蘭 晶，任國強(qiáng)

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院北院 1.婦產(chǎn)科；2.病理科，上海 201907)

宮頸息肉(cervical polyps，CP)常位于子宮頸管內(nèi)，其發(fā)病率在育齡期婦女為2%～5%[1]。CP的病理表現(xiàn)是以纖維血管基質(zhì)為中心、表面上皮呈乳頭狀增生的組織[2]。無癥狀CP患者常在例行婦科檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)，有癥狀的CP患者常在月經(jīng)間期、性交后和/或絕經(jīng)后出現(xiàn)陰道內(nèi)出血。大規(guī)模的臨床研究顯示，CP為良性贅生物，但也有0.1%的惡變幾率[3]。CP發(fā)生的病理生理學(xué)機(jī)制目前尚不清楚，可能的機(jī)制包括慢性炎癥、激素刺激和/或子宮血管淤血等[3]。為了進(jìn)一步研究CP可能的發(fā)病機(jī)制及相應(yīng)的治療措施，我們課題組設(shè)計(jì)了本項(xiàng)研究，旨在探討Orai1蛋白在CP中的表達(dá)及該蛋白的體外干預(yù)對CP患者炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

收集復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院北院病理科2016年至2019年間證實(shí)為CP的組織標(biāo)本40例。CP組織在手術(shù)中直接獲取，而且所有標(biāo)本均經(jīng)資深病理醫(yī)師嚴(yán)格復(fù)檢。納入標(biāo)準(zhǔn)為26～61歲CP女性患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有淋病奈瑟菌感染、陰道滴蟲感染、沙眼衣原體感染、生殖器支原體感染、解脲支原體感染或惡性腫瘤病史者；孕婦、激素替代治療者、宮內(nèi)節(jié)育器使用者或口服避孕藥者。該研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理審查委員會(huì)認(rèn)可，所有患者術(shù)前均簽署了知情同意書。

1.2 CP組織體外培養(yǎng)

將CP組織以器官培養(yǎng)的方法進(jìn)行體外培養(yǎng)[4]。將獲取的息肉組織在無菌條件下分割成2～3mm3大小的組織塊，用含有5μg/mL兩性霉素B和300μg/mL青霉素G的磷酸鹽緩沖液清洗，再用含有10%小牛血清和20μg/mL慶大霉素的濃度為98%的達(dá)爾伯克(氏)必需基本培養(yǎng)基(Dulbecco’ s minimum essential medium，DMEM)再清洗，隨后加入50μmol/L 2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯(2-aminoethoxydiphenyl borate，2-APB)(美國Sigma-Aldrich)共孵育1h，接著將組織塊置于1cm×1cm大小的濕明膠海綿上，息肉面朝上，另一面朝下，將明膠海綿置于含有3mL培養(yǎng)液的6孔板上，使息肉高于液面，6孔板置入溫度為37°C和含有5%CO2空氣的潮濕孵育箱中，并進(jìn)行轉(zhuǎn)速為15rpm的連續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)24h，最后收集組織塊進(jìn)行下一步研究。見圖1。

注：A為組織培養(yǎng)，B為器官培養(yǎng)。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)染色(SP法)對CP組織中的Orai1蛋白的表達(dá)進(jìn)行了組織形態(tài)學(xué)評估。IHC染色可以將免疫反應(yīng)的特異性和組織化學(xué)的可見性相結(jié)合，對靶標(biāo)抗原進(jìn)行定性、定位，甚至定量檢測。所有標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛固定、脫水和常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片。一抗為Orai1單克隆抗體，購自美國Sigma公司，SP免疫組織化學(xué)即用型試劑盒購自美國Abcam公司，操作流程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果判定按照已發(fā)表文獻(xiàn)中所用方法[4]，Orai1蛋白定位于細(xì)胞膜，以出現(xiàn)棕黃色且染色強(qiáng)度高于背景非特異性著色者為陽性，染色面積評分為：0表示0%，1表示1%～10%，2表示11%～50%，3表示51%～100%；染色強(qiáng)度評分為：無染色(0)，弱陽性染色(1+)，中等強(qiáng)度陽性染色(2+)和強(qiáng)染色(3+)；染色面積和強(qiáng)度的評分乘積所得綜合分?jǐn)?shù)(1～9)為最終評分：1～3分為Orai1低表達(dá)，4～9分為Orai1高表達(dá)。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

為了進(jìn)一步確定Orai1蛋白及炎癥介質(zhì)白介素(interleukin，IL)-1β和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α在CP組織中的表達(dá)，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)對上述物質(zhì)進(jìn)行定量分析。ELISA是一種新型的免疫測定技術(shù)，用于定量檢測靶標(biāo)組織中的蛋白含量。Orai1 ELISA試劑盒、IL-1β試劑盒和TNF-α試劑盒均購自美國MyBioSource公司，操作流程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

CP組織中Orai1 mRNA、IL-1β mRNA和TNF-α mRNA的檢測采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)法。實(shí)時(shí)定量RT-PCR可以定量分析樣品中的靶標(biāo)物質(zhì)的mRNA含量。上述3種mRNA的引物均由上海捷蘭生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)。Orai1 mRNA上游引物：5′-CCCTTCGGCCTGATCTTTATC-3′，下游引物：5′-GGAACTGTCGGTCAGTCTTATG-3′；IL-1β mRNA上游引物：5′-ACAGATGAAGTGCTCCTTCCAG-3′，下游引物：5′-CAGCATCTTCCTCAGCTTGTC-3′；TNF-α mRNA上游引物：5′-CTAATCTCTCTCCAGGGACCC-3′，下游引物：5′-TCACTGTTCGGACATCGGGTA-3′；內(nèi)參β-actin mRNA上游引物：5′-CACTCTTCCAGCCTTCCTTC-3′，下游引物：5′-GTACAGGTCTTTGCGGATGT-3′，操作流程均按照實(shí)時(shí)定量RT-PCR試劑盒(日本Takara Bio公司)所規(guī)定的步驟進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用ΔCt法來表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，研究中所得數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)呈非正態(tài)分布，而樣本量又較小，因此采用非參數(shù)檢驗(yàn)的方法，如果數(shù)據(jù)經(jīng)Kruskal-Wallis法檢驗(yàn)有顯著差異，則用Mann-Whitney法對數(shù)據(jù)再進(jìn)行檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IHC染色的評估

本研究中IHC染色從組織形態(tài)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)Orai1蛋白陽性染色定位于鱗狀上皮細(xì)胞膜，干預(yù)前后CP組織中均呈現(xiàn)Orai1蛋白陽性染色表現(xiàn)，但干預(yù)前染色面積和強(qiáng)度更大，見圖2；以IHC進(jìn)行綜合評分，干預(yù)前CP染色評分均在4～9分，干預(yù)后評分均在1～3分，見表1。

表1 Orai1蛋白表達(dá)Table 1 Expression of Orai1 protein

注：A為干預(yù)前,B為干預(yù)后;箭頭表示陽性染色細(xì)胞(放大倍數(shù)400×)。

2.2 ELISA檢測結(jié)果

ELISA檢測結(jié)果顯示，與干預(yù)前相比，2-APB干預(yù)后CP中Orai1蛋白含量顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.76，P<0.05)，見圖3A；干預(yù)后，IL-1β和TNF-α的濃度顯著低于干預(yù)前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為15.28、6.35，均P<0.05)，見圖4A、圖4B。

2.3 實(shí)時(shí)定量RT-PCR的結(jié)果

實(shí)時(shí)定量RT-PCR的結(jié)果顯示，與干預(yù)前相比，2-APB干預(yù)后CP中Orai1 mRNA含量顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.85，P<0.05)，見圖3B；干預(yù)后，IL-1β mRNA、TNF-α mRNA濃度顯著低于干預(yù)前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為7.10、17.74，均P<0.05)，見圖4C和圖4D。

注：A為Orai1 ELISA檢測；B為Orai1 mRNA實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測;*P<0.05。

注：A為IL-1β ELISA檢測；B為TNF-α ELISA檢測；C為IL-1β mRNA實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測；D為TNF-α mRNA實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測;*P<0.05。圖4 IL-1β和TNF-α的ELISA和實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測Fig.4 Contents of IL-1β and TNF-α by ELISA and real-time quantitative RT-PCR

3 討論

3.1 CP的發(fā)病機(jī)制及臨床治療

CP多發(fā)于年齡在50歲左右的經(jīng)產(chǎn)婦[5]，大多患者沒有特殊癥狀，但一部分患者有月經(jīng)間期、性交后和絕經(jīng)后出血，極少數(shù)患者可能因息肉漸進(jìn)性增大而誘發(fā)臨床癥狀，比如子宮脫垂等[3]。CP的發(fā)病機(jī)制可能與慢性炎癥、激素刺激、局部反應(yīng)性增生、宮頸分泌性腺體導(dǎo)管阻塞或遺傳因素等有關(guān)[2]。MacKenzie等于2009年對1 366例CP患者進(jìn)行了為期4年的研究，發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)前期婦女患CP極少發(fā)生惡變，另外Younis等2010年研究發(fā)現(xiàn)CP患者的息肉常來源于子宮內(nèi)膜，而且首次活檢時(shí)病理表現(xiàn)為息肉的CP極少發(fā)生惡變，這些學(xué)者認(rèn)為CP患者是否進(jìn)行息肉的常規(guī)切除，并同時(shí)進(jìn)行子宮內(nèi)膜及子宮頸管取樣有待商榷，甚至認(rèn)為從衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)角度考慮是不可取的，應(yīng)該將手術(shù)切除和取樣等操作用于有癥狀的CP患者。但另外一些學(xué)者持相反觀點(diǎn)，Goldshmid等[6]認(rèn)為應(yīng)該對無癥狀的CP患者進(jìn)行前瞻性研究，Long等[7]認(rèn)為應(yīng)該對無癥狀的CP患者進(jìn)行常規(guī)息肉切除，Neri等(1995年)和Esim等[8]甚至認(rèn)為應(yīng)該對無癥狀的CP患者在施行息肉切除的同時(shí)進(jìn)行子宮頸管或子宮內(nèi)膜取樣。但有研究者認(rèn)為，對宮頸炎患者進(jìn)行宮頸癌篩查都會(huì)引起患者焦慮，如果取樣更容易導(dǎo)致患者恐懼[9]。但是對于CP的慢性炎癥機(jī)制及如何進(jìn)行炎癥方面的治療鮮有報(bào)道。因此我們課題組設(shè)計(jì)了本研究，旨在探討CP中炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制及Orai1的體外干預(yù)對CP炎癥反應(yīng)的作用。

3.2 鈣離子與Orai1蛋白

很多研究證實(shí)，Ca2+信號通路的異常與炎癥的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，鈣儲備調(diào)控性Ca2+流入(store-operated calcium entry，SOCE)是非興奮性細(xì)胞攝取Ca2+的主要方式[10]。Orai1分子是SOCE通道的關(guān)鍵組成部分，主要位于免疫系統(tǒng)細(xì)胞膜表面，也存在于其他類型細(xì)胞膜。SOCE通道是一種細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲備調(diào)控性Ca2+通道，它的激活可以使細(xì)胞外游離Ca2+大量內(nèi)流，上調(diào)胞質(zhì)內(nèi)游離Ca2+濃度，從而促進(jìn)各種細(xì)胞功能的進(jìn)行，比如細(xì)胞增殖、分化、脫顆粒及細(xì)胞因子的合成和分泌等[10]。該通道由Orai1及其變構(gòu)體Orai2、Orai3組成，其中Orai1為主要蛋白組分，它的變異和缺失對此通道影響最大[11]。

我們前期研究結(jié)果顯示正常宮頸組織中有Orai1蛋白的表達(dá)，CP組織中該蛋白表達(dá)上調(diào)，陽性染色主要是鱗狀上皮細(xì)胞(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)，但沒有進(jìn)行干預(yù)方面的研究，本研究中采用2-APB進(jìn)行干預(yù)，并對干預(yù)前后CP中Orai1蛋白的表達(dá)和息肉組織中炎癥因子的表達(dá)均進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。本研究選擇2-APB作為干預(yù)Orai1蛋白的方法，是因?yàn)槎囗?xiàng)研究證實(shí)，2-APB可以通過影響該蛋白的功能，來特異性地控制SOCE通道的活性，有效抑制鈣儲備調(diào)控性Ca2+內(nèi)流，從而調(diào)控靶細(xì)胞的功能[12]。

3.3 2-APB對CP的干預(yù)作用

本研究IHC染色顯示，Orai1蛋白陽性染色定位于鱗狀上皮細(xì)胞膜，干預(yù)前后息肉組織中均有Orai1蛋白的陽性表達(dá)，但干預(yù)前染色強(qiáng)度更大，染色面積也更廣，綜合評分表明，干預(yù)前CP染色評分均在4～9分，干預(yù)后評分均在1～3分，這樣的形態(tài)學(xué)方面研究結(jié)果(半定量)說明，2-APB對CP組織中鱗狀上皮Orai1蛋白的表達(dá)有抑制作用。接著又用ELISA法對CP中Orai1蛋白進(jìn)行了定量檢測，發(fā)現(xiàn)2-APB干預(yù)后CP中Orai1蛋白含量顯著減少，干預(yù)前后差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。慎重起見，我們對息肉組織中Orai1 mRNA也進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，相較于干預(yù)前，2-APB干預(yù)后CP中Orai1 mRNA含量顯著減少，干預(yù)前后差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，2-APB不僅能從蛋白水平影響Orai1的表達(dá)，也能從mRNA水平對該蛋白的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行抑制，其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CP中炎癥反應(yīng)的情況，我們也將標(biāo)本中炎癥介質(zhì)IL-1β和TNF-α的含量進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干預(yù)前這兩種炎癥介質(zhì)的濃度顯著高于干預(yù)后，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同樣我們也對標(biāo)本中IL-1β mRNA和TNF-α mRNA進(jìn)行了相應(yīng)的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干預(yù)后這兩種炎癥介質(zhì)的mRNA濃度顯著低于干預(yù)前，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這說明2-APB通過對鱗狀上皮中Orai1蛋白表達(dá)的抑制，影響了這些細(xì)胞對炎癥介質(zhì)IL-1β和TNF-α的合成和釋放，最終影響了CP組織中的炎癥反應(yīng)?？傊?，本研究表明，Orai1的體外干預(yù)對CP中的炎癥反應(yīng)有抑制作用。

有研究表明，特異性較高的Orai1蛋白阻滯劑2-APB可以緩解動(dòng)物模型的鼻黏膜中的變應(yīng)性炎癥[13-14]，可以抑制鼻息肉中的炎癥反應(yīng)[15]，本研究中也提示2-APB可以減輕CP組織中的炎癥反應(yīng)，因此可以設(shè)計(jì)類似2-APB的藥物對宮頸慢性炎癥(比如CP)進(jìn)行相應(yīng)干預(yù)，使其成為除了手術(shù)切除之外的另一種方法。