QuEChERS-EMR結(jié)合GC-MS檢測干制水產(chǎn)品中N-二甲基亞硝胺含量

陸正　陳紅波　林剛健　方如意

摘要 [目的]采用QuEChERS結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立檢測水產(chǎn)干制品中N-二甲基亞硝胺的高效且準確性高的方法。[方法]通過預處理制備條件優(yōu)化即樣品采用乙腈進行提取，利用4 g無水MgSO4和1 g NaCl作為脫水劑，經(jīng)十八烷基鍵合硅膠（C18）凈化，并通過提取后添加的方法進行基質(zhì)效應評估。[結(jié)果]N-二甲基亞硝胺標準曲線的線性相關(guān)系數(shù)大于0.99，通過基質(zhì)匹配繪制標準曲線后能較好地消除基質(zhì)效應的影響，從而提高定量分析檢測的準確度;通過N-二甲基亞硝胺在水產(chǎn)品基質(zhì)加標3水平（5、10、20 μg/kg）的平均回收率為79.8%～102.1%，相對偏差均小于10%。[結(jié)論]該試驗方法具有前處理簡單、用量少、耗時短、準確性較高等特點，能滿足水產(chǎn)品中N-二甲基亞硝胺檢測的要求。

關(guān)鍵詞 QuEChERS-EMR;GC-MC;干制水產(chǎn)品;N-二甲基亞硝胺;含量測定

中圖分類號 TS254.7文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2020）22-0181-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.22.048

Detection of N-dimethylnitrosamine in Dried Aquatic Products by QuEChERS-EMR Combined with GC-MS

LU Zheng， CHEN Hong-bo， LIN Gang-jian et al

（Taizhou Food Inspection and Testing Center，Taizhou，Zhengjing 318000）

Abstract [Objective]An efficient and accurate method for the detection of N-dimethylnitrosamines in dried aquatic products was developed using QuEChERS combined with gas chromatography-mass spectrometry. [Method]The pre-treatment conditions were optimized， that was， the sample was extracted with acetonitrile， 4 g of anhydrous MgSO4 and 1 g of NaCl were used as dehydrating agents， purified by octadecyl bonded silica gel （C18）， and matrix effect was evaluated by the method after extraction. [Result]The linear correlation coefficient of the standard curve of N-dimethylnitrosamine was greater than 0.99. The matrix effect could be eliminated by drawing a standard curve through matrix matching， thereby improving the accuracy of quantitative analysis and detection;the average recovery of three levels （5， 10， 20 μg/kg） of N-dimethylnitrosamine in the aquatic product matrix was 79.8%-102.1%， the relative deviations were less than 10%. [Conclusion]This test method has the characteristics of simple pretreatment， small amount， short time-consuming and high accuracy， and can meet the requirements for the detection of N-dimethylnitrosamines in aquatic products.

Key words QuEChERS-EMR;GC-MC;Dried aquatic products;N-dimethylnitrosamine;Content determination

作者簡介 陸正（1994—），男，浙江臺州人，助理工程師，從事食品檢驗檢測工作。

收稿日期 2020-04-30;修回日期 2020-05-22

水產(chǎn)食品因低脂肪、高蛋白、營養(yǎng)均衡及味道鮮美等特點而受廣大消費者的青睞，其中腌制手法通過抑制肉毒梭狀芽孢桿菌及其他腐敗菌的生長而提高水產(chǎn)品防腐性能、延長產(chǎn)品貨架期，改善產(chǎn)品風味等特點作為水產(chǎn)品的最傳統(tǒng)加工保藏方法[1-2]。相關(guān)研究結(jié)果表明，水產(chǎn)品腌制過程中所加入的硝酸鹽和亞硝酸鹽可與蛋白質(zhì)生成胺反應，形成二甲基亞硝胺、吡咯亞硝胺等N-亞硝胺類化合物[3]，其中揮發(fā)性二甲基亞硝胺為最常見致癌物質(zhì)。

GB 2762—2017《食品安全國家標準 食品中污染物限量》[4]中規(guī)定食品中N-二甲基亞硝胺的限量指標，其中肉及肉制品限量為3.0 μg/kg;水產(chǎn)品及其制品限量為 4.0 μg/kg。GB 5009.26—2016《食品安全國家標準 食品中N-亞硝酸胺類化合物的測定》[5]給出了2種常見檢測方法，其中氣相色譜-熱能分析法由于儀器設(shè)備的專用性及其價格較昂貴而受到一定限制;第2種方法為氣相色譜質(zhì)譜法，由于色譜柱為填充柱，且前處理復雜、分析耗時較長同時存在定性不準確容易造成N-二甲基亞硝胺假陽性，不利于消除基質(zhì)的影響等問題[6]。但目前國內(nèi)真正具有檢測亞硝胺能力的第三方檢測機構(gòu)較少，且對于水產(chǎn)品干制品中N-二甲基亞硝胺國內(nèi)外鮮有報道，因此開發(fā)一種腌制水產(chǎn)品中硝酸銨的高敏感度的檢測方法為當今的重點和難點。

QuEChERS（Quick，easy，cheap，effective，rugged and safe）方法自2003年開發(fā)出來因其快捷、簡單、便宜、有效、耐用和安全等特點而被廣泛應用于樣品前處理中[7]，該技術(shù)中的固相萃取吸附劑的顆?？晌剿⒂袡C酸等干擾基質(zhì)，去除樣品基質(zhì)中的油脂色素等大分子干擾目標化合物檢測物質(zhì)，從而降低儀器檢測背景和改善峰型，進一步保證定量結(jié)果的準確性[8]。該研究針對N-二甲基亞硝胺的化學性質(zhì)，利用QuEChERS前處理萃取結(jié)合適當?shù)奈絼?，通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定其含量，建立一種快捷簡便、定性定量準確的N-二甲基亞硝胺的檢測方法，同時為監(jiān)測臺州市代表性腌制水產(chǎn)品（鰻魚鲞、墨魚干、蝦仁干、鰩魚干）中的亞硝胺安全性提供理論基礎(chǔ)與數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰻魚鲞、墨魚干、蝦仁干、鰩魚干，臺州市腌制水產(chǎn)品加工企業(yè);乙腈、正己烷、丙酮，均為色譜級，美國天地有限公司;N-二甲基亞硝胺標準品（1 000 mg/L），上海安譜實驗科技有限公司;氯化鈉、無水硫酸鎂（分析純），上海安譜實驗科技有限公司;石墨化炭黑（GCB、40 μm）、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18），上海安譜實驗科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Trace1300+TSQ8000Evo型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國賽默飛世爾科技公司;KS4000ic恒溫搖床，德國IKA公司;VOREX3旋渦混勻器，德國IKA公司;AllegraX-30R冷凍離心機，美國BECKMAN COULTER公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件。

色譜柱Hp-Innowax（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;升溫程序：40 ℃保留1 min，以10 ℃/min升至120 ℃，以20 ℃/min升至240 ℃;載氣：高純氦氣，純度大于99.999%;進樣模式：直接進樣;柱流速：1.0 mL/min;隔墊吹掃流量：50 mL/min，吹掃時間：1.5 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件。

電子轟擊離子化源：EI源;電壓70 ev;N-二甲基亞硝胺定量與定性離子：（m/z）74、42、43;離子源溫度：280 ℃;傳輸線溫度：280 ℃;選擇模式：離子監(jiān)測（SIM）模式。

1.3.3 標準溶液及標準曲線的繪制。

稱取標準樣品10 mg，通過乙腈將標準溶液儲備液稀釋配制成0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、1.50 μg/mL系列濃度，分別進樣進行測定，繪制基質(zhì)匹配標準曲線。再以4種水產(chǎn)品干制品空白基質(zhì)提取液稀釋成0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、1.50 μg/mL系列濃度梯度的溶劑標準溶液，繪制溶劑標準曲線，用以評定N-二甲基亞硝胺檢測過程中的基質(zhì)效應[9]，經(jīng)測定得到基質(zhì)標準曲線和溶劑標準曲線，二者斜率的比值為基質(zhì)效應的強弱[10]。

1.3.4 QuEChERS前處理。

樣品前處理方法參考范廣宇等[11]對水產(chǎn)品樣品前處理方法，稱取10 g樣品，加入 10.0 mL 乙腈（含有0.5%冰乙酸），渦旋振蕩2 min，加入 4.0 g無水 MgSO4 和1.0 g NaCl，渦旋振蕩2 min，4 000 r/min進行離心 5 min。移取上清液1 mL，加入150 mg無水MgSO4和50 mg C18，振蕩30 s后于3 500 r/min條件下進行離心5 min，移取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜后裝進樣小瓶上機測樣。

1.3.5 萃取率的測定。

試驗采用Xie等[12]的方法利用回收率對萃取率進行評價，其計算公式為：回收率=CS-CpCa×100%，

式中，CS為N-二甲基亞硝胺添加到樣品（不含標樣）中所測得實際含量（μg/kg）;Cp為空白樣品中N-二甲基亞硝胺的含量（μg/kg）;Ca為N-二甲基亞硝胺的標準添加含量（μg/kg）。

1.3.6 試劑樣品的測定。

生產(chǎn)基地成品庫隨機抽樣的干制水產(chǎn)品鰻魚鲞、墨魚干、蝦仁干、鰩魚干，按照優(yōu)化后前處理方法進行處理和氣相質(zhì)譜分析測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇。

研究結(jié)果表明提取溶劑會對N-二甲基亞硝胺含量的檢測產(chǎn)生較大的影響，因此該試驗在樣品預處理前進行提取溶劑的選擇。將正己烷、丙酮和乙腈作為提取溶劑進行篩選與選擇，試驗結(jié)果表明（圖1），正己烷對目標物質(zhì)的提取率較低，平均回收率為67%;丙酮和乙腈對上述物質(zhì)的提取效果較好且回收率均較高，但是丙酮提取的雜質(zhì)較多極易溶解大分子物質(zhì)如色素和油脂等，使色譜圖上的雜質(zhì)峰較多，為后續(xù)的物質(zhì)凈化帶來困難。因此該試驗采用乙腈作為提取溶劑，而0.5%冰乙酸的加入掩蔽了色譜系統(tǒng)的活性，進一步改善了峰型及響應值[13]。

2.1.2 鹽析和脫水劑的選擇。

經(jīng)過溶液的提取，水產(chǎn)品的干制品中的N-二甲基亞硝胺進入提取層乙腈中，由于乙腈微溶于水，使提取液中少量水分后續(xù)分離操作困難。該試驗通過對比無水MgSO4和NaCl的不同添加量（5 g+0 g、4 g+1 g、3 g+2 g、0 g+5 g）對N-二甲基亞硝胺提取效率的影響，試驗結(jié)果通過離心后樣品分層情況可知當無水MgSO4和NaCl的添加量為4 g+1 g時分離效果更好。NaCl通過降低水溶性雜質(zhì)的存在，進而減少了提取液中干擾基質(zhì)的含量，而通過無水MgSO4可更快除去乙腈中的水分及鹽析后的水相層[14-15]，因此該試驗采用4 g無水MgSO4和1 g NaCl的添加量。

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