，再進行電鏡掃描。

電鏡前預處理方法：取篩選出的培養(yǎng)菌液1 mL置于1.5 mL 的離心管中，以10 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心3 min，棄上清液，加 900 μL 雙蒸水（ddH2O）和 100 μL 甲醛，充分打散，靜置25 min，以10 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心3 min，棄上清液，再依次用體積分數(shù)為30%、50%、70%、100%乙醇進行充分打散和離心去除上清液。

1.2.4 耐鹽菌生長特性研究 取培養(yǎng)24 h 后的處于穩(wěn)定期的菌液，定量接種于高溫滅菌后的不同NaCl 鹽濃度嗜鹽培養(yǎng)基中，然后置于30 ℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，180 r/min 振蕩，培養(yǎng)一定時間后，取樣，用分光光度計于600 nm 波長處測光密度值，即OD600。OD600是溶液在600 nm 波長處的吸光度值，利用細菌的吸光度來測量細菌培養(yǎng)液的濃度，從而估計細菌的生長情況，細菌生長比較好的時期一般是在 OD600為 1 時。

1.2.5 耐鹽菌總有機碳（TOC）降解研究 取培養(yǎng)24 h后的處于穩(wěn)定期的菌液，分別定量接種于待降解的廢水中，然后置于30 ℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，180 r/min振蕩，培養(yǎng)24 h 后測量其TOC。

TOC 測試預處理：取樣品于12 000 r/min 轉(zhuǎn)速下超速離心5 min 后加入TOC 測量管中。用10 mL去離子水加入TOC 測量管中作為清洗液。選用總有機碳-總碳（TIC-TC）模式進行自動測量和分析。

1.2.6 分析方法 TOC 含量采用TOC 測定儀；氨氮含量采用納氏試劑分光光度法；溶解固體總量（TDS）含量采用重量法；氯離子濃度采用滴定法。

1.3 廢水水質(zhì)

頁巖氣采出水取自四川省宜賓市H24#礦區(qū)，其水質(zhì)分析如表1 所示。本廢水特點為有機物含量高，鹽含量高，屬于NaCl 體系。

表 1 廢水水質(zhì)分析Table 1 Analysis of wastewater

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)勢單菌的分離與篩選

采集氣田采出水、頁巖氣返排液、煤化工高鹽廢水、精細化工中高鹽廢水等高鹽廢水水樣和周邊土樣若干，通過富集、篩選、純化，分離出47 株可在質(zhì)量分數(shù)為8%NaCl 體系中生長良好的耐鹽菌。將這些菌株分別投加到頁巖氣壓裂返排液中，進行降解實驗，其結(jié)果如圖1 所示。

圖 1 不同耐鹽菌的TOC 去除率Fig. 1 TOC removal rate of different salt-tolerant bacteria

由圖1 可知，菌株編號為CF3P、206BP、206BW、206B-H-W、206F-H-G、202B-H-W、CNM 和 CFP 菌株的TOC 去除率均能達到50%以上，其中206BP 的降解效果最好，因此選取206BP 菌株作為降解頁巖氣采出水的優(yōu)勢菌株，并對其生理化學特性進行分析。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌落形態(tài) 將編號為206BP 的菌株接種至選擇性固體培養(yǎng)基平板上，觀察菌落形態(tài)，如圖2 所示。在平板上培養(yǎng)3 d 后，206BP 菌株的單菌落形狀呈圓形，菌落光滑，顏色為不透明淡粉色，直徑約為2～3 mm。接種后的液體培養(yǎng)基在搖床中培養(yǎng)1 d 后的菌液呈渾濁淡粉色，延長培養(yǎng)時間顏色無明顯變化。

2.2.2 菌株形態(tài) 采用SEM 觀察得到的菌株206BP

形態(tài)如圖3 所示，菌株細胞呈橢圓形，表面有不規(guī)整的凹凸狀，直徑大小約為2.0 μm，產(chǎn)生的芽孢直徑大小約為 0.3～0.6 μm。

圖 2 菌株206BP 的菌落形態(tài)和液體培養(yǎng)基外觀Fig. 2 Characteristics of 206BP bacterial colony and appearance of liquid medium

圖 3 菌株206BP 電鏡掃描圖Fig. 3 SEM of strain 206BP

2.2.3 菌株生化特性 實驗中對菌株206BP 進行生理生化實驗，結(jié)果見表2。

表 2 菌株206BP 生理特征Table 2 Physiological properties of strain 206BP

實驗結(jié)果表明，該菌株為革蘭氏染色陽性菌，可產(chǎn)生分解尿素的尿素酶和硫化氫氣體，能夠水解利用淀粉，不能分解蛋白質(zhì)中的色氨酸生成吲哚，不能液化明膠，可還原硝酸鹽。

2.2.4 16S rDNA 堿基序列與系統(tǒng)發(fā)育樹 DNA 提取結(jié)果見圖4，實驗中菌株總DNA 的條帶整齊明亮，無降解現(xiàn)象。聚合酶鏈式反應（PCR）后，在1 000 bp 左右處有明顯的產(chǎn)物條帶，條帶整齊明亮。

圖 4 菌株 206BP 的 (a)DNA 條帶和 (b)PCR 產(chǎn)物條帶Fig. 4 (a) DNA and (b) PCR result of strain 206BP

PCR 結(jié)果分析：通過 PCR 擴增得到 1 000 bp 左右條帶，序列為：5’—CTCTGTCACCTCATGCG GCTGGCTTCAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGG TGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTG TGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGC ATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTT CATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAAC TGAGAACGGTTTTATGGGATTGGCTAAACCTC GCGGTCTTGCAGCCCTTTGTACCGTCCATTGTA GCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATG ATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTT TGTCACCGGCAGTCATCTTAGAGTGCCCAACT GAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCT CGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACA CGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCAC TCTGTCCCCCGAAGGGGAAAGCCCTATCTCTA GGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGG TTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCT CCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTT GAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGC GGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAA GGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATC GTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATC CTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGTGT CAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACT GGTGTTCCTCCAAATATCTACGCATTTCACCGC TACACTTGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACT CAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGT TGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAA ACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTC CGGACACGCTGCCACCTACGTATTACCGCGGC TGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTT AGGTACCGTCAAGGCGCCGCCCTATTC—3’。對該基因進行局部相似性基本查詢工具（BLAST）中的Blastx 程序分析，發(fā)現(xiàn)GenBank 中該基因與其菌株的16S 氨基酸序列相似性較高。

選取與之相近的其他21 種菌株通過clustalw2.0建立系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖5。系統(tǒng)發(fā)育分析表明16S rDNA 與Bacillus purgationiresistens 等菌株直系同源物具有最高的相似性，相似性達到99%，該菌屬于芽孢桿菌屬。

圖 5 菌株 206BP 的 16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 16S rDNA phylogenetic tree of strain 206BP

2.3 菌株的生長特性

2.3.1 菌株206BP 的生長曲線 將菌株206BP 擴增繁殖后，按1∶100 的體積比接種于含NaCl 質(zhì)量分數(shù)為4%的培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)，間隔1～4 h 取樣，用分光光度計在波長600 nm 處檢測菌懸液的吸光度，繪制菌株生長曲線，見圖6。

圖 6 菌株206BP 生長曲線Fig. 6 Growth curve of strain 206BP

由圖6 可知，在NaCl 質(zhì)量分數(shù)為4%的培養(yǎng)基中，菌株 206BP 在 0～5 h 處于生長延滯期，5～22 h 處于指數(shù)生長期，24 h 之后達到穩(wěn)定期，穩(wěn)定期時間較長。

2.3.2 鹽度對菌株生長影響 嗜鹽菌根據(jù)其對鹽的依賴程度分為嗜鹽菌及耐鹽菌，而根據(jù)具體耐鹽程度不同又分為輕度耐鹽菌、中度耐鹽菌以及極端耐鹽菌，中度耐鹽菌在NaCl 質(zhì)量分數(shù)為3%～15% 范圍內(nèi)可很好地生長[18]，極端耐鹽菌可在NaCl 質(zhì)量分數(shù)為15%～30% 范圍內(nèi)生長[19]。菌株在最佳耐鹽條件下可以生長良好，并且進行正常繁殖，但是在非適宜條件下，就會影響其正常的生長及繁殖。實驗中配制液體培養(yǎng)基NaCl 質(zhì)量分數(shù)分別為0、1%、2%、3%、 4%、 5%、 6%、 8%、 10%、 12%、 14%、 16%、18%、20%，菌株206BP 在不同NaCl 質(zhì)量分數(shù)下的生長曲線見圖7。

由圖7 可知，在NaCl 質(zhì)量分數(shù)為0～20%條件下，菌株206BP 的生長情況差異明顯，當NaCl 質(zhì)量分數(shù)在 0～1%、5%～20%兩個區(qū)間時，菌株在培養(yǎng)14～16 h 后才進入指數(shù)生長期，當NaCl 質(zhì)量分數(shù)為8%時，直至19 h時進入指數(shù)生長期，值得注意的是，當NaCl 質(zhì)量分數(shù)大于10%時，菌株206BP 的生長始終處于停滯期，生長緩慢甚至幾乎不生長，而當NaCl 質(zhì)量分數(shù)為2%～4%時，菌株206BP 在培養(yǎng)12 h后即進入指數(shù)生長期，這與中度耐鹽菌特性吻合，菌株206BP 屬于中度耐鹽菌。

圖 7 NaCl 不同質(zhì)量分數(shù)下菌株206BP 的生長曲線Fig. 7 Growth curve of strain 206BP in different w(NaCl)

2.3.3 碳源及其濃度對菌株生長影響 實驗中選取葡萄糖、草酸、可溶性淀粉、蔗糖、抗壞血酸、木糖、半乳糖、甘露糖和果糖為菌株206BP 的唯一碳源來確定菌株對不同碳源的轉(zhuǎn)化利用情況，結(jié)果見圖8。

圖 8 碳源對菌株206BP 生長的影響Fig. 8 Effects of carbon sources on growth of strain 206BP

由圖8 可知，菌株206BP 對草酸的利用效果最差，在以草酸為唯一碳源時，菌株幾乎不生長，在接種培養(yǎng)24 h 后，OD600只有0.028；菌株對抗壞血酸、可溶性淀粉和半乳糖的利用效果也不理想，在接種培養(yǎng) 24 h 后，OD600分別為 0.106、0.198、0.484；以葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖和木糖為唯一碳源時菌株生長良好，接種培養(yǎng) 24 h 后，OD600分別為 1.045、0.965、1.086、1.042 和 0.889，其中果糖的 OD600比葡萄糖的OD600略高，考慮到葡萄糖的成本比果糖低，選擇葡萄糖為206BP 菌株培養(yǎng)基的最佳碳源。

本文測定了不同葡萄糖質(zhì)量濃度（0、200、500、1 000、2 000、5 000 mg/L）對菌株生長的影響，結(jié)果見圖9。在不同質(zhì)量濃度葡萄糖條件下，生長曲線中穩(wěn)定期的OD600值隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的上升而上升，碳源作為微生物的大量營養(yǎng)物,其質(zhì)量濃度影響了菌株的生長總量。當葡萄糖質(zhì)量濃度為0～2 000 mg/L時，生長曲線的停滯期時間基本相同，當葡萄糖質(zhì)量濃度達到5 000 mg/L 時，停滯期延長，進入指數(shù)期的時間較其他質(zhì)量濃度條件推遲約5 h，表明碳源質(zhì)量濃度過高也會對菌株生長產(chǎn)生一定的抑制作用。

圖 9 葡萄糖質(zhì)量濃度對菌株206BP 生長的影響Fig. 9 Effects of glucose mass concentration on growth of strain 206BP

2.3.4 氮源及其濃度對菌株生長的影響 實驗中選擇 NaNO3、NH4Cl、CH3CO2NH4、(NH4)2SO4和尿素為氮源進行最佳氮源實驗，結(jié)果見圖10。

圖 10 不同氮源對菌株206BP 生長的影響Fig. 10 Effects of nitrogen sources on growth of strain 206BP

由圖10 可知，菌株206BP 對醋酸銨的利用效果最好，對NaNO3的利用效果最差。在以醋酸銨為氮源時，生長曲線穩(wěn)定期的OD600值明顯更大，表明醋酸銨有助于菌株生長總量的增加，這主要是因為醋酸銨內(nèi)含有一定比例的碳源。由于菌株對尿素、NH4Cl 和(NH4)2SO4利用效率差不多，從經(jīng)濟成本考慮，選擇尿素為最佳氮源，并考察不同氨氮質(zhì)量濃度對菌株生長的影響，實驗結(jié)果見圖11。

由圖11 可知，不同尿素質(zhì)量濃度對菌株生長曲線的停滯期沒有影響，不同尿素質(zhì)量濃度時停滯期均為5 h 左右，對指數(shù)期的生長速率略有影響，質(zhì)量濃度高時生長速率大，對菌株生長總量也有一定影響，尿素不添加時，穩(wěn)定期OD600低于含氮源條件下的值，菌株接種后培養(yǎng)到32 h 時，尿素質(zhì)量濃度為0、10、50、100、200、300、600、1 200 mg/L 時對應的OD600分 別 為 0.739、 0.843、 0.873、 0.878、 0.861、0.864、0.865 和0.861，結(jié)果表明，當質(zhì)量濃度增加到50 mg/L 時，繼續(xù)增加尿素質(zhì)量濃度對菌株生長已經(jīng)沒有進一步的促進作用，因此選擇尿素最佳質(zhì)量濃度為50 mg/L。

圖 11 尿素質(zhì)量濃度對菌株206BP 生長的影響Fig. 11 Effects of urea mass concentration on growth of strain 206BP

2.3.5 初始pH 對菌株生長的影響 pH 是影響微生物生長的主要因素之一，實驗中考察不同pH 值對菌株206BP 的生長影響，結(jié)果見圖12。由圖可見，菌株可生長的pH 值在5～8 之間，當pH 值為5 時，菌體進入指數(shù)期的時間會延后，但是一旦適應后，穩(wěn)定期的OD600值比 pH 值為 7 時還要高 0.1，因此最佳 pH 值為5～7。

圖 12 pH 值對菌株206BP 生長的影響Fig. 12 Effects of pH value on growth of strain 206BP

3 結(jié) 論

（1）以不同高鹽廢水和土壤樣品為菌源，從中分離純化出多株可耐高鹽菌，并篩選出對頁巖氣采出水中有機物具有最佳降解效果的優(yōu)勢菌株，該菌株大小約 2 μm，芽孢約 0.3～0.6 μm，菌株為革蘭氏染色陽性菌，菌株生長過程中產(chǎn)生分解尿素的尿素酶和硫化氫氣體，對淀粉能夠水解利用，不能分解蛋白質(zhì)中色氨酸生成吲哚，不能液化明膠，可還原硝酸鹽和亞硝酸鹽。

（2）通過16S rDNA 基因分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹可知，菌株206BP 的16S rDNA 與Bacillus purgationir--esistens 等菌株直系同源物具有最高的相似性，屬于芽孢桿菌的一種，但是未找到一致序列，推斷為芽孢桿菌新型菌株。

（3）不同因素對優(yōu)勢菌株生長影響實驗結(jié)果表明，該菌株在NaCl 質(zhì)量分數(shù)為0～8%下生長良好，屬于中度耐鹽菌；菌株生長的最佳pH 在5～7，最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為尿素。