蘇云金桿菌的分類研究綜述

顧曉峰，陰啟星，孫興民，張娓娓，王曉鋒

（1 江蘇句容市林業(yè)科技推廣中心 212400；2 句容市磨盤山林場；3 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院；4 句容市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局）

蘇云金桿菌簡稱Bt，其分類地位隸屬于原核生物界厚壁菌門芽孢桿菌綱芽孢桿菌目芽孢桿菌科芽孢桿菌屬的一種革蘭氏陽性菌。其形狀呈桿狀、具有內(nèi)生芽孢。蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）重要特性是能夠殺死害蟲。在第九版的《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》中，蘇云金桿菌被歸為第二類第十八群，屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）中的一個種[1]。

1 其分類地位的爭論

自1957 年以來，Bt 被劃分成為獨(dú)立種后，它的分類地位就存在很多爭論，爭論的重點(diǎn)在于Bt 和一種蠟狀芽孢桿菌（Ba.cillus cereus）二者菌株形態(tài)、菌株生理生化等一些特征上差別很小，而且2 種菌有近緣性，二者之間區(qū)別只是在于Bt 能產(chǎn)生一定量的伴孢晶體。隨著科技的不斷發(fā)展和研究的不斷深入，Bt 新菌株不斷被研究者們發(fā)現(xiàn)，各式各樣的分類方法也被研究者們不斷提出，將人類有史以來發(fā)現(xiàn)的所有Bt 分別劃分為不同的生物型、亞種、變種、血清型及致病型等。用來鑒定Bt 的主要方法有酯酶法、鞭毛抗原法、生理生化試驗(yàn)、PCR 鑒定、16srRNA/DNA 鑒定、染色體雜交等現(xiàn)代分子生物學(xué)方法。[1]

它與蠟狀芽孢桿菌和炭疽芽孢桿菌的主要區(qū)別是：Bt 在形成芽孢的時候，會形成不規(guī)則形狀的伴孢晶體。在Bt 桿菌體內(nèi)能形成的伴孢晶體形狀有菱形、方形、長方形、橢圓形等，其數(shù)量為1～2 個，甚至多個。Bt 伴孢晶體由不同分子量的多肽一原毒紊組成，每一種多肽都是單一基因編碼的產(chǎn)物。蘇云金芽孢桿菌廣泛地分布在世界各處，從地上的土壤到空氣中的灰塵，從河流到山川，從南極凍土到熱帶雨林，從平原到沙漠，各處均有分布，在整個地球上，其菌種和基因資源豐富，目前世界范圍內(nèi)大約有6 萬個左右Bt 分離物。

2 其分類地位作為獨(dú)立種的依據(jù)

蘇云金桿菌在形成芽孢時體內(nèi)形成的蛋白質(zhì)伴孢晶體是其成為獨(dú)立種的主要依據(jù)。盡管蘇云金桿菌可以在不合宜條件下或在各因素的誘導(dǎo)下失去產(chǎn)生伴孢晶體能力，但不影響B(tài)t 進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵并成功作為生物殺蟲劑的實(shí)際意義。雖然Bt 與蠟狀芽孢桿菌非常相似，細(xì)菌學(xué)家一直堅(jiān)持把它們歸為一個種，但從經(jīng)濟(jì)意義和實(shí)際的需要出發(fā)，應(yīng)用微生物學(xué)家卻要保留Bt 和炭疽芽孢桿菌在芽孢桿菌屬中作為獨(dú)立種的分類地位。Baumann 等強(qiáng)調(diào)，協(xié)調(diào)應(yīng)用微生物學(xué)家職業(yè)的需要和細(xì)菌分類可接受的實(shí)際情況是困難的，并認(rèn)為Gordon 把Bt 作為蠟狀芽孢桿菌的一個亞種很有價值，亞種可進(jìn)一步細(xì)分為血清型，然而這些主張并沒有被《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》第八版中采納，繼續(xù)保留了它們獨(dú)立種的分類地位[2]。

3 蘇云金桿菌分類進(jìn)展史

蘇云金桿菌的分類自從1946 年Smith 等按現(xiàn)代分類方法，將Bt 劃入芽孢桿菌科，主張作為蠟狀芽孢桿菌的一個變異體。1951 年，Toumanoff 等把他們的分離體命名為蠟狀芽孢桿菌阿萊亞種，同時建議猝倒芽孢桿菌和BT 都作為蠟狀芽孢桿菌的亞種。1958 年Heimpel 等提出了與蠟狀芽孢桿菌有關(guān)的昆蟲病原菌分類問題，同時列出檢索分類表，然后Heimpel 等對產(chǎn)生伴孢晶體的病原細(xì)菌分類補(bǔ)充。Krieg 在1961 年綜合出蠟狀芽孢桿菌群的檢索表。在此基礎(chǔ)上，我國劉崇樂于1961 年對KriegDE 檢索表進(jìn)行了修訂。后來，1962 年Barjac 等根據(jù)生理生化反應(yīng)和鞭毛抗原（H）血清反應(yīng)的不同，把Bt 劃分為6 個亞群。后又區(qū)分為9個亞群。1973 年Barjac 等以鞭毛抗原的血清為依據(jù)參照生理生化反應(yīng)和脂酶圖型的不同，將Bt 劃分12 個H 型。其中H3、H4、H5 型中存在著抗原亞因子，定為H3a 和H3a3b,H4a4b 和H4a4c,H5a5b 和H5a5c[3]。

1962 年用鞭毛抗原的血清學(xué)反應(yīng)的方法將Bt 劃分為6 個血清型；1972 年進(jìn)一步細(xì)分為12 個血清型，l5 個血清亞種；1981 年為19 個血清型，25 個血清型亞種；1992 年為34 個血清型，43 個血清型亞種；1994 年為40 個血清型，54 個血清型亞種。近幾十年來，世界各國的研究者們在世界各處采集并分離了大量的菌種，其血清亞種數(shù)增加較為迅速。但在發(fā)現(xiàn)的蘇云金芽孢桿菌中，其新血清亞種占有量高達(dá)80%以上。

Hofte 和Whiteley1989 年根據(jù)42 個基因編碼的氨基酸序列的同源性和殺蟲譜雙重標(biāo)準(zhǔn)將Bt 殺蟲晶體蛋白基因劃分為5 類14 亞類。其內(nèi)具有溶血溶細(xì)胞作用的27kDa 晶體蛋白基因被命名為cyt 基因，其他只有殺蟲活性的13 亞類命名cry 基因。cry 基因依據(jù)其4類特異性可劃分4 群，依次為鱗翅目特異性、鱗翅目和雙翅目特異性、鞘翅目特異性、雙翅目特異性。當(dāng)時基因數(shù)目發(fā)現(xiàn)的較少，相互之間差異較為明顯，故而每個基因的分類地位比較明確，從而使Hofte 和Whiteley的分類系統(tǒng)在世界范圍內(nèi)被研究者們廣泛的接受和采用。但隨著Bt 新基因的不斷發(fā)現(xiàn)，這種分類方法漸漸不能滿足上述條件，使分類很難確定。到2004 年已發(fā)現(xiàn)299 種殺蟲晶體蛋白基因，分屬于44 群，136 模式基因[4]。截止到2007 年4 月，這些基因依據(jù)其核苷酸序列的同源性被分為53 類，396 種，其中cry 基因有372種，cyt 基因有24 種。而這種分類系統(tǒng)在同源性和殺蟲譜分類原則之間存在一定沖突，在1995 年的國際無脊椎病理學(xué)會年會上，成立了以殺蟲晶體蛋白基因而命名的委員會，同時依據(jù)氨基酸序列的同源性進(jìn)行分類。其分類是以比較晶體蛋白氨基酸序列的同源性，以45%、78%和95%為界，通過計(jì)算機(jī)運(yùn)用，將基因劃分為4 個分類等級，依次用大寫英文字母、阿拉伯?dāng)?shù)字、小寫英文字母和阿拉伯?dāng)?shù)字表示已發(fā)現(xiàn)到的116 個殺蟲蛋白基因，分別分布于Bt 不同菌株中。不同亞種之間、不同血清型，其基因數(shù)和種類都有明顯差異。多個晶體蛋白基因定位于同一質(zhì)粒上；或者同一菌株的殺蟲晶體蛋白基因也可能定位于不同的質(zhì)粒上；而有的則定位于染色體上，或同時存在于質(zhì)粒和染色體上。

我國對Bt 的研究相對起步較晚，一些國家早在20 世紀(jì)50 年代前就已經(jīng)開始對此研究。早在1955年，曹驥先生等從引進(jìn)的法國商品制劑中就成功分離得到Bt 菌株，并在實(shí)驗(yàn)室制備成菌劑，后用來防治玉米螟取得良好效果。1959 年劉篙樂先生從捷克斯洛伐克引進(jìn)蘇云金桿菌亞種，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)擴(kuò)繁后，大量制備成菌劑對楊天社蛾、菜粉蝶、松毛蟲進(jìn)行防治，效果顯著。1964 年，由國家科委下達(dá)任務(wù)，在武漢建成了專門的生產(chǎn)蘇云金桿菌制劑工廠。1965 年年底，武漢生產(chǎn)的“三五牌”和長沙生產(chǎn)的“424”蘇云金桿菌生物殺蟲劑在我國推廣使用。同時中國林科院對此也進(jìn)行了液體深層發(fā)酵的研究。

20 世紀(jì)80 年代，我國的Bt 生物殺蟲劑研究、開發(fā)和利用都進(jìn)入到較為穩(wěn)定的發(fā)展階段，武漢成為我國主要的Bt 殺蟲劑生產(chǎn)基地。此外，湖北農(nóng)科院也組織專家團(tuán)隊(duì)進(jìn)行深入研究，他們研制和量產(chǎn)的Bt 液劑、粉劑等，不但發(fā)酵效率高，而且成本較低，同時還解決了生產(chǎn)過程中噬菌體污染問題和產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化問題。

4 研究展望

目前，我國生物農(nóng)藥被普遍使用，Bt 的研究應(yīng)用前景十分廣泛，其分類研究為以后選育優(yōu)良菌株提供理論基礎(chǔ)，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，對Bt 研究將更加完善和深入。