體外法研究乙酸發(fā)酵型脂肪酸組合對瘤胃細(xì)菌乙酸發(fā)酵的影響

習(xí)瓚娜 經(jīng)語佳 戴樂軍 王夢芝*

（1.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009；2.連云港生物工程中等專業(yè)學(xué)校，江蘇連云港222065）

日糧組成是引起乳脂率變化的重要因素，調(diào)控日糧可使乳脂率降低46%左右[1]。乳脂降低綜合征的發(fā)病機(jī)制主要包括日糧因素造成乳脂合成前體物質(zhì)不足和瘤胃氫化異常產(chǎn)物抑制乳腺脂肪酸合成等[2-3]。大約50%的乳脂是以瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸為原料由乳腺合成，其余部分則由飼料的脂肪或體內(nèi)積蓄的脂肪供給。瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸的比例升高會明顯提高牛奶中乳脂含量，且乳脂率與瘤胃內(nèi)乙酸/丙酸比呈正相關(guān)[4-5]。研究表明，在泌乳奶牛日糧添加脂肪或脂肪酸是調(diào)控奶牛泌乳性能和能量代謝的有效途徑[6-7]。膳食植物油和油籽補(bǔ)品可以改善牛奶中的脂肪酸組成，并且在奶牛日糧中添加亞油酸有助于消化膳食纖維并提高牛奶質(zhì)量[8-9]。Bayat 等[8]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)調(diào)控了微生物群落結(jié)構(gòu)，并增加不飽和脂肪酸和總共軛亞油酸的比例，同時(shí)不影響消化率、瘤胃發(fā)酵、瘤胃微生物數(shù)量和牛奶產(chǎn)量。在奶牛日糧中添加棕櫚油可減少原蟲數(shù)量，但不會影響瘤胃中的纖維素分解細(xì)菌數(shù)量[10]。一些研究發(fā)現(xiàn)，油脂或脂肪酸的混合添加存在互作作用，如：低濃度的精油組合，可以減輕甲烷排放和反芻動物的氮排泄[11]；楊舒黎[12]研究發(fā)現(xiàn)，添加植物油混合組相對于單一添加植物油，對淀粉分解菌和蛋白質(zhì)分解菌存在一定的加性效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室已篩選出飽和程度不同的長鏈脂肪酸在乙酸發(fā)酵模式下的最優(yōu)組合[13]，但目前對該脂肪酸組合是否是通過調(diào)控瘤胃細(xì)菌群體結(jié)構(gòu)來影響瘤胃發(fā)酵模式尚不清楚。因此，本試驗(yàn)主要通過體外培養(yǎng)乙酸型脂肪酸組合，檢測其體外發(fā)酵參數(shù)及相關(guān)瘤胃細(xì)菌含量，以期闡明脂肪酸組合影響瘤胃發(fā)酵模式的微生物機(jī)制，從而為其在反芻動物生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)選取3頭4歲齡、體重為(650±18) kg、平均產(chǎn)奶量為(19.5±0.5) kg并裝有永久性瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛為瘤胃液供體，試驗(yàn)期間瘺管牛飼喂奶牛場提供的常規(guī)飼糧，精粗比為4:6，在每日07: 00 和19: 00等量飼喂，自由飲水。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與體外培養(yǎng)底物

試驗(yàn)組在培養(yǎng)底物中添加1.5%硬脂酸、0.5%油酸、1.0%亞油酸、1.5%亞麻油酸進(jìn)行試驗(yàn)，用棕櫚酸鈣平衡能量。另外設(shè)1個無底物的空白對照組，每組各設(shè)3個重復(fù)，培養(yǎng)底物組成見表1。

表1 體外培養(yǎng)底物的組成(%)

1.3 體外培養(yǎng)試驗(yàn)

1.3.1 瘤胃液的采集

在晨飼前利用自制真空負(fù)壓裝置從3 頭瘺管牛各采集瘤胃液200 ml，4 層紗布過濾后將瘤胃液混合均勻，39 ℃水浴保溫迅速送回實(shí)驗(yàn)室，準(zhǔn)備體外培養(yǎng)。

1.3.2 體外培養(yǎng)

參照Menke等[14]的方法。

1.3.3 取樣設(shè)計(jì)

分別在培養(yǎng)后0、3、6、9、12、18、24 h取樣，即刻測定pH 值，取1 ml 立即加MFS 原蟲染液固定用于原蟲細(xì)胞計(jì)數(shù)，其余樣品于-20 ℃保存，用于培養(yǎng)液氨態(tài)氮（NH3-N）濃度、微生物蛋白、原蟲蛋白和細(xì)菌蛋白的測定以及DNA的提取。

1.4 指標(biāo)的測定

1.4.1 pH值的測定

采用上海雷磁試驗(yàn)設(shè)備廠pHS-3C 型pH 計(jì)進(jìn)行測定。

1.4.2 NH3-N濃度的測定

NH3-N濃度采用馮宗慈等[15]的方法進(jìn)行測定。

1.4.3 培養(yǎng)液揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度測定

采用日本島津GC-14B氣相色譜儀進(jìn)行測定[16]。

1.4.4 微生物的分離與測定參照王夢芝等[17]的方法進(jìn)行分離與測定。

1.5 微生物DNA的提取與熒光定量PCR

1.5.1 微生物DNA提取

分別取不同采樣時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)液做以下操作：

①樣品離心（14 000 r/min，10 min）后棄上清，加油提液5 ml（100 mmol/l Tris-Cl，50 mmol/l EDTA，2%CTAB），混勻；

②加100 μl 5 mg/ml 蛋白酶K，1/10 體積的20%SDS，完全凍至成冰后55 ℃水浴60 min，重復(fù)凍融3次；用等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（V/V/V=25/24/1）先抽提1次，離心（12 000 r/min，10 min）；

③取上水相，再用等體積的氯仿/異戊醇（V/V=24/1）抽提和離心數(shù)次至上水相澄清（無色）；

④取水相，加0.6 體積的異丙醇，冰上靜置沉淀DNA 之后離心去上清，70%乙醇洗沉淀2～3 次，自然干燥，適量TE溶解；

⑤Nanodrop1000 測定所提取DNA 濃度和純度，0.7%瓊脂糖電泳檢測DNA片段大小。

1.5.2 熒光定量PCR反應(yīng)條件

①95 ℃預(yù)變性30 s；

②95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸34 s并采集熒光信號，共40個循環(huán)；

③熔解曲線分析，以0.1 ℃/s的速度從60 ℃升至95 ℃，60 ℃和95 ℃各保溫15 s，每升0.1 ℃采集一次熒光。以Bacterial-U為內(nèi)參，計(jì)算各細(xì)菌的相對含量。

1.6 引物設(shè)計(jì)

在GenBank上查找琥珀酸擬桿菌（Fibrobacter suc?cinogenes）、黃色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）等不同菌株的16S rDNA 序列，然后利用DNAStar 中MegAlign 進(jìn)行序列比對，尋找種內(nèi)保守區(qū)域，利用Primer express 5.0 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并通過GenBank 中Blast 檢測引物特異性。以細(xì)菌通用引物細(xì)菌U（Bac?terial-U）為內(nèi)參，對各細(xì)菌進(jìn)行相對定量。細(xì)菌引物序列見表2。

表2 細(xì)菌引物信息與序列表

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016軟件整理數(shù)據(jù)，試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS 25.0 軟件中Compare Mean的independent-samples T-Test程序進(jìn)行分析檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙酸型脂肪酸組合體外培養(yǎng)對pH 值和NH3-N濃度的影響

由表3 可知，體外培養(yǎng)的pH 值在5.56～6.91 之間波動，并且對照組與試驗(yàn)組之間差異不顯著（P>0.05）；NH3-N 濃度各組總體呈先降低再升高的變化趨勢，各組NH3-N濃度在9.05～15.05 mg/dl之間，在體外培養(yǎng)18 h 時(shí)，對照組NH3-N 濃度顯著高于試驗(yàn)組（P<0.05），其他時(shí)間點(diǎn)差異不顯著（P>0.05）。

2.2 乙酸型脂肪酸組合體外培養(yǎng)對VFA的影響

如表4所示，總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）濃度隨時(shí)間的推移逐漸升高，試驗(yàn)組的TVFA濃度9 h后及其均值顯著高于對照組(P<0.05)；乙酸占TVFA的比例變化平緩，有下降趨勢，且試驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)乙酸占TVFA的比例總體高于對照組，其均值顯著高于對照組（P<0.05）。

表3 乙酸型脂肪酸組合體外培養(yǎng)對pH值和NH3-N濃度的影響

表4 乙酸型脂肪酸組合對TVFA濃度和乙酸占TVFA比例的影響

2.3 乙酸型脂肪酸組合體外培養(yǎng)對微生物蛋白和原蟲蛋白/細(xì)菌蛋白的影響

表5 乙酸型脂肪酸組合對微生物蛋白含量和原蟲蛋白/細(xì)菌蛋白的影響

如表5所示，乙酸型脂肪酸組合的微生蛋白含量顯著高于對照組(P<0.05)，而其原蟲蛋白/細(xì)菌蛋白的比例卻顯著低于對照組(P<0.05)。

2.4 乙酸型脂肪酸組合體外培養(yǎng)對瘤胃細(xì)菌的影響

如表6所示，試驗(yàn)組中嗜淀粉瘤胃桿菌、琥珀酸擬桿菌的相對含量均顯著高于對照組（P<0.05），試驗(yàn)組中溶纖維丁酸弧菌的相對含量顯著低于對照組（P<0.05），而白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、蛋白溶解梭菌、降解淀粉瘤胃球菌、埃式巨球菌在組間差異均不顯著（P>0.05）。

表6 乙酸型脂肪酸組合對瘤胃細(xì)菌含量的影響

3 討論

3.1 脂肪酸制劑體外培養(yǎng)對pH 值和NH3-N 濃度的影響

pH 值和NH3-N 濃度是反映瘤胃發(fā)酵的重要指標(biāo)，瘤胃液NH3-N濃度變化反映瘤胃微生物對日糧氮的降解速度和瘤胃微生物對NH3-N 的利用速度[18]。瘤胃微生物最適NH3-N 濃度為6.3～27.5 mg/dl[19]。有研究表明，補(bǔ)充亞麻油不會對奶牛的瘤胃pH 值產(chǎn)生影響[20]。此外，使用不同類型的膳食油在他人的研究中也報(bào)道了相同的結(jié)果[10，21-23]。，不同的脂肪酸對NH3-N濃度的影響沒有顯著差異[23-24]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示培養(yǎng)液pH值和NH3-N濃度在組間沒有顯著性的差異，都處于瘤胃微生物適宜生長的范圍。該結(jié)果與前人的試驗(yàn)結(jié)果基本一致。這說明脂肪酸組合對瘤胃微生物體外培養(yǎng)的發(fā)酵狀態(tài)沒有影響。

3.2 脂肪酸制劑體外培養(yǎng)對VFA的影響

泌乳奶牛乳脂肪酸有兩種主要來源，一種是乳腺上皮細(xì)胞從血液中攝取瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的乳脂合成前體物乙酸和β-羥丁酸，另一種是日糧來源的長鏈脂肪酸，主要是C18[25]。增加乳腺乳脂前體物的供給能改變泌乳奶牛乳腺脂肪酸的代謝[26-27]。在日糧中添加油脂或脂肪酸能夠改變瘤胃微生物區(qū)系及其發(fā)酵過程[28]。Zhang 等[29]提出不飽和C18脂肪酸改變瘤胃發(fā)酵模式和微生物種群分布，可增加TVFA 濃度。而本試驗(yàn)添加乙酸發(fā)酵型的長鏈脂肪酸組合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的TVFA 濃度以及其中乙酸的比例都顯著提高，這進(jìn)一步表明脂肪酸組合的添加有利于瘤胃發(fā)酵，趨使瘤胃發(fā)酵模式向乙酸型發(fā)酵模式變化。

3.3 脂肪酸制劑體外培養(yǎng)對微生物蛋白和原蟲蛋白/細(xì)菌蛋白的影響

有研究表明，日糧中添加脂肪酸能抑制瘤胃中原蟲和部分菌群的生長，使微生物總量和活力改變，增加微生物蛋白的合成，從而引起瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而影響瘤胃的發(fā)酵[30-34]。添加不同濃度油脂（桉樹油）發(fā)現(xiàn)，油脂在瘤胃脂解后生成游離脂肪酸的不飽和鍵能控制原蟲和部分細(xì)菌，從而調(diào)控了原蟲蛋白與細(xì)菌蛋白的比例[35]。而本試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組微生物蛋白含量顯著高于對照組，而其原蟲蛋白/細(xì)菌蛋白的比例卻顯著低于對照組?？烧f明脂肪酸組合提高了瘤胃微生物的總量，抑制了原蟲數(shù)量進(jìn)而抑制其吞噬細(xì)菌等活動，提高了原蟲蛋白/細(xì)菌蛋白中細(xì)菌群體的比例，使原蟲蛋白/細(xì)菌蛋白的比例降低。表明脂肪酸組合能夠調(diào)控體外培養(yǎng)瘤胃微生物的群體量和群體結(jié)構(gòu)。

3.4 乙酸發(fā)酵型脂肪酸組合體外培養(yǎng)對瘤胃細(xì)菌的影響

日糧添加不同來源或不同水平的脂肪對瘤胃發(fā)酵參數(shù)及微生物區(qū)系有一定的調(diào)控作用，不同來源脂肪和不同添加水平脂肪對瘤胃發(fā)酵功能的影響程度都不同[32-33]。瘤胃中的纖維降解菌主要包括白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌，分別占總纖維分解菌的33%、2.6%和46%[36-37]。白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌是反芻動物瘤胃中降解植物細(xì)胞壁活性最高的細(xì)菌[38]，都屬于革蘭氏陽性菌，能產(chǎn)生大量的纖維素酶和半纖維素酶，分解纖維素和纖維二糖，產(chǎn)生甲酸、乙酸和琥珀酸。嗜淀粉瘤胃桿菌是主要的淀粉分解菌之一，其主要產(chǎn)物為乙酸和琥珀酸[39]。本研究中，試驗(yàn)組中嗜淀粉瘤胃桿菌、琥珀酸擬桿菌的相對含量均顯著高于對照組，這恰恰證明了我們試驗(yàn)所選脂肪酸組合為乙酸型脂肪酸組合，這說明脂肪酸組合可能是通過調(diào)控瘤胃細(xì)菌數(shù)量來改變瘤胃發(fā)酵模式的。溶纖維丁酸弧菌與琥珀酸擬桿菌、黃色瘤胃球菌等其他瘤胃微生物協(xié)同共生，對維持微生物動態(tài)平衡起重要作用[38]。試驗(yàn)組中溶纖維丁酸弧菌的相對含量顯著低于對照組，這與前人的試驗(yàn)結(jié)果一致[12,40]。但目前對瘤胃細(xì)菌的研究結(jié)果各有差異，肉牛飼糧添加豆油和胡麻油的研究并沒有發(fā)現(xiàn)瘤胃淀粉分解菌的變化[41]；烏日娜[42]添加6%的植物油脂時(shí)顯著降低了瘤胃產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌含量；金龍等[43]體外發(fā)酵添加4%的棕櫚仁油提高了黃色瘤胃球菌含量；Candyrine等[44]在飼糧中添加油脂對黃色瘤胃球菌無影響。這些結(jié)果的不一致可能是由于油脂的添加比例不同或不同油脂混合后的互作效應(yīng)對瘤胃微生物的影響不同造成的。當(dāng)油脂添加超過一定比例時(shí)，油脂可能附著于瘤胃中菌體表面，影響細(xì)菌的活動及其酶的分泌，從而影響微生物代謝，或可能由于某些脂肪酸對微生物有一定的毒害作用，損害了部分纖維素降解微生物的胞膜而抑殺微生物[12，40]。

4 結(jié)論

乙酸發(fā)酵型脂肪酸組合能夠調(diào)控瘤胃發(fā)酵模式，促進(jìn)了微生物的發(fā)酵活力，與對照組相比，試驗(yàn)組將乙酸占TVFA的比例從73.54%提高至75.59%，趨使瘤胃發(fā)酵模式向乙酸型發(fā)酵模式變化，進(jìn)而可能影響奶牛的泌乳性能，但乙酸型脂肪酸組合對奶牛泌乳性能的影響尚有待于進(jìn)一步的試驗(yàn)證明。