膠體金法快速檢測(cè)蔬菜中多菌靈·吡蟲啉和啶蟲脒的應(yīng)用研究

陳美蓮　章慧　豐東升　張維誼　韓奕奕　王敏　周雨璊　馬穎清　汪弘康　王藝嬌

摘要 [目的]研究膠體金法在蔬菜中多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒殘留量檢測(cè)的應(yīng)用，并將該方法與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法比較，證實(shí)膠體金試紙條在檢測(cè)蔬菜中多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒殘留的適用性。[方法]試驗(yàn)驗(yàn)證了膠體金法檢測(cè)蔬菜中多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒在不同基質(zhì)中的靈敏度，并將該方法與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法比較驗(yàn)證其假陰性和假陽性率。[結(jié)果]膠體金法檢測(cè)蔬菜中多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的檢出限分別為0.5、0.5和0.2? mg/kg;該方法在不同基質(zhì)中的穩(wěn)定性較好;實(shí)驗(yàn)室加標(biāo)驗(yàn)證3種農(nóng)藥殘留檢測(cè)的假陰性率和假陽性率均為0，與參比方法無顯著性差異（χ2<3.84）;實(shí)物陽性樣品驗(yàn)證3種農(nóng)藥殘留檢測(cè)的假陰性率均為0，假陽性率分別為0、0和6.67%，但與參比方法均無顯著性差異（χ2<3.84）。除多菌靈與阿苯達(dá)唑有100%交叉反應(yīng)外，多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒與該研究中試驗(yàn)的常見農(nóng)藥均無交叉反應(yīng)。[結(jié)論]膠體金法快速檢測(cè)蔬菜中多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可作為部分蔬菜上市前殘留檢測(cè)的一種有效手段。

關(guān)鍵詞 膠體金法;蔬菜;多菌靈;吡蟲啉;啶蟲脒;殘留量

中圖分類號(hào) TS207.5+3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）22-0193-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.22.052

Study on Colloidal Gold Rapid Detecting Carbendazol，Imidacloprid and Acetamiprid in Vegetables

CHEN Mei-lian，ZHANG Hui，F(xiàn)ENG Dong-sheng et al （Shanghai Agri-products Quality and Safety Center，The Ministry of Agriculture Food Quality Supervision and Inspection Center（Shanghai），Shanghai 201708）

Abstract [Objective]To study the application of colloidal gold method on detecting carbendazol，imidacloprid and acetamiprid in vegetables and compare to liquid chromatography-tandem mass spectrometry method to make sure the reliability of colloidal gold strip for determination of carbendazol，imidacloprid and acetamiprid residues in vegetables.[Method]The experiment verified the sensitivity of colloidal gold method for detecting carbendazim，imidacloprid and acetamiprid in vegetables in different matrices，and compared the method with liquid chromatography-tandem mass spectrometry to verify its false negative and false positive rates.[Result]The detection limit of colloidal gold rapid detecting carbendazol，imidacloprid and acetamiprid were 0.5 mg/kg，0.5 mg/kg and 0.2? mg/kg，their stabilities in different matrix was good.Laboratory labeling verification result showed that the false negative and positive rate were 0，no significant difference with reference method （χ2<3.84）.Physical positive sample verification result showed that their false negative were 0，their positive rate were 0，0 and 6.67%，no significant difference with reference method（χ2<3.84）.There were no cross-reaction between carbendazol，imidacloprid，acetamiprid and other pesticides except for 100% cross-reaction between carbendazol and albendazole.[Conclusion]Colloidal gold rapid detection of carbendazol，imidacloprid and acetamiprid in vegetables are simple，rapid，accurate and stable.It can be used as an effective method to detect the residues of carbendazol，imidacloprid and acetamiprid in vegetables.

Key words Colloidal gold method;Vegetables;Carbendazol;Imidacloprid;Acetamiprid;Residue

基金項(xiàng)目

上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（2019-02-08-00-15-F01147）。

作者簡(jiǎn)介 陳美蓮（1963—），女，上海人，農(nóng)業(yè)推廣研究員，從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作。

收稿日期 2020-04-02;修回日期 2020-05-11

我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)藥使用品種多、用量大，蔬菜中的農(nóng)藥殘留嚴(yán)重影響了我國(guó)食用農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量信譽(yù)，更損害了消費(fèi)者的身體健康。目前，專屬性強(qiáng)、靈敏度高的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法均為檢測(cè)費(fèi)用高、周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜的儀器分析方法。為提高監(jiān)管與檢驗(yàn)效率，降低監(jiān)管部門、檢驗(yàn)部門、種植基地、商家和其他市場(chǎng)流通環(huán)節(jié)對(duì)重點(diǎn)、高風(fēng)險(xiǎn)農(nóng)藥殘留項(xiàng)目的監(jiān)測(cè)的成本，解決上述監(jiān)管需求，急需開發(fā)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、樣品前處理簡(jiǎn)單的農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法。目前國(guó)內(nèi)最常用的蔬菜中農(nóng)藥殘留的快速測(cè)定方法是酶抑制率法[1]，而該方法受酶特異性影響，檢測(cè)的農(nóng)藥種類有限[2]，多用于有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測(cè)[3]。膠體金免疫層析技術(shù)是一種將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測(cè)技術(shù)和層析分析技術(shù)等多種方法有機(jī)結(jié)合在一起的固相標(biāo)記免疫檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確和無污染等優(yōu)點(diǎn)，自1971 年Faulk W P和Taylor G M 首次建立，便因其眾多優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)、食品安全及動(dòng)物疫病診斷等各領(lǐng)

域[4]。在蔬菜農(nóng)藥殘留檢測(cè)中，膠體金免疫層析法可以有效彌補(bǔ)酶抑制率法存在的不足，而且可檢測(cè)的藥物種類更多，但目前生產(chǎn)的檢測(cè)試紙種類較少，制約了該檢測(cè)技術(shù)的大面積推廣[5]。

多菌靈為一種高效低毒的廣譜內(nèi)吸性殺菌劑，生產(chǎn)應(yīng)用范圍廣泛，對(duì)螨蟲有一定的殺滅作用，對(duì)果樹、糧食作物和蔬菜等的病害和食用菌栽培生產(chǎn)過程中的病害有一定的防治作用，在水果保鮮、防腐防霉等方面也有一定作用[6]。吡蟲啉是一種廣譜、高效、低毒、內(nèi)吸性強(qiáng)、殘效期長(zhǎng)的殺蟲劑，對(duì)糧食作物、油料、蔬菜、水果等多種蟲害有防治效果[7]。啶蟲脒是一種新型廣譜且具有一定殺螨活性的殺蟲劑，廣泛用于水稻、蔬菜、果樹、茶葉的蚜蟲、飛虱等蟲害的防治[8-9]。多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒均為《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2019）[10]在蔬菜產(chǎn)品中有限量規(guī)定的農(nóng)藥品種，其中啶蟲脒還被列為2018年上海市蔬菜重點(diǎn)推薦使用的農(nóng)藥品種。雖然3種農(nóng)藥均屬低毒農(nóng)藥，但其使用廣泛，如果過量使用或使用不當(dāng)，殘留在蔬菜中會(huì)對(duì)人體健康帶來隱患，因此其在蔬菜中的殘留水平值得關(guān)注。為滿足蔬菜質(zhì)量安全的監(jiān)管和農(nóng)戶生產(chǎn)自檢的需要，筆者對(duì)膠體金法快速測(cè)定蔬菜中多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的技術(shù)開展了應(yīng)用研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 多菌靈快速檢測(cè)試紙條（YRSPN1012）、吡蟲啉快速檢測(cè)試紙條（YRSPN1027）和啶蟲脒快速檢測(cè)試紙條（YRSPN1026），深圳市易瑞生物技術(shù)股份有限公司;多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)品，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer。

1.2 儀器與設(shè)備 膠體金法讀數(shù)儀YR-100，深圳市易瑞生物技術(shù)股份有限公司;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS），沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 膠體金法。

1.3.1.1 原理。該研究采用膠體金免疫層析技術(shù)，將金標(biāo)抗體置入檢測(cè)微孔中凍干，在硝酸纖維素膜的檢測(cè)線（T 線）

處分別包被多菌靈、吡蟲啉或啶蟲脒抗原，在對(duì)照線（C 線）處包被羊抗鼠IgG 二抗。樣本中若含有多菌靈、吡蟲啉或啶蟲脒，在微孔溫育過程中與膠體金標(biāo)記的多菌靈、吡蟲啉或啶蟲脒單克隆抗體結(jié)合，從而抑制了金標(biāo)抗體與硝酸纖維素膜上包被的多菌靈、吡蟲啉或啶蟲脒抗原的結(jié)合。若T 線顏色弱于C 線顏色或不顯色，即樣品中的多菌靈、吡蟲啉或啶蟲脒含量等于或超過產(chǎn)品檢出限，反之則低于產(chǎn)品檢出限。

1.3.1.2 前處理。取（2.0±0.1）g剪碎或攪碎后的樣品加入到15 mL 或50 mL 離心管中;量取并加入8 mL YRSPN 樣品通用提取液，充分振蕩混勻，即為待測(cè)液。

1.3.1.3 檢測(cè)。從配套的檢測(cè)試劑盒里去除紅色微孔試劑，依次加入200 μL待測(cè)液，用一次性吸管上下抽吸混勻后反應(yīng)3 min（20～40 ℃）。取出試紙條，將試紙條插入上述紅色微孔中，反應(yīng)6 min（20～40 ℃）。從微孔中取出試紙條，輕輕刮去試紙條下端的吸水海綿，并進(jìn)行結(jié)果判讀。若T 線顏色≥C 線顏色，則結(jié)果為陰性（未檢出）;若T 線顏色

1.3.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的檢測(cè)按照《水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB/T 20769—2008）[11]規(guī)定的方法測(cè)定。

1.4 結(jié)果評(píng)價(jià) 試驗(yàn)結(jié)果按照國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局制定的《食品快速檢測(cè)方法評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》評(píng)價(jià)膠體金方法的靈敏度、特異性、假陽/陰性率和與參比方法一致性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基質(zhì)的靈敏度試驗(yàn) 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2019）[10]中對(duì)多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒在蔬菜中的殘留量均有規(guī)定。該試驗(yàn)針對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)中多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒在各類蔬菜中的限量標(biāo)準(zhǔn)，選定不同蔬菜品種和加標(biāo)濃度。除GB 2763—2019中明確限量的蔬菜品種外，該試驗(yàn)另選市面上常見的幾種蔬菜作為驗(yàn)證樣品開展靈敏度試驗(yàn)，每種農(nóng)藥共選定9種蔬菜，具體蔬菜品種詳見表1～3。每種蔬菜均設(shè)置4個(gè)濃度，即本底濃度（空白）、1/2限量值濃度或產(chǎn)品標(biāo)識(shí)檢出限濃度（如產(chǎn)品檢出限即為該藥物在某種蔬菜上的限量值即設(shè)定1/2限量值濃度，如產(chǎn)品檢出限低于該藥物在某種蔬菜上的限量值則設(shè)定產(chǎn)品標(biāo)識(shí)檢出限濃度）、限量值濃度和2倍限量值濃度。每份試驗(yàn)樣品均做3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)結(jié)果見表1～3。膠體金試劑條說明書中描述多菌靈的檢出限為0.5～1.0 mg/kg，吡蟲啉的檢出限為0.5～1.0 mg/kg，啶蟲脒的檢出限為0.2～0.5 mg/kg。試驗(yàn)結(jié)果顯示在不同蔬菜基質(zhì)中多菌靈和吡蟲啉的檢出限均能達(dá)到0.5 mg/kg，啶蟲脒的檢出限均能達(dá)到0.2 mg/kg，3種農(nóng)藥驗(yàn)證的檢出限均能達(dá)到與膠體金試劑條說明書中描述的最低水平，且能滿足國(guó)家殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的要求。

2.2 實(shí)驗(yàn)室加標(biāo)假陽性率試驗(yàn) 多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的靈敏度試驗(yàn)中各選取的9種蔬菜均隨機(jī)在市場(chǎng)上抽取3份，并用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確認(rèn)為陰性，再用膠體金快速試紙條進(jìn)行檢測(cè)以驗(yàn)證其假陽性率。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法中多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的檢出限分別為0.12、5.50、0.36 μg/kg。結(jié)果詳見表4，多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的假陽性率均為0。

2.3 實(shí)驗(yàn)室加標(biāo)假陰性率試驗(yàn) 多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的靈敏度試驗(yàn)中各選取的9種蔬菜均隨機(jī)在市場(chǎng)上抽取3份，并用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確認(rèn)為陰性，再根據(jù)3種農(nóng)藥的檢出限濃度進(jìn)行加標(biāo)驗(yàn)證，多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的加標(biāo)濃度分別為0.5、0.5、0.2 mg/kg。結(jié)果見表5，多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的假陰性率均為0。

2.4 實(shí)物陽性樣品 在試驗(yàn)基地選擇生產(chǎn)過程中未使用過農(nóng)藥的綠葉蔬菜，分別對(duì)其噴灑主要藥效成分為多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的農(nóng)藥品種，噴灑后3 d采摘蔬菜運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，先用儀器方法對(duì)樣品中農(nóng)藥殘留的含量進(jìn)行測(cè)定，再將樣品稀釋到產(chǎn)品最低檢出限的0.5、1.0、2.0倍水平。每種基質(zhì)做3個(gè)平行，每個(gè)檢出水平做10個(gè)平行。驗(yàn)證結(jié)果用《食品快速檢測(cè)方法評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》評(píng)價(jià)膠體金方法的靈敏度、特異性、假陽/陰性率和與參比方法一致性，結(jié)果如表6所示。實(shí)物陽性樣品驗(yàn)證多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒殘留的假陰性率均為0，僅啶蟲脒在0.1 mg/kg測(cè)試濃度有2例假陽性，總體來看3種農(nóng)藥的假陽性率分別為0、0和6.67%，但與參比方法均無顯著性差異（χ2<3.84）。

2.5 交叉反應(yīng)測(cè)試 選擇噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺、嘧菌環(huán)胺、克百威、毒死蜱、阿苯達(dá)唑、甲氰菊酯、溴氰菊酯、百菌清、腐霉利、烯酰嗎啉共12種農(nóng)藥開展交叉反應(yīng)測(cè)試。將以上12種農(nóng)藥配制成濃度均為20 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別稀釋到1.00、0.50、0.20? mg/kg待用。然后分別用100根啶蟲脒膠體金試紙條測(cè)試1.00、0.50、0.20? mg/kg 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果均為陰性;分別用100根吡蟲啉膠體金試紙條測(cè)試1.00、0.50、0.20 mg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果均為陰性;分別用100根多菌靈膠體金試紙條測(cè)試1.00、0.50、0.20 mg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果除阿苯達(dá)唑外均為陰性，而阿苯達(dá)唑與多菌靈的交叉反應(yīng)率為100%。

3 討論與結(jié)論

近年來，我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全管理力度進(jìn)一步加大，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全水平不斷提升，但由于我國(guó)的蔬菜生產(chǎn)方式仍以家庭小農(nóng)散戶為主，其農(nóng)藥超標(biāo)的問題還未徹底杜絕，蔬菜質(zhì)量安全存在隱患。在眾多影響因素中，缺乏適于源頭生產(chǎn)者的自檢手段是關(guān)鍵因素之一。另外，目前我國(guó)政府部門的農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管工作中均采用儀器方法進(jìn)行檢測(cè)，需要將樣品運(yùn)送到專業(yè)實(shí)驗(yàn)室才能開展工作，不僅檢測(cè)成本高、周期長(zhǎng)，對(duì)操作人員的素質(zhì)要求還很高，另外還會(huì)由于監(jiān)測(cè)經(jīng)費(fèi)和檢測(cè)資源有限而降低抽樣比例，而抽樣比例越小風(fēng)險(xiǎn)就越大，因此該類檢測(cè)方法難以完全滿足日益嚴(yán)格的農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管需求。我國(guó)亟須要適于源頭農(nóng)戶自檢和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的方法[12]。

該研究所報(bào)道的蔬菜中多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的膠體金快速檢測(cè)法可在15 min內(nèi)完成一件樣品從前處理到讀取結(jié)果的全部檢測(cè)工作，檢測(cè)結(jié)果與液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法相比無顯著性差異，該方法更為簡(jiǎn)便、快速和低成本，且其靈敏度較高，能滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的限量要求。因此可采用該方法開展蔬菜上市前的自檢或監(jiān)測(cè)，可有效控制蔬菜中多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒超標(biāo)。另外，膠體金快速檢測(cè)法操作簡(jiǎn)便，無需專業(yè)人員檢測(cè)，適用于基層人員在田間地頭檢測(cè)，也符合政府管理部門及公眾呼吁的農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全從源頭管理的理念，適合推廣到基層開展蔬菜中多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的快速檢測(cè)，但使用的過程中要注意排除多菌靈與阿苯達(dá)唑的交叉反應(yīng)。

參考文獻(xiàn)

[1] 欒云霞，李楊，平華，等.基于酶抑制法的農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)儀器現(xiàn)狀及評(píng)價(jià)[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2012，3（6）：690-694.

[2] 桑園園，柴麗娜，魏朝俊，等.酶抑制法檢測(cè)4 種辛辣蔬菜農(nóng)藥殘留假陽性消除的研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（11）：60-64.

[3] 于基成，邊辭，趙娜，等.酶抑制法快速檢測(cè)蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（5）：170-172.

[4] 馮忠華，李躍龍，陳運(yùn)勤，等.膠體金免疫層析技術(shù)及其在食品安全快速檢測(cè)中的應(yīng)用[J].廣東飼料，2017，26（12）：39-40.

[5] 劉雅寧，袁寶鳳.農(nóng)藥殘留膠體金檢測(cè)方法在蔬菜生產(chǎn)中的應(yīng)用研究[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，60（3）：67-68.

[6]? 肖文丹，楊肖娥，李延強(qiáng).多菌靈在農(nóng)田土壤中的降解及其影響因子研究[J].環(huán)境科學(xué)，2012，33（11）：3983-3989.

[7] 謝文，丁慧瑛，蔣曉英，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)蔬菜和茶葉中吡蟲啉的殘留量[J].色譜，2006，24（6）：633- 635.

[8] TAILLEBOIS E，ALAMIDDINE Z，BRAZIER C，et al.Molecular features and toxicological properties of four common pesticides，acetamiprid，deltamethrin，chlorpyriphos and fipronil[J].Bioorganic & medicinal chemistry，2015，23（7）：1540-1550.

[9] 庾琴，周華，王靜，等.啶蟲脒在環(huán)境中的降解代謝及其安全性的研究進(jìn)展[J].農(nóng)藥，2007，46（4）：223-226.

[10] 國(guó)家衛(wèi)和和計(jì)劃生育委員會(huì)，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局，農(nóng)業(yè)部.食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量：GB 2763—2019[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2020.

[11] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法：GB/T 20769—2008[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

[12] 李玉花.農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法[J].云南農(nóng)業(yè)，2016（4）：81-82.