豬源D型產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌毒素基因的原核表達(dá)

江 濤,譚春萍,任靈芝,黃百花,劉文娟,陸芹章*

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧530005;2.固始縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,河南固始465200)

產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌(Toxingenic Pasteurella multocida,T+Pm)是豬進(jìn)行性萎縮性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis,PAR)的主要病原之一[1-2]。該菌與支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)感染豬后損害其呼吸道,使機(jī)體抵抗力下降,并可繼發(fā)感染支原體、嗜血桿菌、豬流感病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒,增加了豬的病死率[3]。多殺性巴氏桿菌毒素(Pasteurella multocida toxin,PMT)為PAR的主要致病因子[4-6],由T+Pm toxA基因編碼的大小為146 ku的蛋白,是重要保護(hù)性抗原之一[7],也是鑒別T+Pm與非產(chǎn)毒素巴氏桿菌(Non-toxingenic Pasteurella multocida,T—PM)的主要對(duì)象,因而研究PMT對(duì)該病的臨床診斷及防控有重要意義。

目前對(duì)于PAR的防控主要是使用抗生素類藥物,但抗生素的使用導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生及其殘留,嚴(yán)重威脅到公眾的健康,因此研制PAR疫苗倍受關(guān)注[8-9]。天然毒素作為PAR的重要保護(hù)性抗原,但其分泌量低,不到菌體蛋白的0.6%,且蛋白的純化復(fù)雜,純類毒素與粗類毒素對(duì)機(jī)體的免疫效果存在差異。因此,本研究通過(guò)對(duì)該毒素基因的克隆表達(dá)及其免疫學(xué)特性的研究,可為臨床疫苗研制提供足量的高純度抗原及該毒素檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒、試劑及培養(yǎng)基 豬源D型產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定;大腸埃希菌DH5α、BL21(DE3)、PET-32a(+)表達(dá)載體購(gòu)自Novagen公司;PMD-18T克隆載體、酶、dNTPs、IPTG、Bam HⅠ及SalⅠ為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗豬IgG、氨芐青霉素為Sigma公司產(chǎn)品;膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒為上海華舜生物工程有限公司產(chǎn)品;Ni-NTA蛋白純化樹(shù)脂購(gòu)自QIAGEN公司產(chǎn)品;LB(Luria Bertani)培養(yǎng)基和LA培養(yǎng)基(LB+15 g/L瓊脂),篩選培養(yǎng)基為含100 μ g/mL氨芐的LA培養(yǎng)基,均由本室自制。1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 16 g～20 g昆明小鼠,購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank上公布的toxA序列AF240778及參考文獻(xiàn)[1]設(shè)計(jì)一對(duì)引物:toxA-F:5′-TAGGATCCATGAAAACAAAACATT TT T T-3′;toxA-R:5′-GCGTCGACT TATAGTGCTCT TGT TAAGC-3′

分別在toxA-F及toxA-R的5′端加入BamHⅠ及SalⅠ酶切位點(diǎn)如劃線部分所示,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 toxA基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建 將分離鑒定的產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌[10]擴(kuò)大培養(yǎng)后,按文獻(xiàn)[11]中的方法將菌體洗滌反復(fù)凍融后作為toxA基因擴(kuò)增模板。采用25 μ L的PCR反應(yīng)體系:10×Taq buffer 2.5 μ L,20 mmol/L MgCl2 2.5 μ L,2 μ mol/L dNTPs 0.5 μ L,20 μ mol/L上下游引物各0.5 μ L,Taq DNA polymerase 0.5 μ L,無(wú)菌水15 μ L,模板3 μ L。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94℃變性5 min;94℃,30 s,50℃,30 s,72℃3.5 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物,與pMD-18T連接后轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α,獲得重組質(zhì)粒PMD-toxA。經(jīng)測(cè)序和用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定后,回收3 858 bp的toxA片段。將回收的toxA片段和經(jīng)相同酶酶切后的pET-32a用T4 DNA連接酶連接,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α。將篩選陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后,提取重組質(zhì)粒PET-toxA,用BamHⅠ和SalⅠ酶切鑒定。

1.2.3 toxA基因原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的提取 將重組表達(dá)質(zhì)粒PET-toxA轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,挑取單個(gè)菌落,于37℃培養(yǎng)至OD630值達(dá)到0.6～0.8,加入IPTG至終濃度為1 mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)6 h,收集菌體。按常規(guī)方法提取包涵體,進(jìn)行80 g/L分離膠的SDS-PAGE分析。

1.2.4 重組蛋白的純化及Westen blot檢測(cè) 按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)》所述方法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物toxA進(jìn)行Western blot分析。用豬萎縮性鼻炎疫苗(含毒素)免疫的豬陽(yáng)性血清作為一抗,二抗為HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物的小鼠攻毒試驗(yàn) 利用Ni-NTA樹(shù)脂對(duì)1.2.3中處理包涵體蛋白進(jìn)行純化,并將純化后的重組蛋白復(fù)性,無(wú)菌PBS透析,濾膜過(guò)濾后備用。將30只昆明鼠分為6組,5只/組,其中Ⅰ～Ⅳ組按參考文獻(xiàn)[12]的攻毒劑量,用表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行腹腔注射攻毒,0.2 mL/只,Ⅴ組用抽提的天然毒素[10]進(jìn)行攻毒,Ⅵ注射無(wú)菌PBS作為陰性對(duì)照。觀察小鼠在72 h內(nèi)的臨床表現(xiàn)及其剖檢變化。

1.2.6 表達(dá)產(chǎn)物免疫原性檢測(cè) 將上述攻毒后存活且精神狀態(tài)恢復(fù)小鼠分別在攻毒后的第15天、28天以相同劑量的表達(dá)蛋白進(jìn)行腹腔注射免疫接種,在第40天采血,分離血清于—20℃保存?zhèn)溆?。將表達(dá)產(chǎn)物及天然毒素蛋白以1 μ g/點(diǎn)點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜上,置37℃吸附30 min后,于4℃封閉過(guò)夜,用PBST洗3遍后加入1∶200稀釋的上述小鼠陽(yáng)性血清及空白血清,并按Westen blot步驟進(jìn)行操作,觀察表達(dá)產(chǎn)物免疫后血清反應(yīng)原性。

1.2.7 表達(dá)產(chǎn)物對(duì)免疫血清的檢測(cè) 按照參考文獻(xiàn)[13]方法稍加改進(jìn)提純天然毒素,利用方陣滴定的方法確定天然毒素與表達(dá)重組蛋白的最佳包被濃度與陽(yáng)性血清的最佳稀釋度,兩種抗原按最佳濃度包被后,按間接ELISA的常規(guī)操作方法,對(duì)10份陽(yáng)性血清(瓊擴(kuò)效價(jià)達(dá)到1∶16～1∶32)及陰性血清進(jìn)行檢測(cè)。每份血清重復(fù)3次,求其OD450平均值作為試驗(yàn)結(jié)果,對(duì)比天然毒素與重組蛋白的差別。

2 結(jié)果

2.1 toxA基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增toxA片段約為3 858 bp與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。將目的片段插入到pET-32a的BamHⅠ和SalⅠ位點(diǎn),得到重組表達(dá)質(zhì)粒PET-toxA,其雙酶切鑒定結(jié)果如圖2所示,片段大小分別為3 858 bp和5 900 bp。

2.2 toxA基因的表達(dá)

將構(gòu)建的質(zhì)粒PET-toxA轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和SDS-PAGE分析,在175 ku處有明顯的表達(dá)條帶。表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜進(jìn)行Westen blot,結(jié)果表明,在175 ku左右出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶,對(duì)照菌未出現(xiàn)明顯條帶(圖3)。

2.3 動(dòng)物試驗(yàn)

試驗(yàn)小鼠攻毒后,Ⅰ組～Ⅳ組(攻毒用劑量分別為0.75、1.5、3、10 μ g)72 h內(nèi)未出現(xiàn)死亡,但攻毒小鼠均表現(xiàn)為精神沉郁,活動(dòng)量減少,第Ⅳ組表現(xiàn)最為嚴(yán)重,第Ⅰ組相對(duì)較輕;Ⅴ組在攻毒后的72 h內(nèi)全部死亡;Ⅵ組無(wú)任何臨床表現(xiàn),第Ⅴ組剖檢見(jiàn)內(nèi)臟有小點(diǎn)出血,肝、脾表面有半透明的假膜。剖檢存活小鼠發(fā)現(xiàn):第Ⅵ組無(wú)可見(jiàn)病變;第Ⅰ組～Ⅳ組,肝、腎、心外膜及內(nèi)膜均有出血點(diǎn),脾臟較第Ⅵ組小,但無(wú)假膜出現(xiàn)。

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性

待攻毒小鼠恢愎正常精神狀態(tài)后,對(duì)第Ⅳ組小鼠兩次用10 μ g表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行腹腔注射,取血清進(jìn)行Dot-ELISA鑒定,結(jié)果表明該陽(yáng)性血清均與天然毒素蛋白及表達(dá)重組蛋白反應(yīng),對(duì)照血清無(wú)可見(jiàn)反應(yīng)(圖4)。

圖1 PCR擴(kuò)增毒素基因Fig.1 Amplified the gene of Pasteurella multicoda toxA by PCR

圖2 重組質(zhì)粒(PET-toxA)的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant PET-toxA plasmid by digestion

圖3 重組質(zhì)粒PET-toxA的表達(dá)產(chǎn)物的Westen blot(A)及SDS-PAGE(B)結(jié)果Fig.3 Westenen blot(A)and SDS-PAGE(B)results of PET-toxA ex pression products

圖4 重組蛋白的免疫原性鑒定Fig.4 The identification of antigenicity of recombinant protein

2.5 表達(dá)產(chǎn)物對(duì)免疫血清的檢測(cè)

根據(jù)棋盤滴定的結(jié)果,天然毒素與表達(dá)蛋白的最佳包被濃度為1.25 μ g/mL和0.6 μ g/mL,血清的最佳稀釋度為1∶200。在血清檢測(cè)結(jié)果(表1)中,天然毒素抗原檢測(cè)OD450值顯著高于重組蛋白,P/N值二者無(wú)明顯差異;陰性血清檢測(cè)OD450值也高于表達(dá)蛋白,說(shuō)明表達(dá)蛋白非特異性較高。

表1 表達(dá)產(chǎn)物對(duì)免疫血清的檢測(cè)結(jié)果Table 1 The results of detect to antiserum against native PMD using expression products

3 討論

PMT是PAR的重要的保護(hù)性抗原,以PMT制作的疫苗能夠產(chǎn)生特異性的保護(hù)。因此PMT疫苗的研究對(duì)實(shí)際生產(chǎn)有著重要的意義。但由于菌體免疫效果不理想,天然毒素在菌體的含量較低,大量提純的難度及費(fèi)用較高,因此用天然PMT生產(chǎn)疫苗是不現(xiàn)實(shí)的。為解決上述難題,人們通過(guò)對(duì)PMT亞單位疫苗及核酸疫苗的研究取得了一定的成果,因此,這兩種疫苗的研究在AR的防控中是極具前景的疫苗。

本研究成功地?cái)U(kuò)增出豬源D型產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿毒素toxA基因,并對(duì)其進(jìn)行表達(dá)。攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明,表達(dá)重組蛋白具有一定的生物學(xué)活性,能夠引起小鼠的病變,但無(wú)天然蛋白活性強(qiáng)。可能是表達(dá)蛋白的構(gòu)象并未達(dá)到天然蛋白那樣完美使其毒性存在差別,或者是表達(dá)蛋白本身所帶載體部分的蛋白抑制其生物學(xué)特性,這還需要進(jìn)一步的探討驗(yàn)證。Western blot分析及重組蛋白免疫小鼠動(dòng)物試驗(yàn)表明,重組蛋白具有免疫原性及反應(yīng)原性,為臨床應(yīng)用疫苗的研制及利用抗原抗體結(jié)合方法檢測(cè)毒素奠定了基礎(chǔ)。Asuka T I等[14]利用DEAE親和層析方法純化重組蛋白,檢測(cè)疫苗免疫血清已取得了較好的檢測(cè)效果。本研究的檢測(cè)結(jié)果表明,重組蛋白的OD450值較低,可能是因?yàn)楸磉_(dá)蛋白與天然蛋白的空間構(gòu)象差異所致,但其作為檢測(cè)用抗原非特異性反應(yīng)弱。表達(dá)蛋白能否用于臨床檢測(cè)血清中的抗體,仍需對(duì)其表達(dá)的條件進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。

[1] Ackermann M R,Register K B,Stabel J R,et al.Effect of Pasteurella multocida toxin on phy seal growth in young pigs[J].Am J Vet Res,1996,57(6):848-852.

[2] Lax AJ,Chanter N.Cloning of the toxin gene from Pasteurella multocida and its role in atrophic rhinitis[J].J Gen Microbiol,1990,136:81-87.

[3] 斯特勞.豬病學(xué)[M].8版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2002:370-388.

[4] Kim T J,Lee J I,Lee B J.Development of a toxA gene knockout mutant of Pasteurella multocida and evaluation of its protective effects[J].Microbiology,2006,44(3):320-326.

[5] Foged N T,Nielsen J P,Jorsal S E.Protection against progressive atrophic rhinitis by vaccination with Pasteurella multocida toxin purified by monoclonal antibodies[J].Vet Rec,1989,124:57-61.

[6] Wilson B A,Ponferrada V G,Vallance J E,et al.Localization of the intracelluar activity domain of Pasteurella multocida toxin to the N terminus[J].Infect and Immune,1999,67(1):80-87.

[7] Foged N T.The characterisation of the toxin and Its significance in the diagnosis and prevention of progressive atrophic rhinitis in pigs[J].Apmis Supp l,1992,136(6):590-595.

[8] van Diemen P M,de Vries Reilingh G,Parmentier H K.Immune responses of piglets to Pasteurella multocida toxin and toxoid[J].Vet Immunol Immunopathol,1994,41(3-4):307-321.

[9] Sakano T,Okada M,T aneda A,M ukai T,Sato S.Effect of Bor detella bronchi septica and serotype D Pasteurel la multocida bacterin-tox oid on the occurrence of atrophic rhinitis after experimental infection with B.bronchiseptica and toxigenic type A P.multocida[J].J Vet Med Sci,1997,59(1):55-57.

[10] 梁 緩,王建林,馬 琳.豬萎縮性鼻炎病原的分離鑒定及其毒素的檢測(cè)[J].廣西畜牧獸醫(yī),2007,23(4):147-149.

[11] 孔繁德,徐淑菲,陳 瓊,等.沙門菌PCR快速檢測(cè)試劑盒的研制與應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2007,37(2):103-107.

[12] 王大鵬,吳 斌,周 銳,等.豬源D型產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌toxA基因的克隆與表達(dá)[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006,26(3):271-273.

[13] Naka T J,Sawata A,T suji M,et al.Purification of dermonecrotic toxin from a sonic extract of Pasteurella multocida SP-72 seroty pe D[J].Infect and Immune,1981,46:420-431.

[14] Asuka T I,T akehiko U,Tetsuya M,et al.Evaluation of an indirect enzyme-linked immunosorbent assary(Elisa)using recombinant toxin for detection of antibodies against Pasteurella multocida toxin[J].J Vet Med Sci,2007,69(6):581-586.