TPPU 對(duì)于缺血性腦卒中神經(jīng)單元保護(hù)的研究歷程及現(xiàn)狀

黃攀，張琳蕾，易興陽(yáng)★，韓釗★

（1.德陽(yáng)市人民醫(yī)院，四川 德陽(yáng)；2. 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，浙江 溫州）

0 引言

缺血性卒中是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的重大疾病，發(fā)病率高，占所有腦卒中的80%左右，溶栓治療和神經(jīng)保護(hù)治療是其兩大主要治療策略。重組組織型纖溶酶原激活（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）是唯一獲得批準(zhǔn)的缺血性卒中的溶栓藥物，其溶栓療效已經(jīng)在臨床實(shí)踐得到證實(shí)[1]。由于受到時(shí)間窗狹窄(發(fā)病后4.5小時(shí)內(nèi))和顱內(nèi)出血風(fēng)險(xiǎn)的限制，限制了溶栓治療在臨床上的廣泛應(yīng)用，因此，神經(jīng)保護(hù)治療一直是缺血性卒中治療領(lǐng)域的夢(mèng)想和希望。近三十年來(lái)，針對(duì)腦缺血病理生理環(huán)節(jié)開(kāi)發(fā)了多種神經(jīng)保護(hù)劑，如抗氧化劑、鈣通道拮抗劑、興奮性氨基酸受體抑制劑和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等，全球進(jìn)行了1000多個(gè)腦保護(hù)實(shí)驗(yàn)研究和100多個(gè)臨床研究，大多在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有效而臨床試驗(yàn)無(wú)效，導(dǎo)致臨床轉(zhuǎn)化失敗[2]。迄今尚無(wú)有效的神經(jīng)保護(hù)劑獲得臨床指南推薦[1,3]，但是人類(lèi)研發(fā)有效神經(jīng)保護(hù)劑的探索一直沒(méi)有終止。2011年美國(guó)卒中學(xué)術(shù)產(chǎn)業(yè)圓桌會(huì)議（Stroke Academic Industry Roundtable，STAIR)提出了腦卒中神經(jīng)保護(hù)研究推薦意見(jiàn)[4]，這促使我們轉(zhuǎn)換思路，為研發(fā)有效腦保護(hù)藥物奠定基礎(chǔ)。

1 腦缺血后神經(jīng)單元（NCU）損傷和可能的損傷機(jī)制

NCU在缺血性腦損傷過(guò)程的作用及機(jī)制目前還沒(méi)有闡明，目前研究熱點(diǎn)主要集中以下幾個(gè)方面：（1）TJ結(jié)構(gòu)破壞。缺血缺氧引起內(nèi)皮細(xì)胞TJ相關(guān)蛋白的表達(dá)以及定位改變，導(dǎo)致腦微血管內(nèi)皮屏障功能下降。（2）蛋白質(zhì)磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)BBB通透性改變的調(diào)控。其中研究較多的是酪氨酸蛋白激酶（Protein Kinase C，PKC）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑。雖然相關(guān)的大量研究證實(shí)了這些信號(hào)通路參與到對(duì)TJ的調(diào)控，最終影響B(tài)BB的功能，然而具體的信號(hào)調(diào)控機(jī)制還沒(méi)有闡明。（3）炎癥和氧化應(yīng)激對(duì)BBB功能的破壞。腦缺血再灌注時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表達(dá)，促發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致炎性細(xì)胞粘附聚集和遷移，這是BBB損傷的基礎(chǔ)。炎性細(xì)胞聚集，產(chǎn)生大量的蛋白水解酶，特別是MMPs，導(dǎo)致血腦屏障的破壞。（4）星型膠質(zhì)細(xì)胞參與對(duì)BBB完整性的維持障礙。AQP4主要分布于星型膠質(zhì)細(xì)胞足突，是介導(dǎo)水進(jìn)入腦組織的最主要蛋白。腦缺血損傷后，AQP4表達(dá)升高，水通道開(kāi)放，大量水分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)形成細(xì)胞內(nèi)水腫，引起血腦屏障破壞。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38 MAPK信號(hào)通路參與對(duì)水通道蛋白4的調(diào)控。（5）近年研究表明，細(xì)胞凋亡在腦缺血中可能起主導(dǎo)作用，腦缺血損傷后缺血半暗帶產(chǎn)生的主要病理生理機(jī)制之一是細(xì)胞凋亡，線粒體結(jié)構(gòu)和功能改變?cè)诩?xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用[18]。腦缺血后NCU和BBB損傷的線粒體細(xì)胞凋亡信號(hào)通路是目前關(guān)注的熱點(diǎn)。

2 線粒體細(xì)胞凋亡信號(hào)通路在NCU 損傷中的作用

線粒體作為細(xì)胞生物氧化和能量轉(zhuǎn)換的主要場(chǎng)所，線粒體的結(jié)構(gòu)、功能異常與腦缺血再灌注損傷發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。腦缺血后注線粒體功能障礙的機(jī)制涉及氧自由基損傷、鈣超載、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔( mitochondrial prmeability transition pore，MPTP) 的異常開(kāi)放、線粒體結(jié)構(gòu)損傷等。（1）線粒體超微結(jié)構(gòu)改變。表現(xiàn)為線粒體內(nèi)膜結(jié)構(gòu)及線粒體嵴結(jié)構(gòu)的改變：線粒體腫脹、分解、消失、胞質(zhì)密度增加。（2）線粒體產(chǎn)生自由基功能的改變。自由基被認(rèn)為主要產(chǎn)于線粒體, 正常情況線粒體氧自由基水平較低, 缺血時(shí)其水平就會(huì)升高，活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）增高。（3）線粒體呼吸鏈酶和ATP酶活性的變化。線粒體內(nèi)膜有按一定順序排列的酶和輔酶，其中酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組成呼吸鏈。呼吸鏈中的酶復(fù)合體易受到缺氧影響，直接影響了ATP 的生成。（4）線粒體膜電位的變化。缺血/再灌注時(shí)的各種有害刺激，如缺氧、線粒體內(nèi)Ca2+增加，都可造成MPTP 開(kāi)放，從而引起線粒體膜電位下降，甚至消失，呼吸鏈斷裂造成細(xì)胞死亡[19]。（5）線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的改變。線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C(cytochrome C，CytC)是核DNA編碼的蛋白質(zhì)，是線粒體電子傳遞中復(fù)合體Ⅲ和Ⅳ之間傳遞電子的載體，腦缺血時(shí)CytC的釋放可啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。（6）線粒體DNA及其表達(dá)的改變。線粒體DNA(mtDNA)是氧化磷酸化系統(tǒng)重要酶系的前體物質(zhì)。mtDNA 的損傷則可引起氧化磷酸化酶功能的改變，還可加速細(xì)胞凋亡的發(fā)生。（7）腦缺血后細(xì)胞能量代謝的恢復(fù)是細(xì)胞其他功能恢復(fù)的基礎(chǔ)，若細(xì)胞能量代謝障礙持續(xù)存在，則必然導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死，而線粒體在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要作用[20]。腦缺血線粒體損傷可能從以下幾方面誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：A.線粒體CytC不僅在能量代謝中發(fā)揮著重要作用，且其由線粒體內(nèi)釋放入胞質(zhì)，是啟動(dòng)依賴(lài)CytC和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinylaspartatespecificproteinase，caspase）途徑細(xì)胞凋亡的重要步驟；B.線粒體損傷，ATP生成減少，細(xì)胞功能障礙；C.線粒體損傷，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，自由基產(chǎn)生增多，導(dǎo)致mtDNA的損傷、細(xì)胞膜損傷；D.線粒體內(nèi)膜的MPTP的開(kāi)放形成了線粒體通透性轉(zhuǎn)變( mitochondrial permeability transition，MPT) ，MPT是細(xì)胞損傷引起凋亡或壞死的共同通路[21]。腦缺血線粒體損傷結(jié)果引起前-凋亡蛋白Bax的活化，該蛋白誘導(dǎo)線粒體釋放CytC，形成凋亡小體，啟動(dòng)caspase-9的活化，之后死亡執(zhí)行因子caspase-3和caspase-7被活化，通過(guò)蛋白水解酶使細(xì)胞崩潰，導(dǎo)致BBB和NCU的損傷。在這通路中B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）等抗凋亡蛋白、凋亡抑制因子以及JNK/p38MAPK信號(hào)通路參與了線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的調(diào)控[18]。

2.1 花生四烯酸代謝通路

花生四烯酸（arachidonic acid，AA）是人體內(nèi)心腦血管活性物質(zhì)的前體，其代謝產(chǎn)物與腦血管病的發(fā)病密切相關(guān)[5]。AA的細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP)代謝通路是近年研究的熱點(diǎn)[6]。AA在CYP羥化酶作用下生成羥基二十碳四烯酸（hydroxyeicosatetraenoic acid，HETEs）,在CYP表氧化酶作用下生成環(huán)氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acid，EETs），EETs再經(jīng)過(guò)可溶性環(huán)氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase,sEH）作用下生成生物活性較弱的二羥基二十碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acid，DHETs)。HETEs具有強(qiáng)力的腦血管收縮作用和促動(dòng)脈粥樣硬化作用。而EETs具有擴(kuò)血管、調(diào)節(jié)離子通道、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種生物學(xué)功能，對(duì)心腦血管具有保護(hù)作用。近期臨床研究發(fā)現(xiàn)，AA的CYP代謝通路代謝產(chǎn)物（EETs和HETEs）水平與急性缺血性卒中后神經(jīng)功能惡化密切相關(guān)[7，8]，提示它們?cè)谀X缺血性損傷中可能發(fā)揮重要作用?？扇苄原h(huán)氧化物水解酶（sEH）是調(diào)控EETs的關(guān)鍵限速酶。外周血EETs降低不僅與缺血性卒中后神經(jīng)功能惡化密切相關(guān)，還與腦梗死患者頸動(dòng)脈狹窄程度和斑塊不穩(wěn)定密切相關(guān)，并受編碼sEH基因（epoxide hydrolase 2，EPHX2）的調(diào)控[8，9,10,11]。實(shí)驗(yàn)研究也表明[12]，EPHX2基因敲除可增加動(dòng)脈中動(dòng)脈阻塞模型大鼠腦血流量，減少梗死體積，對(duì)腦缺血具有保護(hù)作用，sEH被認(rèn)為是缺血性卒中防治的新靶點(diǎn)。1-三氟甲氧基苯基-3(1-丙酰哌啶-4-基)脲[1-trifluoromethoxyphenyl-3-(1-propionyl-piperidin-4-yl)urea,TPPU]是2012年由加利福尼亞大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院分子生物科學(xué)中心Bruce教授等合成的一種新型sEH抑制劑[13]。TPPU分子量為359.3，容易透過(guò)血腦屏障與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的sEH結(jié)合，抑制sEH活性。猴體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)表明[14]，與傳統(tǒng)sEH抑制劑相比TPPU表觀分布容積和濃度-時(shí)間曲線下面積大，生物利用度高，半衰期長(zhǎng)，每日1次即能夠維持有效血藥濃度，可逆、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制sEH電流，解離速度快，不會(huì)明顯蓄積而影響正常的神經(jīng)突觸傳導(dǎo),動(dòng)物耐受性好。TPPU在多種動(dòng)物模型中顯示其在抗炎和心、腎保護(hù)方面均優(yōu)于傳統(tǒng)sEH抑制劑[13]。心臟動(dòng)物模型研究也表明[15]，TPPU可預(yù)防心肌梗死后心肌纖維化，具有抗凋亡、抗氧化、保護(hù)線粒體等多種功能。

2.2 sEH 抑制劑對(duì)腦缺血保護(hù)的研究歷程

針對(duì)sEH的神經(jīng)保護(hù)是近年關(guān)注的熱點(diǎn)，雖然EPHX2基因敲除對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血有保護(hù)作用，但EPHX2基因敲除要用于臨床預(yù)防和治療缺血性卒中還相當(dāng)遙遠(yuǎn)，因此sEH抑制劑研發(fā)倍受關(guān)注。2005年將sEH抑制劑12-(3-金剛烷-1-基脲基)-十二烷酸 [12-(3-adamantan-1-yl-ureido) dodecanoic acid，AUDA]應(yīng)用在腦缺血神經(jīng)保護(hù)實(shí)驗(yàn)研究中，證實(shí)其對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血有保護(hù)作用[17]。2007年又證實(shí)了另一種sEH抑制劑轉(zhuǎn)-4[4-(3-金剛烷-1-基脲基)-環(huán)己氧基]-苯甲酸[trans-4-[4-(3-adamantan-1-ylureido)-cyclohexyloxy]-bensoic acid, t-AUCB]能夠改善腦血流，對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血有保護(hù)作用。AUDA和t-AUCB通過(guò)抗凋亡、抗氧化、抗炎、抑制[Ca2+]內(nèi)流、線粒體保護(hù)、拮抗N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-Methyl-D-Aspartate Receptor, NMDAR)介導(dǎo)的興奮毒性等多種機(jī)制發(fā)揮腦保護(hù)作用[18]。但這兩種傳統(tǒng)sEH抑制劑從胃腸道吸收差，生物利用度低，要達(dá)到有效血藥濃度所用的藥物劑量必須夠大，藥物易在體內(nèi)蓄積，副作用較大，動(dòng)物耐受性差，同時(shí)發(fā)現(xiàn)這些傳統(tǒng)的sEH抑制劑半衰期短，體內(nèi)血藥濃度不穩(wěn)定，這些原因?qū)е聜鹘y(tǒng)sEH抑制劑臨床轉(zhuǎn)化的失敗。

3 TPPU 對(duì)腦缺血保護(hù)的研究現(xiàn)狀

TPPU是2012年由加利福尼亞大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院分子生物科學(xué)中心Bruce教授等合成的一種新型sEH抑制劑，分子量小，容易透過(guò)血腦屏障，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的sEH結(jié)合，抑制sEH活性[16]。TPPU口服生物利用度高，半衰期長(zhǎng)，動(dòng)物耐受性好[19]。是一種非常有希望轉(zhuǎn)化到臨床上使用的新型神經(jīng)保護(hù)劑。TPPU在多種炎癥動(dòng)物模型中顯示其在抗炎和心、腎保護(hù)方面均優(yōu)于傳統(tǒng)sEH抑制劑[13]。心臟動(dòng)脈模型研究表明[15]，TPPU可預(yù)防心肌梗死后心肌纖維化，通過(guò)抗凋亡、抗氧化、保護(hù)線粒體等多種功能發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

4 總結(jié)

目前，TPPU對(duì)于腦缺血保護(hù)的具體機(jī)制尚未研究清楚，需更多的基礎(chǔ)研究進(jìn)行證實(shí)。相關(guān)通路一旦研究透徹，相信會(huì)給腦卒中治療帶來(lái)新的曙光。