類泛素化修飾Neddylation 在腫瘤中的研究進展

朱小康，郭博，李新志

（三峽大學醫(yī)學院，三峽大學附屬仁和醫(yī)院，湖北 宜昌）

0 引言

NEDD8(neuralprecursor cell-expressed developmentally downregulated 8)即神經前體表達發(fā)育下調蛋白8，它是一種類泛素蛋白，最先報道是在小鼠胚胎的腦組織中高度富集的新的信使RNA[1]，但后經研究發(fā)現(xiàn)NEDD8是由81個氨基酸編碼的蛋白質，它和泛素蛋白（ubiquitin）具有80%的相似性和60%的一致性[2]。NEDD8在大多數(shù)真核生物(動物、植物、真菌)中高度保守，對真核細胞的生命活動具有十分重要的功能[3]。NEDD8介導的類泛素共價修飾過程稱為Neddylation，即NEDD8經E1-E2-E3級聯(lián)傳遞后與底物共價結合，從而調節(jié)底物的生物學功能。Neddylation修飾調控著許多重要的生命活動，如細胞周期、免疫應答、調節(jié)蛋白降解、轉錄因子活性和DNA修復等多種生物學進程，其功能的失調與神經性病變、炎癥反應、免疫缺陷以及腫瘤等病理過程也密切相關[4]。有研究表明小分子抑制劑MLN4924（pevonedistat）可特異性的抑制Neddylation的E1活化酶NAE，通過抑制NAE的活性從而阻斷蛋白質的Neddylation修飾通路，可以達到抑制腫瘤相關信號通路的作用；MLN4924在多種腫瘤動物模型中表現(xiàn)出良好的抑瘤效果，現(xiàn)已進入Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗[5-6]。

1 NEDD8 介導的Neddylation 修飾通路

Neddylation是一種類似泛素化的蛋白質翻譯后修飾方式，（蛋白質翻譯后修飾指的是在mRNA被翻譯成蛋白質后，對蛋白質上特定氨基酸殘基進行共價修飾的過程）它能將類泛素蛋白NEDD8共價可逆結合于靶標蛋白[7]。Neddylation的過程首先通過C端的蛋白酶水解作用去除第76 位甘氨酸后的一個或多個氨基酸殘基，將NEDD8前體加工為成熟形式，隨后被NEDD8的E1活化酶（由UBA3和APPBP1組成一個異源二聚體）活化；活化NEDD8轉移到E2結合酶UBC12，然后通過E3連接酶結合到特定的底物上，最終完成靶標蛋白的NEDD8偶聯(lián)[8-10]；底物上的結合的NEDD8也可以被去Neddylation酶介導去除NEDD8分子，去Neddylation后的NEDD8分子可以重新進入循環(huán)。

2 去類泛素化修飾Deneddylation

在蛋白的Neddylation循環(huán)通路中，去類泛素化（Deneddylation）的反向調控也起重要的作用。去類泛素化的酶能夠將NEDD8 從修飾蛋白中解離下來，介導Deneddylation過程的酶包括CSN、NEDP1、USP21、UCH-L1和 UCH-L3等去類泛素化酶，其中CSN和NEDP1是特異性針對NEDD8的去泛素化酶[4,8]。CSN(COP9 signalsome，CSN)是一種目前研究熱門的NEDD8去類泛素修飾酶，是最具有特征性的Deneddylation的酶，它在動植物中高度保守[11]；有研究表明CNS在體內能夠特異性去除cullin-RING連接酶的類泛素化修飾[12]。神經前體表達發(fā)育下調蛋白8特異性蛋白酶1(NEDD8-specific protease 1，NEDP1，又稱DEN1)是SENP家族成員之一，又被稱為SENP8（Sentrin-specific protease 8），它由212個氨基酸殘基組成，是一個進化保守的半胱氨酸蛋白酶，在酵母、植物、昆蟲和哺乳動物中存在高度同源性[13，14]。NEDP1雖然可以水解NEDD8的C端促進NEDD8成熟；但其主要功能在于能夠促使NEDD8分子解偶聯(lián)，降低底物Neddylation修飾水平，平衡Neddylation修飾水平在體內的異常上調[15]。但NEDP1在動物體內的生理功能及作用機制仍然不十分清楚。

3 Neddylation 修飾與肝癌

原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一,目前已知肝癌的發(fā)病與肝硬化、病毒性肝炎、黃曲霉素以及某些化學致癌物質和水土因素有關；其中又涉及到原癌基因(如ras、c-myc、HBV X基因)的激活和抑癌基因(如P53、P16、P12、PTEN 基因)的失活，還有某些信號通路的激活都與肝癌的發(fā)生有關[16]。有研究表明肝癌的驅動因子人抗原R(HuR)在肝癌中發(fā)揮重要作用，其表達上調與肝癌的發(fā)生發(fā)展、預后密切相關；HuR是一種廣泛表達的RNA結合蛋白，屬于ELAVL樣家族,通過結合靶基因mRNA3’-UTR中富含AU的元件，參與mRNA的穩(wěn)定化、剪接和翻譯過程，從而調節(jié)細胞去分化，增殖和存活[17]。在人肝細胞癌中HuR蛋白的表達水平又與癌基因Mdm2的表達呈正相關，有學者研究發(fā)現(xiàn)是由于HuR通過Mdm2介導的Neddylation修飾保持核定位的穩(wěn)定性以防止其被降解[18]；同時HuR蛋白也是NEDD8介導的Neddylation修飾的靶標[19]。另一項研究表明NEDD8介導的Neddylation修飾與肝臟纖維化的發(fā)生密切相關[20]，而肝纖維化會進一步轉化為肝硬化，臨床上部分肝硬化的患者最終會進展為肝癌。有學者研究發(fā)現(xiàn)，患者肝癌組織中Neddylation修飾的途徑均被過度激活，研究者通過免疫組化（IHC），Western-blot、RT-qPCR分析了來自臨床的509例肝細胞癌患者的癌組織和癌旁肝組織中的Neddylation修飾途徑（包括NEDD8蛋白、E1激活酶、E2結合酶、E3連接酶），結果顯示與癌旁正常的肝組織相比，肝癌組織中Neddylation修飾途徑被過度激活，此外，肝癌組織中NEDD8的上調與肝癌的侵襲性相關，并且是肝切除術后肝細胞癌患者總生存期（OS）和無復發(fā)生存期（RFS）的獨立危險因素[21]。

4 Neddylation 修飾與結直腸癌

目前已發(fā)現(xiàn)報道的NEDD8連接酶有十幾種，根據(jù)其結構域的不同可分為可分為環(huán)指結構(RING finger)、E6AP C-末端同源蛋白(homologous to E6AP C-terminus, HECT)型和U box三大類。smad泛素化調節(jié)因子1(smad ubiquitylation regulatory factor 1, Smurf1) Smurf1是屬于HECT類型的NeddylationE3連接酶[22]。有學者研究發(fā)現(xiàn)Smurf1的Neddylation修飾與結直腸的發(fā)生的密切相關，Smurf1可與NEDD8和Ubc12發(fā)生相互作用，從而形成NEDD8-硫酯中間體，在多個賴氨酸殘基上催化其自身的烯丙基化，這種自身交聯(lián)化需要HECT 結構中C426處有一個活性位點。Smurf1的Neddylation修飾可以有效地增強泛素酶E2的募集并增強Smurf1的泛素連接酶活性；而Smurf1泛素連接酶活性異常地增強，可加速底物降解，從而促進了結直腸癌的發(fā)生[23]。此外，在人結直腸腸癌中，NEDD8，NAE1和Ubc12的表達升高與結直腸癌進展和預后相關。

5 Neddylation 修飾與肺癌

復旦大學腫瘤研究所的一項研究表明，Neddylation修飾通路的過度活化與肺癌的發(fā)生發(fā)展呈正相關。研究者通過免疫組化，Western-blot、RT-qPCR分析了75例肺癌患者的腫瘤組織和癌旁組織中E1活化酶NAE1和E2結合酶UBC12的表達情況以及總蛋白的Neddylation修飾水平；結果顯示在肺腺癌和肺鱗狀細胞癌中，NEDD8的E1活化酶NAE1和E2結合酶UBC12表達顯著上調，總蛋白的Neddylation修飾水平也明顯上調；進一步研究發(fā)現(xiàn)Neddylation修飾水平與肺癌患者的預后呈負相關，與Neddylation修飾低表達的肺腺癌患者相比，Neddylation修飾高表達的肺腺癌患者的總生存期較差。此外，用NAE抑制劑MLN4924可顯著抑制肺癌細胞的體外增殖和癌細胞遷移，在荷瘤小鼠體內也表現(xiàn)出抑制腫瘤的形成和轉移[24]。另一項研究也支持前述觀點，研究者發(fā)現(xiàn)肺癌組織中UBC12的mRNA水平遠高于正常的肺組織，且隨著疾病惡化而增加，并與NEDD8表達呈正相關；此外，UBC12的過表達顯著增強了蛋白質的Neddylation修飾，而UBC12的下調減少了目標蛋白的Neddylation修飾。進一步研究表明UBC12沉默可抑制Cullin Neddylation修飾，導致CRL E3連接酶失活，并誘導腫瘤抑制性CRL底物（p21，p27和Wee1）的積累，從而誘導腫瘤細胞周期停滯并抑制肺癌的惡性分化[25]。

6 Neddylation 修飾與乳腺癌

Cullins是NEDD8修飾的主要底物，cullins蛋白的Neddylation修飾在泛素介導的蛋白質降解中起重要作用；有研究顯示乳腺癌相關蛋白3（BCA3）是NEDD8的底物，BCA3通過Neddylation修飾與p65和Cyclin D1啟動子結合從而達到抑制NF-κB轉錄的作用[26]。研究表明c-Jun NH2末端蛋白激酶（JNK）途徑與乳腺腫瘤的發(fā)生有關[27]，但其具體作用機制不十分清楚。有學者報道JNK特異性激酶MAP2K、MKK7在人乳腺癌細胞中發(fā)生Neddylation修飾。Neddylation修飾可能會通過限制JNK磷酸化來促進乳腺腫瘤的發(fā)展[28]。放射療法是局部控制乳腺癌的有效治療方案。然而，乳腺癌細胞的放射抗性限制了治療的效果。有研究表明，MLN4924可以作為用于乳腺癌放射治療的增敏劑，學者研究發(fā)現(xiàn)MLN4924有效的抑制了cullis的 Neddylation修飾使乳腺癌細胞對放射線敏感，其敏感性增強比（SER）對SK-BR-3細胞為1.75，對 MCF7細胞為1.32[29]。

7 總結和展望

越來越多研究結果表明Neddylation修飾與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著千絲萬縷的聯(lián)系，Neddylation修飾通路廣泛參與調控腫瘤的細胞周期、細胞凋亡、細胞自噬、血管生成以及腫瘤微環(huán)境的調節(jié)等多種生物學過程[30]；靶向Neddylation通路E1活化酶的抑制劑MIN4924已經被廣泛證實可以抑制多種腫瘤細胞的惡性增殖和侵襲，目前正處于Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗中[5-6]。對這些科學問題的深入研究不僅會加深我們對Neddylation修飾在癌癥生物學中作用機制的了解，而且還將有助于開發(fā)新的腫瘤標志物以及更具有選擇性的靶向抑制劑，為癌癥患者的個體化治療提供新方向。