耐碳青霉烯類肺炎克雷伯桿菌耐藥機制的研究進(jìn)展

詹旭莉 湯建華

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，張家口，075000，中國

隨著 20 世紀(jì)30 年代磺胺類藥物的臨床應(yīng)用，開啟了抗微生物治療的新時代，抗生素成為治療細(xì)菌感染的有效武器。當(dāng)細(xì)菌接觸到抗菌藥物，會自發(fā)地改變自身代謝途徑或產(chǎn)生相應(yīng)的滅活物質(zhì)抵抗抗菌藥物，從而產(chǎn)生耐藥性。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯桿菌為革蘭氏陰性菌，常位于人體上呼吸道和腸道，引起呼吸道感染、尿路感染和血流感染［1］，是引起醫(yī)院獲得性肺炎的一個原因，且引起感染的多樣性和流行病學(xué)發(fā)生的巨大變化，給臨床治療與預(yù)后帶來困難，是臨床分離和醫(yī)院感染的重要致病菌之一。自2009 年在印度發(fā)現(xiàn)產(chǎn)Ⅰ型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）（被稱為超級細(xì)菌）至今，美國、德國、日本、澳洲等多個國家和地區(qū)已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該種超級耐藥細(xì)菌，呈全球蔓延趨勢［2-4］。我國“全國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)”的數(shù)據(jù)表明，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯桿菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）檢出率也呈逐年上升趨勢，從2014 年6.4% 上升至2019 年10.9%［5］。其中河南省的CRKP 的檢出率最高，為53.01%，上海、浙江、江蘇、湖北、山西各地檢出率達(dá)30%以上，現(xiàn)狀不容樂觀［6］。因此，了解CRKP 的耐藥機制對于今后指導(dǎo)臨床合理用藥越來越重要［7］。

目前臨床上使用的抗菌藥物，主要包括β-內(nèi)酰胺類抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類及林可霉素類抗生素、氨基糖苷類及多肽類抗生素、四環(huán)素類及氯霉素類抗生素、人工合成類抗生素，均在提高患者生存率、緩解癥狀和改善生活質(zhì)量方面發(fā)揮了巨大作用。然而，近年來隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，碳青霉烯類耐藥腸桿菌對藥物產(chǎn)生的耐藥性也逐年上升。Pulzova 等的研究結(jié)果揭示該菌的耐藥機制有很多，包括產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，ESBLs）、由孔蛋白丟失導(dǎo)致的細(xì)菌外膜滲透性改變、主動外排系統(tǒng)表達(dá)活躍、產(chǎn)生生物被膜等［8］?，F(xiàn)就CRKP 的耐藥作用機制分類進(jìn)行闡述。

1 產(chǎn)碳青霉烯酶

碳青霉烯酶是指能夠明顯水解亞胺培南或美羅培南的一類β內(nèi)酰胺酶，根據(jù)Ambler 分子分類可分為A、B、D 的3 類酶，包括陰溝腸桿菌、黏質(zhì)沙雷菌中由染色體介導(dǎo)的NMC、SME、IMI 酶，以及肺炎克雷伯菌中質(zhì)粒介導(dǎo)的KPC 酶、銅綠假單胞菌中GES 酶，居泉沙雷菌的SFC 酶。KP 主要產(chǎn)生被稱為 A 類的絲氨酸酶［9］，介導(dǎo)高水平耐藥。B 類酶常見的酶型有IMP、VIM、GIM、SPM、SIM、NDM 等。OXA-48 是D 類酶檢出最多的一種，其活性部位具有絲氨酸結(jié)構(gòu)，對亞胺培南的水解能力很強，比OXA-23、OXA-24、OXA-58等其他OXA 型酶高10 倍，同時攜帶OXA-48 及其他碳青霉烯酶的KP 表現(xiàn)出更高的耐藥水平［10］。此外，碳青霉烯酶通常與許多其他耐藥決定因素相關(guān)，導(dǎo)致多重耐藥。

1.1 A 類碳青霉烯酶

A 類碳青霉烯酶以絲氨酸殘基為活性位點，其中KPC 酶與CRKP 耐藥性密切相關(guān)，產(chǎn)KPC 酶的細(xì)菌對青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類等多種抗生素耐藥，是目前腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類藥物耐藥的主要機制。已發(fā)現(xiàn)的KPC 包括KPC-1 至KPC-19 在內(nèi)的19 種KPC，其中以KPC-2 和KPC-3 最為常見，能夠水解除氨曲南以外的幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗生素［11］，推動了大流行性醫(yī)院暴發(fā)性克隆肺炎克雷伯菌ST258的傳播［12］。雖然KPC 酶只能引起KP 對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥，但有研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生KPC 酶的KP 可能存在異質(zhì)性耐藥。在抗菌藥物的選擇性壓力下，可快速誘導(dǎo)高水平碳青霉烯耐藥性，其高水平耐藥與抗菌藥物篩選出膜孔蛋白基因OmpK36 缺乏的菌株后協(xié)同KPC 有關(guān)［13］。同時KPC 基因能夠憑借質(zhì)粒傳播，使其在不同菌株和菌種間擴(kuò)散，降低抗感染治療的成功率。為了避免廣譜抗生素的過度使用，仔細(xì)選擇可接受經(jīng)驗性治療的患者至關(guān)重要［14］。此外，在接受頭孢他啶-阿維巴坦治療的患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了耐藥突變體。產(chǎn)生KPC-2 或KPC-3 的KP 分離株在治療后10～19 天內(nèi)出現(xiàn)耐藥性，與KPC 酶（R164 至D179）的ω環(huán)突變有關(guān)［11，15］。最常見的突變是氨基酸位置179（D179Y）的天冬氨酸被酪氨酸取代［16］。這些突變導(dǎo)致頭孢他啶水解增強，而阿維巴坦完全抑制這種水解，導(dǎo)致對碳青霉烯類抗菌藥物的敏感性下降。另外KPC 陽性的KP 外膜通透性降低，使其對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥程度增強。但Tolentino 等人的研究報道KPC 可與其他耐藥基因共同存在同一株細(xì)菌而產(chǎn)生高水平耐藥，所以需結(jié)合檢測菌株的遺傳背景進(jìn)行耐藥分析［17］。

1.2 B 類碳青霉烯酶

B 類碳青霉烯酶具有獨特的水解二價陽離子（最常見的是Zn2+）的機制，主要包括新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶（new delhi metallo-β-lactamase，NDM），碳青霉烯酶的IMP 系列，以及維羅納整合子編碼的金屬β-內(nèi)酰胺酶（VIM）。攜帶NDM-1 基因的細(xì)菌具有極強的耐藥性，對所有的抗菌藥物幾乎都有抗藥性。NDM-1 的活性位點具有特殊功能，其獨特的氨基酸殘基的立體折疊結(jié)構(gòu)能夠與碳青霉烯藥物獲得更加緊密的結(jié)合，使其耐藥性更強［18］。到2010 年，NDM-1 已在大腸桿菌的染色體內(nèi)被檢測到［19］，而且這種基因還有可能通過“基因水平轉(zhuǎn)移”這一機制在不同種類的細(xì)菌間傳遞，從而使得其他細(xì)菌也可以獲得這種基因，產(chǎn)生相同的耐藥性［20］。這些酶水解多種β-內(nèi)酰胺類抗生素，但不能水解單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素，如氨曲南。

我們發(fā)現(xiàn)所有NDM-1 基因都可以通過轉(zhuǎn)化和接合成功轉(zhuǎn)移，而KPC-2 基因的轉(zhuǎn)移僅通過接合。對這一發(fā)現(xiàn)最合理的解釋是，NDM-1 攜帶可自我傳播的IncA/C 或IncP 質(zhì)粒，而KPC-2 位于非自我傳播的質(zhì)粒上或染色體上［21］。

1.3 D 類碳青霉烯酶

D 類為青霉素酶，對青霉素的水解效率很高，但對碳青霉烯類的水解能力較弱，且不含廣譜頭孢菌素，其中 OXA-48 與碳青霉烯類耐藥密切相關(guān)。目前為止，在非洲、中東和歐洲，特別是在地中海地區(qū)，已經(jīng)清楚地記錄了含OXA-48 的病原體的逐漸擴(kuò)散對世界其他地方是一個巨大的威脅［22］，且報道逐漸增多。據(jù)報道，在2014～2015 年期間，這些菌株在土耳其的數(shù)量很多［23］。92%的腸桿菌科耐藥是由OXA-48 引起的?？赡苁怯捎诋a(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株活化或改變了 OXA-48 的表達(dá)，產(chǎn) OXA-48 菌株對碳青霉烯類藥物的敏感性降低，也可能是由于外膜通透性降低，從而對碳青霉烯類藥物具有一定的水解活性［24］。OXA-48 基因的傳播主要與62 kb 的單個IncL/M 型自轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的傳播有關(guān)［25］。單獨的OXA-48 樣碳青霉烯酶可誘導(dǎo)較弱的青霉素和碳青霉烯水解，但不會誘導(dǎo)頭孢菌素。因此，它們可能更難檢測，并被稱為“幻影威脅”。當(dāng)發(fā)現(xiàn)這些酶與其他β-內(nèi)酰胺酶（如ESBL）結(jié)合使用或當(dāng)孔蛋白變化導(dǎo)致通透性降低時，可能發(fā)生高水平的碳青霉烯抗性。

2 外膜孔蛋白的缺失

外膜孔蛋白是一種存在于革蘭陰性菌細(xì)胞外膜的脂多糖層上的水溶性擴(kuò)散通道，主要包括OmpK35、OmpK36?？股乜赏ㄟ^這些孔道進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)發(fā)揮抗菌作用。染色體上主要外膜孔蛋白OmpK35 和OmpK36 的修飾可降低外膜對藥物的滲透性，限制了作用于CRKP 的抗生素透過外膜的流入［26］。這是通過插入胞嘧啶核苷酸推斷出來的，這會導(dǎo)致翻譯移碼，從而在第89 位密碼子截斷蛋白質(zhì)。外膜孔蛋白缺陷降低了對β-內(nèi)酰胺類藥物的敏感性，并與β-內(nèi)酰胺酶結(jié)合，抗生素?zé)o法通過這些孔道進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)，進(jìn)而降低了抗菌藥物的敏感性，從而出現(xiàn)耐藥性［27］。OmpK36孔蛋白的缺失會顯著影響KP 的代謝適應(yīng)性，較慢的生長速度可能會使其更容易被免疫系統(tǒng)在體內(nèi)消除［28］。

Turner 等的研究表明，在感染期間，OmpK36 主要在炎癥反應(yīng)中起作用［29］。遺傳多態(tài)性顯示KP 分離株可分為4（A、B、C 及D 型）個主要的OmpK36 孔蛋白變異體［30］。并且，在這4 種分型中，C 型分離株比非C組分離株具有更高的高粘血癥發(fā)生率，因此C 組最有可能與黏液樣分離株相關(guān)，主要包括莢膜血清型為K1、K2 和K5 分離株，以及大多數(shù)K57 分離株。然而K20血清型在OmpK36 非C 組分離株中比在OmpK36 C組分離株中更普遍［28］。OmpK36 C 組分離株對幾乎所有抗菌藥物的耐藥率明顯低于OmpK36 組非C 組分離株。

3 外排泵作用的增強

外排泵存在于幾乎所有的細(xì)菌的染色體上，并且通過促進(jìn)位點突變和改變膜的通透性，降低細(xì)胞內(nèi)抗生素濃度進(jìn)而產(chǎn)生耐藥［31］。外排泵系統(tǒng)的表達(dá)是該菌產(chǎn)生耐藥性的重要機制之一。目前為止，發(fā)現(xiàn)7 類細(xì)菌藥物外排泵［32］。Sheng 等的研究報告表明，外排泵的表達(dá)增加，例如AcrAB 和OqxAB 在替加環(huán)素治療KP 的抗性機制中發(fā)揮重要作用［33］。已證實AcrAB外排泵受RamA 和SoxS 調(diào)節(jié)，OqxAB 受RamA 和RarA 調(diào)節(jié)，KP 的外膜蛋白TolC 受所有這些調(diào)節(jié)物控制［34］。

3.1 AcrAB-TolC 外排泵

AcrAB-TolC 復(fù)合體主要由外膜通道蛋白TolC、內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白AcrB 和膜融合蛋白AcrA 組成［35］。有研究報告證實，轉(zhuǎn)運蛋白能從細(xì)胞周質(zhì)或者從細(xì)胞質(zhì)膜外層直接捕獲底物，融合蛋白通過連接外層通道和內(nèi)層泵進(jìn)行外排［36］，當(dāng)細(xì)菌中轉(zhuǎn)運蛋白過量表達(dá)時，細(xì)菌就會通過物質(zhì)轉(zhuǎn)運泵將抗生素排出。其中AcrABTolC 系統(tǒng)與青霉素和頭孢菌素等β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性有關(guān)，AcrAB 外排泵的過度表達(dá)是導(dǎo)致某些菌株對抗生素敏感性下降的原因［37］，如厄他培南和美羅培南。AcrAB 能夠識別多種底物（喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素和β內(nèi)酰胺類等多種抗菌藥物），這些抗生素與TolC 結(jié)合可增強細(xì)菌對抗生素的外排作用［38］。

AcrAB-TolC 泵可由RamA、SoxS、RarA 等基因激活。RamA 是AcrAB-TolC 外排泵轉(zhuǎn)運蛋白的激活劑，通過調(diào)節(jié)外排泵以增強KP 對β-內(nèi)酰胺類藥物的抗性，其過表達(dá)還能導(dǎo)致靶位點的突變或孔蛋白的丟失以致KP 產(chǎn)生耐藥［39］。RamA 不僅可以降低KP 對替加環(huán)素的敏感性，還能促進(jìn)AcrA 過表達(dá)以增強對氟喹諾酮的耐藥性［40］。與RamA 一樣，SoxS 的過量表達(dá)與編碼外排泵AcrAB 基因的轉(zhuǎn)錄水平增加有關(guān)，從而提高對頭孢西丁、喹諾酮類藥物和氯霉素的耐藥性［34］。RarA 通過上調(diào)AcrAB、AcrCD 和AcrEF 外排泵和下調(diào)OmpF孔蛋白賦予肺炎克雷伯菌耐藥性。通過比較過量表達(dá)RamA、SoxS、RarA 這3 種調(diào)節(jié)因子對包膜通透性、外排泵和孔蛋白產(chǎn)生以及KP 的抗生素敏感性的相對影響，發(fā)現(xiàn)RamA 是KP 中最有效的包膜通透性調(diào)節(jié)劑，其次是RarA，最后是SoxS［34］。負(fù)向調(diào)節(jié)因子RamR、SoxR、AcrR 通過下調(diào)AcrAB 的表達(dá)以恢復(fù)KP 對藥物的敏感性。RamA 的阻遏基因RamR 參與了KP 中AcrAB 表達(dá)的調(diào)節(jié)，通過抑制AcrB 和RamA 的過度表達(dá)，恢復(fù)KP 對替加環(huán)素的敏感性［41］。而SoxR 基因能抑制SoxS 的過度表達(dá)，因此，RamR 和SoxR 基因調(diào)控KP 外排系統(tǒng)的表達(dá)［42］。導(dǎo)致AcrAB 外排系統(tǒng)過度表達(dá)的原因是AcrR 密碼子45 位氨基酸突變，精氨酸取代半胱氨酸，并導(dǎo)致多重耐藥［43］?？偟膩碚f，RamA、SoxS、RarA 參與了抗生素敏感性的改變，并導(dǎo)致新陳代謝和細(xì)菌適應(yīng)性的變化。

3.2 RamA-OqxAB 外排泵

RamA 是調(diào)節(jié)抗生素敏感性最重要的基因。OqxAB 是近幾年發(fā)現(xiàn)的KP 固有的一種較新的外排泵系統(tǒng)，對多種不同類別的底物都能表現(xiàn)出一定的外排作用［44］。OqxAB 基因的過度表達(dá)導(dǎo)致對多種藥物（喹諾酮、替加環(huán)素、呋喃妥因和氯霉素）、洗滌劑和消毒劑產(chǎn)生耐藥性［45］。RarA 的過表達(dá)可以上調(diào)其下游外排泵操縱子OqxAB 和AcrAB 的表達(dá)水平［46］。在KP 臨床分離株的OqxR 上發(fā)現(xiàn)的一個新的氨基酸替代物也能誘導(dǎo)OqxAB 和RarA 的高表達(dá)［47］。這種質(zhì)粒攜帶的多藥外排泵可能會造成耐藥性問題，因為它可能會促進(jìn)多種藥物的耐藥性發(fā)展，并通過水平轉(zhuǎn)移傳播耐藥性。

4 生物被膜

生物被膜是細(xì)菌附著在生物材料表面，由于過度生長而形成的細(xì)菌復(fù)合體，是非特異性細(xì)菌耐藥機制之一。主要成分包括細(xì)菌及其分泌的多糖基質(zhì)、脂蛋白等。CRKP 生物膜的發(fā)展經(jīng)歷了四個階段，分別是細(xì)胞的黏附、菌落的形成、成熟以及最終繁殖成為自由生存的細(xì)胞。參與形成過程最重要的表面結(jié)構(gòu)是Ⅲ型菌毛和莢膜多糖［48］。菌毛介導(dǎo)穩(wěn)定的黏附，而莢膜多糖最終影響生物膜的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間的通訊。生物膜形成的過程中，受到動力學(xué)和環(huán)境變化的刺激，細(xì)菌必須具有迅速而廣泛地改變基因表達(dá)的能力［48］。CRKP 的某些特定基因的突變也會影響生物膜的功能。Mostafavi等人發(fā)現(xiàn)fabZ 和IpxC 突變導(dǎo)致IpxC 抑制劑依賴的細(xì)菌生長，從而導(dǎo)致生物膜穩(wěn)態(tài)喪失［49］。Hsieh 等報道YfgL（BamB）脂蛋白參與CRKP 的生物膜形成過程和Ⅰ型菌毛的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，這對于體內(nèi)CRKP 的抗吞噬作用至關(guān)重要［50］。此外，Saurel 等的報道，發(fā)現(xiàn)CRKP 的外膜蛋白A（KpOmpA）參與細(xì)黏附和細(xì)胞間識別以及宿主的免疫反應(yīng)，且表面的L3 位點可能與CRKP 的致病性有關(guān)［51］。氧化應(yīng)激可能氧化并破壞CRKP 的生物膜，導(dǎo)致主要膜蛋白的缺失［52］。上述相關(guān)研究表明，CRKP 的生物膜是維持其活性的關(guān)鍵條件之一。

細(xì)菌一旦形成生物被膜，則會增加活菌對機體的免疫并產(chǎn)生抗生素耐藥，這直接提升了膜內(nèi)細(xì)菌的存活率。CRKP 的生物被膜只有氨芐西林和環(huán)丙沙星兩種抗菌藥物能通過，碳青霉烯類抗菌藥物通透性差。對CRKP 浮游菌和生物被膜細(xì)菌同時進(jìn)行滅菌，最終細(xì)菌消滅率分別為91%～93.5%和25%～26%。

5 結(jié)論

綜上所述，CRKP 因具有多種基因結(jié)構(gòu)和復(fù)雜的耐藥機制而在全球范圍內(nèi)廣泛傳播并呈增加趨勢。耐藥基因可通過細(xì)菌間的質(zhì)?；蛉旧w進(jìn)行水平或垂直傳播，大大增加了檢測的難度。因此需要臨床微生物實驗室構(gòu)建成熟完備的耐藥基因檢測系統(tǒng)，以便及時準(zhǔn)確地反饋信息并制定合理的給藥方案。復(fù)雜的耐藥機制導(dǎo)致CRKP 對常用抗菌藥物產(chǎn)生廣泛耐藥，臨床常常面臨無藥可選的窘境。臨床治療藥品品種有限，上市的新藥頭孢他啶聯(lián)合阿維巴坦治療經(jīng)驗有限，治療費用昂貴，大部分人不可獲得，限制了其廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致該類細(xì)菌感染患者陷入無藥可用的困境。近年來，使用雙碳青霉烯類聯(lián)合治療CRKP 成為一個新的方向，其原理是利用一種碳青霉烯類藥物結(jié)合耐藥基因，另外一種碳青霉烯類藥物發(fā)揮抗菌作用。目前還處于基礎(chǔ)研究階段，已經(jīng)取得了一定成果。