CAR-NK 細(xì)胞治療乳腺癌的研究進(jìn)展

楊玉蘭，梁俊青，郭偉春，臧智超，王浩然

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院科研部，內(nèi)蒙古 呼和浩特）

0 引言

根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的最新《全球癌癥報(bào)告》顯示，2018年全球乳腺癌發(fā)病率達(dá)24.2%，死亡率達(dá)15%，在女性惡性腫瘤中仍位列首位，同時(shí)也是女性因癌癥死亡的首要原因，嚴(yán)重危害女性健康[1]。乳腺腫瘤微環(huán)境具有免疫抑制作用，在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。隨著對(duì)惡性細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間相互作用的深入了解，使研究人員能夠利用新的免疫治療策略來(lái)控制免疫系統(tǒng)。關(guān)于乳腺癌免疫治療的研究也越來(lái)越受到重視，其中許多策略已經(jīng)在乳腺癌方面顯示出了前景。

快速發(fā)展的嵌合抗原受體（chimeric antigen re-ceptor，CAR）修飾T細(xì)胞在治療惡性腫瘤，特別是血液系統(tǒng)惡性腫瘤方面取得了巨大的成就[2-5]。近幾年，研究人員通過(guò)不斷探索優(yōu)化CAR-T細(xì)胞療法，在臨床各類(lèi)型腫瘤治療上取得了良好效果。與此同時(shí)，同樣源于強(qiáng)大免疫系統(tǒng)的NK細(xì)胞也不容小覷。目前，也已經(jīng)有很多基礎(chǔ)和臨床實(shí)驗(yàn)人員在研究如何構(gòu)建高效的CAR-NK，CAR-NK細(xì)胞過(guò)繼免疫治療的潛力正逐漸被挖掘?，F(xiàn)將 CARNK 細(xì)胞療法的發(fā)展及其在治療乳腺腫瘤方面的一些相關(guān)研究進(jìn)展作一綜述。

1 CAR-NK 細(xì)胞概述

1.1 CAR 修飾的T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞概述

CAR的概念最早是由 Gross 等[6]在1989年提出，之后利用CAR構(gòu)建的T細(xì)胞研究得到了迅速發(fā)展，特別是在血液腫瘤方面。美國(guó)食品和藥物管理局（Food and Drug Adminis-tration，F(xiàn)DA）已經(jīng)批準(zhǔn)其作為某些白血病和淋巴瘤的治療手段應(yīng)用于臨床[7-8]。此外，美國(guó)食品藥物監(jiān)督管理局分別在2017 年 8 月、10 月批準(zhǔn)將 tisagenlecleucel[9]和 axicabtageneciloleucel[10]兩項(xiàng)CAR-T療法用于腫瘤治療，這兩項(xiàng)研究成果的成功應(yīng)用，使2017年在CAR-T 發(fā)展進(jìn)程中具有了重大意義。

據(jù)報(bào)道CD19靶向的CAR-T細(xì)胞在急性淋巴細(xì)胞白血病患者中的完全應(yīng)答率為70%至90%[11]。然而，CAR修飾的T細(xì)胞對(duì)實(shí)體瘤的治療效果比較差[12-14]。此外，CAR-T 細(xì)胞治療也存在著一些如細(xì)胞因子風(fēng)暴、脫靶效應(yīng)、CAR-T 細(xì)胞的制備周期長(zhǎng)以及基因突變等風(fēng)險(xiǎn)[15,16]。由于CAR-T 臨床應(yīng)用的限制和各種副作用，用CAR模式構(gòu)建的NK細(xì)胞被認(rèn)為是更有治療惡性腫瘤的潛力[17],特別是對(duì)于治療一些實(shí)體腫瘤，有可能比CAR修飾的T細(xì)胞治療效果更好。

與表達(dá)CAR的T細(xì)胞相似，CAR修飾的NK細(xì)胞在體外和體內(nèi)都表現(xiàn)出了更好的腫瘤特異靶向性和對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性[18-19]。NK細(xì)胞在基于CAR的免疫療法中具有許多優(yōu)勢(shì)，例如，由于異基因NK細(xì)胞不會(huì)引起移植物抗宿主反應(yīng)（GVHD），也無(wú)需人類(lèi)白細(xì)胞抗原（HLA）匹配[20]，所以也可被用作效應(yīng)細(xì)胞。此外，因?yàn)镃AR-NK細(xì)胞通常不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞因子風(fēng)暴且較少引起脫靶效應(yīng)，因此可能比CAR-T細(xì)胞更安全。CAR-NK細(xì)胞除了CAR介導(dǎo)的靶向殺傷之外，還可以通過(guò)NK細(xì)胞自身的抗腫瘤特性，識(shí)別并殺傷CAR靶標(biāo)下調(diào)或缺失的腫瘤細(xì)胞，提高免疫治療效果。另外，NK細(xì)胞有許多不同的來(lái)源，如外周血（PB）、人類(lèi)胚胎干細(xì)胞(HESCs)、臍帶血(UCB)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(IPSC)，NK-92細(xì)胞系[20]等。在最新的一項(xiàng)研究中，小組人員在卵巢癌異種移植小鼠模型中測(cè)試了源自人類(lèi)IPSC的CAR-NK細(xì)胞，并比較了它們與其他來(lái)源NK細(xì)胞、CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性。結(jié)果表明，IPSC來(lái)源的CAR-NK細(xì)胞CAR4-iPSNK具有與CAR-T細(xì)胞相似的殺傷活性，但毒性較低。由此可推測(cè)，包括乳腺癌在內(nèi)的實(shí)體腫瘤和白血病等血液腫瘤也可能是其潛在的治療目標(biāo)[21]。同時(shí)，最近由IPSC衍生的靶向多種抗原的CAR-NK細(xì)胞藥物FT596已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)進(jìn)行臨床研究，這表明CAR-NK免疫療法對(duì)于腫瘤治療的安全性和可靠性。

1.2 CAR 的結(jié)構(gòu)

經(jīng)過(guò)CAR構(gòu)建的NK細(xì)胞，可以提高免疫細(xì)胞的靶向性，高效的識(shí)別腫瘤細(xì)胞，并通過(guò)釋放殺傷介質(zhì)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等多種方式殺傷腫瘤細(xì)胞。CAR結(jié)構(gòu)主要是由三個(gè)功能域組成，即胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域由識(shí)別并結(jié)合抗原的單克隆抗體的單鏈可變片段（scFv）及一段起連接作用的鉸鏈區(qū)構(gòu)成?？缒そY(jié)構(gòu)域可以將胞外結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域連接起來(lái)，并可以將受體錨定到免疫細(xì)胞。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域由共刺激結(jié)構(gòu)域和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[22]。

第一代CAR于1989誕生，目前為止，CAR結(jié)構(gòu)已發(fā)展到第四代。第一代細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域僅含有 CD3ζ 鏈，體內(nèi)存活時(shí)間較短; 第二代在第一代的基礎(chǔ)上加入了共刺激域（如 CD28、4-1BB、CD134和 ICOS）,使免疫細(xì)胞抗腫瘤活性明顯增強(qiáng);第三代CAR結(jié)構(gòu)包含一個(gè) CD3ζ 鏈和兩個(gè)或多個(gè)不同共刺激分子，可使免疫細(xì)胞持續(xù)活化增殖，增強(qiáng)殺傷腫瘤細(xì)胞作用; 第四代則加入了細(xì)胞因子或共刺激配體[23]，從而使修飾過(guò)的免疫細(xì)胞的增值活性和壽命得到了很大提升。CAR-NK的設(shè)計(jì)思路和基本框架是通過(guò)借鑒CAR-T細(xì)胞的構(gòu)建而設(shè)計(jì)的，但其也有一些特有的個(gè)性化設(shè)計(jì)。例如，篩選了DNAX相關(guān)蛋白12( DNAX-associated protein 12，DAP12) 和DAP10為胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，DAP12可能比CD3ζ 能更有效地激活NK細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。目前已經(jīng)有研究人員開(kāi)發(fā)了包含自然殺傷組2，成員 D( Natural killer group 2，member D，NKG2D) 的胞外結(jié)構(gòu)域，NKG2D 作為自然殺傷細(xì)胞的表面受體，在多種腫瘤中都有其配體的表達(dá)。此外，有研究顯示CARNK細(xì)胞對(duì)廣譜腫瘤細(xì)胞亞型具有較強(qiáng)的殺傷毒性，這些個(gè)性化設(shè)計(jì)對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病、骨肉瘤、橫紋肌瘤細(xì)胞和前列腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞系都有很好的殺傷效果[24]。

tran等人報(bào)道第一個(gè)用于NK細(xì)胞的CAR是CD4-CD3ζ(CD4ζ)融合受體[25]。在本研究中，CD4ζ 嵌合受體具有生物化學(xué)和功能活性，可以有效地引導(dǎo)人NK細(xì)胞在體外殺傷表達(dá)gp120蛋白的艾滋病病毒（HIV）感染的CD4+T細(xì)胞或NK耐藥腫瘤細(xì)胞，這表明CAR結(jié)構(gòu)可以成功表達(dá)在NK細(xì)胞上，從而實(shí)現(xiàn)高效的重定向[25]。隨后，采取了更多的探索試驗(yàn)來(lái)增強(qiáng)NK細(xì)胞的抗腫瘤能力。

2 CAR-NK 細(xì)胞治療乳腺癌的研究進(jìn)展

2.1 CAR-HER2 修飾的NK 細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷

研究[26-27]發(fā)現(xiàn)，大約30%的乳腺癌患者過(guò)表達(dá)抗人表皮生長(zhǎng)因子受體2( HER2 )基因。目前臨床上廣泛應(yīng)用的抗乳腺癌的藥物曲妥珠單抗，被證實(shí)對(duì)高度表達(dá)HER2 的乳腺癌細(xì)胞具有很好的抑制作用[28]。然而曲妥珠單抗在單用藥時(shí)僅對(duì)低于35% 的高表達(dá)HER2基因的乳腺癌患者有效[29]。且有許多HER2陽(yáng)性乳腺癌患者會(huì)出現(xiàn)對(duì)曲妥珠單抗等靶向藥物耐藥現(xiàn)象[30]。因此，HER2-CAR修飾的NK細(xì)胞免疫治療成為了研究熱點(diǎn)。

靶激活NK-92（taNK）細(xì)胞與另一種用CARs修飾的NK-92細(xì)胞的工程突變體，已經(jīng)被設(shè)計(jì)用來(lái)靶向殺傷表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)的腫瘤細(xì)胞[31,32]。有研究表明，用HER2-CAR（CD28-CD3ζ）修飾的NK 細(xì)胞和 NK92 細(xì)胞系對(duì)HER2陽(yáng)性的乳腺癌、卵巢癌和上皮細(xì)胞癌等腫瘤細(xì)胞系的殺傷作用明顯增強(qiáng)，并且在小鼠模型中能夠有效減慢腫瘤的生長(zhǎng)速度[33，34]。Liu等[35]人通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選(FACS)在細(xì)胞表面上表達(dá)高水平融合蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK-92-抗ErbB2 scFvCD28-ζ 細(xì)胞后, 發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞特異性地加快了表達(dá)ErbB2的人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-453和SKBr3的細(xì)胞死亡?？诪t等[36]人使用 NK-92MI 細(xì)胞系，利用病毒轉(zhuǎn)染的方試，將 HER2-CAR 構(gòu)建到 NK-92MI 細(xì)胞上，然后在細(xì)胞水平以及乳腺癌原位動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中觀察到了顯著的靶向特異性，這表明，HER2抗原特異性CAR在一定程度上對(duì)HER2陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞具有較為明顯的殺傷作用。HER2-taNK已經(jīng)證明了taNK細(xì)胞穩(wěn)定的CAR表達(dá)和活性，這種細(xì)胞系目前正在復(fù)發(fā)性HER2陽(yáng)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中進(jìn)行測(cè)試[37]。

2.2 表達(dá)PD-L1 的CAR-NK 細(xì)胞療法臨床進(jìn)展

程序性死亡受體 1（PD-1）和程序性死亡受體配體 1（ PDL1）是近年來(lái)出現(xiàn)的一種新型免疫療法[38]，通過(guò)阻斷 PD-1/PD-L1信號(hào)通路進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)治療腫瘤的目的[39]。許多研究表明，PD-L1在在乳腺癌中處于高表達(dá)狀態(tài)[40,41],因此，有研究人員提出利用表達(dá)PD-L1的CAR-NK細(xì)胞藥物來(lái)進(jìn)行臨床試驗(yàn)。PD-L1.t-haNK細(xì)胞療法是一種新穎的基于NK細(xì)胞的腫瘤免疫療法，利用PD-L1特異性單鏈抗體片段被設(shè)計(jì)成一種特殊的CAR-NK細(xì)胞來(lái)介導(dǎo)抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒作用。

2019年6月，納斯達(dá)克上市公司NantKwest的PD-L1.t-haNK新藥臨床試驗(yàn)申請(qǐng)已經(jīng)獲得FDA批準(zhǔn)，這是該項(xiàng)目在局部晚期或轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤中的首次人體臨床試驗(yàn)。PD-L1.t-haNK是表達(dá)靶向PD-L1的嵌合抗原受體的haNK細(xì)胞，haNK是公司專(zhuān)有的NK-92細(xì)胞系。這些細(xì)胞有兩種主要的殺傷機(jī)制，即直接NK殺傷和PD-L1特異性殺傷。該療法可以應(yīng)用于與其他靶向方法結(jié)合使用[42]。

同年12月初， NantKwest宣布了其在CAR-NK治療領(lǐng)域的部分臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這項(xiàng)首次人體試驗(yàn)評(píng)估了該公司針對(duì)腫瘤局部晚期或轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤的全球首創(chuàng)PD-L1.t-haNK細(xì)胞療法的安全性和初步療效。這些患者分別患有頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、膀胱癌。試驗(yàn)顯示，6名患者每次接受20億個(gè)細(xì)胞的靜脈輸注，輸注次數(shù)在9-23次之間，這些接受PDL1.t-haNK治療的門(mén)診患者均沒(méi)有發(fā)生嚴(yán)重不良事件或劑量限制性毒性，均表現(xiàn)出了CAR-NK細(xì)胞藥物較高的安全性，這表明CAR-NK療法有可能克服CAR-T治療實(shí)體瘤的局限性[43]。

2.3 CAR-NK 細(xì)胞與溶瘤病毒聯(lián)合應(yīng)用

溶瘤病毒（OV）是一類(lèi)通過(guò)野生篩選或使用基因改造技術(shù)構(gòu)建、能夠在腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制、溶解腫瘤細(xì)胞的病毒。之前的研究表明，OV的作用機(jī)制包括直接裂解腫瘤細(xì)胞、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境、募集腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）、啟動(dòng)先天免疫細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，以及調(diào)節(jié)血管生成。OV具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)：經(jīng)臨床前研究證實(shí)具有廣譜的抗腫瘤效果，對(duì)多種腫瘤都有效，且安全性出色。因此，溶瘤病毒在腫瘤治療過(guò)程中的多功能特性使其具有與其他藥物聯(lián)用增效的巨大潛力。一項(xiàng)三陰性乳腺癌的臨床前研究模型中顯示，溶瘤馬拉巴病毒可使難治性腫瘤對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的敏感性增強(qiáng)[44]。此外，用多種細(xì)胞因子武裝的溶瘤病毒也被用于與CAR-T細(xì)胞療法聯(lián)合；在異種移植瘤模型中，這種聯(lián)合策略也增強(qiáng)了抗腫瘤活性[45]。據(jù)此，可以設(shè)想將CAR-NK與溶瘤病毒聯(lián)合起來(lái)治療乳腺腫瘤。

在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中乳腺癌腦轉(zhuǎn)移（B2BM）較常見(jiàn)，且預(yù)后較差。在最新的研究中發(fā)現(xiàn)，B2BM的關(guān)鍵機(jī)制涉及N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）,該受體存在于神經(jīng)元的細(xì)胞膜上，并且參與傳播神經(jīng)沖動(dòng)，NMDAR由在這種神經(jīng)沖動(dòng)的突觸傳遞期間從突觸前神經(jīng)元釋放的谷氨酸激活[46]。有研究顯示，與單獨(dú)使用CAR-NK細(xì)胞的療法相比，第二代設(shè)計(jì)的表皮生長(zhǎng)因子受體-CAR-NK細(xì)胞與溶瘤性單純皰疹病毒（oHSV）的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)乳腺癌細(xì)胞株具有更高的殺傷率，并在乳腺癌小鼠模型中可以有效抑制腫瘤擴(kuò)散[47]。這可能為CAR-NK細(xì)胞聯(lián)合溶瘤性病毒有效治療其他耐藥實(shí)體腫瘤提供了參考價(jià)值。

2.4 CAR-NK 細(xì)胞聯(lián)合化療

研究表明放化療可上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面 NK 細(xì)胞活化性受體配體的表達(dá)，提高腫瘤細(xì)胞的敏感性，進(jìn)一步提高 NK細(xì)胞治療緩解率[48]。紫杉醇（paclitaxel，PTX）是乳腺癌化療中的基石方案，尤其是對(duì)于三陰性（TNBC）這類(lèi)高?；颊摺Ｔ?018年的歐洲腫瘤內(nèi)科學(xué)會(huì)（ESMO）上，有研究公布紫杉類(lèi)聯(lián)合免疫治療對(duì)比單純化療可以顯著提高患者療效，并延長(zhǎng)患者的總生存。這可以為CAR-NK聯(lián)合化療治療乳腺腫瘤提供研究思路，同時(shí)，隨著腫瘤免疫治療研究的發(fā)展，利用免疫細(xì)胞作為載體直接將抗癌藥物運(yùn)送到腫瘤部位的概念受到了研究人員的關(guān)注。有研究報(bào)道，NK 細(xì)胞表面具有高水平的游離巰基[49]。Elizabeth L. Siegler等的研究顯示，免疫細(xì)胞可以作為直接對(duì)腫瘤有細(xì)胞毒性的納米粒子或攜帶化療藥物的納米粒子的活性載體。納米粒子可以通過(guò)直接利用氨基或巰基等官能團(tuán)結(jié)合到腫瘤細(xì)胞表面，通過(guò)疏水作用、靜電相互作用進(jìn)入脂質(zhì)雙層或附加到特定的細(xì)胞表面受體。交聯(lián)多層脂質(zhì)體小泡（cMLV）是由硫醇反應(yīng)的馬來(lái)酰亞胺頭部基團(tuán)修飾的脂質(zhì)體，可穩(wěn)定地結(jié)合到NK細(xì)胞表面的還原巰基上。因此，CARNK細(xì)胞可促使包載PTX的cMLV進(jìn)入腫瘤部位，有效減緩腫瘤生長(zhǎng)，增加腫瘤內(nèi)PTX濃度[50]。此研究證明，應(yīng)用嵌合抗原受體工程的NK-92細(xì)胞作為載體，將載藥納米粒子直接導(dǎo)向靶點(diǎn)，在體外和體內(nèi)試驗(yàn)都能提高乳腺癌化療的療效，同時(shí)也可減少非靶點(diǎn)毒性[50]。

3 CAR-NK 細(xì)胞免疫治療的不足和挑戰(zhàn)

雖然CAR修飾的NK細(xì)胞相對(duì)于CAR-T細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)為其在難治性惡性乳腺癌細(xì)胞的免疫治療中的應(yīng)用提供了很大的希望，但目前也存在許多問(wèn)題。首先，NK細(xì)胞上CARs的最優(yōu)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)尚未得到系統(tǒng)研究。CAR結(jié)合表位的位置及其與CAR-NK細(xì)胞表面的距離可能會(huì)影響其與抗原的結(jié)合、免疫突觸的最佳形成和CAR-NK細(xì)胞的激活[51]。此外，由于NK細(xì)胞的異質(zhì)性，其包含有許多不同功能特征的不同NK亞群，而不同NK細(xì)胞亞群可能特異性地參與各種免疫反應(yīng)和相關(guān)疾病易感性[52]。所以仍有待進(jìn)一步探索選擇何種NK細(xì)胞亞群來(lái)擴(kuò)增和構(gòu)建靶向殺傷乳腺腫瘤的CAR-NK細(xì)胞。

越來(lái)越多的研究者正在積極開(kāi)發(fā)更有效的方法以提高NK細(xì)胞為基礎(chǔ)的抗腫瘤免疫功能。體外擴(kuò)增/激活技術(shù)的進(jìn)步以及基因修飾NK細(xì)胞新方法的出現(xiàn)，使NK細(xì)胞的過(guò)繼免疫治療有望成為對(duì)抗惡性腫瘤的有力武器。此外，找到更好的聯(lián)合治療方案，找到更好的療效預(yù)測(cè)指標(biāo)，找到更好的副作用控制措施，也是CARNK治療乳腺癌面臨的新挑戰(zhàn)。