七葉一枝花根內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析及促生菌的篩選

張鵬，趙偉瓊，苗莉云，劉婷，樊仕鵬，姜仕林

(1 中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074；2 山西中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，晉中 030619)

內(nèi)生菌作為宿主植物的重要組成部分, 具有調(diào)節(jié)宿主體內(nèi)的微生態(tài)平衡[1]、抑制病原菌活性[2]、促進(jìn)植物生長(zhǎng)[1,3]和種子萌發(fā)[4]等作用，一些內(nèi)生菌還可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性物質(zhì)[5].

七葉一枝花(Parispolyphylla)，又名重樓，為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，是百合科(Liliaceae)重樓屬(ParisL.)植物的統(tǒng)稱，其根中含有的皂苷類化合物具有抗癌和消炎等活性[6]. 目前關(guān)于七葉一枝花內(nèi)生菌的研究主要集中在抑菌活性、生物活性和生物轉(zhuǎn)化等方面[7]，對(duì)于七葉一枝花內(nèi)生細(xì)菌的多樣性及其促生作用的研究較少. 本文通過(guò)對(duì)四川省代表性種植園的七葉一枝花的根部可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的分離和多樣性分析，初步揭示了該區(qū)域種植七葉一枝花根中的可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌多樣性及菌群組成，并采用與小麥幼苗人工共培養(yǎng)的方法，篩選獲得多株促生菌，為后期利用促生菌改良七葉一枝花的人工種植技術(shù)奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

五年生人工種植七葉一枝花采集于四川省綿陽(yáng)市安州區(qū)的七葉一枝花種植園. 內(nèi)生細(xì)菌分離培養(yǎng)采用LA培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，共培養(yǎng)選擇1/2 PDA培養(yǎng)基. T5 Super Plant and Microbial Mix購(gòu)自北京擎科，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自南京翼飛雪.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的分離與純化

方法參照本實(shí)驗(yàn)室的前期報(bào)道[4]. 簡(jiǎn)述：(1)稱取根0.1 g，削去根的外皮后，無(wú)菌水沖洗 1遍、1% NaClO溶液浸泡2 min、無(wú)菌水沖洗 3次、75%乙醇浸泡2 min、無(wú)菌水沖洗3次(2 min/次)的步驟進(jìn)行表面消毒. (2)加1 mL生理鹽水輕柔研磨成懸浮液，適度稀釋后涂布于LA培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，于26～28 ℃培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)期間將新長(zhǎng)出的細(xì)菌通過(guò)劃線法接種到新的LA培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，純化獲取細(xì)菌單克隆.

1.2.2 可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA的擴(kuò)增與測(cè)序

將根中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌分別用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取0.5 μL做模板，采用T5 Super Plant and Microbial Mix和16S rDNA通用引物[6]擴(kuò)增其16S rDNA. PCR擴(kuò)增程序：95 ℃、10 min；93 ℃、30 s，50 ℃、30 s，72 ℃、2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min. 對(duì)不能以菌液為模板擴(kuò)增出16S rDNA的菌株，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取其基因組DNA做模板，擴(kuò)增其16S rDNA序列. 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)武漢奧科鼎盛測(cè)序.

1.2.3 多樣性分析

測(cè)序結(jié)果通過(guò)Blast比對(duì)鑒定后，分析根中內(nèi)生細(xì)菌的菌群組成，并通過(guò)MEGA 10軟件以鄰接法(Neighbour-Joining)建立系統(tǒng)進(jìn)化樹.

1.2.4 促生菌的篩選

(1)取5 μL可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)液涂布于1/2 PDA培養(yǎng)基；(2)接入經(jīng)表面消毒處理后的小麥種子，共5個(gè)重復(fù)，于人工氣候培養(yǎng)箱中，28 ℃共培養(yǎng)7 d；空白對(duì)照不接種內(nèi)生細(xì)菌. (3)通過(guò)檢測(cè)小麥幼苗的存活情況、株高和根長(zhǎng)(均為10株的平均值)篩選促生菌. 將能夠使小麥幼苗株高增高30%、根長(zhǎng)增長(zhǎng)30%的菌株初步判定為能促進(jìn)小麥幼苗生長(zhǎng),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由SPSS23.0軟件處理和分析.

2 結(jié)果和分析

2.1 可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析

共分離得到210株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌. 通過(guò)16S rDNA序列的比對(duì)發(fā)現(xiàn)，210株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌可歸類到4個(gè)門：變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)，5個(gè)綱：γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、芽孢桿菌綱(Bacilli)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、黃桿菌綱(Flavobacteriia)和放線菌綱(Actinobacteria)，9個(gè)目：假單胞菌目(Pseudomonadales)、黃色單胞菌目(Xanthomonadales)、芽胞桿菌目(Bacillales)、腸桿菌目(Enterobacterales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、微球菌目(Micrococcales)、氣單胞菌目(Aeromonadales)、黃桿菌目(Flavobacteriales)和棒狀桿菌目(Corynebacteriales)，12個(gè)科：假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、芽孢桿菌科(Bacillaceae)、歐文菌科(Erwiniaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、氣單胞菌科(Aeromonadaceae)、黃桿菌科(Flavobacteriaceae)、棒狀桿菌科(Corynebacteriaceae)和微桿菌科(Microbacteriaceae)，18個(gè)屬.

在屬水平下的菌株分類情況如圖1和圖2，將豐度≥30%的屬歸為根中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)類群，其中占優(yōu)勢(shì)的屬為：假單胞菌屬(Pseudomonas，38.57%)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter，34.76%)，將豐度≤1%的屬歸為根中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的劣勢(shì)類群，包括勒克氏菌屬(Leclercia)、科薩克氏菌屬(Kosakonia)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、腸桿菌屬(Enterobacter)、根瘤菌屬(Rhizobium)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、微桿菌屬(Microbacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)，占比均為0.48%；節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、類節(jié)桿菌屬(Paenarthrobacter)、Lelliottia占比均為0.95%.

圖1 四川省種植七葉一枝花根中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的分類Fig.1 The classification of culturable endophytic bacteria in the roots of Paris polyphylla planted in Sichuan

圖2 四川省種植七葉一枝花根中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析Fig.2 Diversity analysis of culturable endophytic bacteria in the roots of Paris polyphylla planted in Sichuan

2.2 促生菌的篩選

將210株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌分別與小麥幼苗進(jìn)行共培養(yǎng). 共培養(yǎng)7 d后，發(fā)現(xiàn)與194株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌共培養(yǎng)的小麥幼苗均能正常生長(zhǎng). 通過(guò)對(duì)小麥幼苗的株高和根長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)量(圖3)，發(fā)現(xiàn)4株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌對(duì)小麥幼苗的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用. 4株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌分別歸類到假單胞菌屬菌株(SCR21024、SCR21025和SCR21047)和科薩克氏菌屬菌株SCR21043. 促生作用在小麥幼苗的株高和根長(zhǎng)的增加上都有體現(xiàn)(表1). 其中菌株SCR21024對(duì)小麥幼苗的株高和根長(zhǎng)的促進(jìn)作用最強(qiáng)，與對(duì)照相比，與其共培養(yǎng)的小麥幼苗的株高和根長(zhǎng)的增長(zhǎng)率達(dá)到了116.7%和135.5%. SCR21025菌株促生作用主要表現(xiàn)在促進(jìn)株高的增加，與其共培養(yǎng)的小麥幼苗的株高增長(zhǎng)率達(dá)到71.7%，而SCR21047和SCR21043菌株的促生作用主要表現(xiàn)在促進(jìn)根長(zhǎng)的增加，與其共培養(yǎng)的小麥幼苗的根長(zhǎng)增長(zhǎng)率分別達(dá)到59.5%和106.7%(表 1).

(a) 對(duì)照;(b)和(c)分別為與SCR21025和SCR21024菌株共培養(yǎng)的小麥幼苗圖3 四川省種植七葉一枝花根中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌與小麥共培養(yǎng)Fig.3 Co-culturation of wheat seedlings and culturable endophytic bacteria from the roots of Paris polyphylla planted in Sichuan

表1 可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌對(duì)小麥幼苗的促生長(zhǎng)作用Tab.1 Growth-promoting effect of culturable endophytic bacteria on wheat seedlings

3 討論

內(nèi)生菌對(duì)藥用植物的生長(zhǎng)、發(fā)育特性、藥材道地性、藥效物質(zhì)的形成和積累等具有重要意義[9,10]. 周先治等[11]從健康的人工種植華重樓植株中分離到的內(nèi)生細(xì)菌以芽孢桿菌屬為優(yōu)勢(shì)類群；廖秋紅等[13]從人工種植的6年生的滇重樓根狀莖中獲得包含寡養(yǎng)單胞菌屬在內(nèi)的9個(gè)屬的內(nèi)生細(xì)菌. 此外，前期實(shí)驗(yàn)室宋發(fā)軍等[13]采用相同的方法從湖北地區(qū)種植重樓根中分離得到115株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，歸類到12個(gè)屬，優(yōu)勢(shì)屬為短食單胞菌屬；耿紅等[14]采用相同的方法從云南地區(qū)種植的5年生重樓根中分離得到228株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，歸類到13個(gè)屬，優(yōu)勢(shì)屬為假單胞菌屬和芽孢桿菌屬. 本研究從四川地區(qū)種植的5年生七葉一枝花的0.1g根中分離得到210株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，歸類到18個(gè)屬，優(yōu)勢(shì)屬為假單胞菌屬和不動(dòng)桿菌屬. 從上述可以看出不同地區(qū)的種植重樓植株中內(nèi)生細(xì)菌的組成及優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬存在明顯的差異. 而本研究結(jié)果為深入分析不同生境對(duì)重樓植株中內(nèi)生細(xì)菌的多樣性的影響奠定了基礎(chǔ).

本研究分離的假單胞菌屬菌株SCR21024可以促進(jìn)小麥幼苗株高的增加和根的增長(zhǎng)，SCR21025主要促進(jìn)小麥幼苗株高的增加,SCR21047主要促進(jìn)小麥幼苗根的增長(zhǎng)；科薩克氏菌屬菌株SCR21043主要促進(jìn)小麥幼苗根的增長(zhǎng). 這表明同一個(gè)屬或不同屬的內(nèi)生細(xì)菌可能具有不同或相同的促生機(jī)理. 本文初步探究了這些促生菌對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的影響，為后期研究其對(duì)七葉一枝花幼苗生長(zhǎng)的作用及機(jī)制.