豬DKK2基因的多態(tài)性與母豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析

周佳偉 喬木 吳俊靜 王孝忠 劉貴生 梅書棋 彭先文

摘要：母豬的繁殖性狀是豬重要經(jīng)濟性狀之一，但由于其遺傳力低，導(dǎo)致母豬繁殖性狀常規(guī)選擇進展緩慢。通過SANGER測序的方法檢測DKK2基因內(nèi)SNP位點，并與產(chǎn)仔數(shù)性狀進行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，在DKK2基因第二內(nèi)含子存在一個新SNP位點，根據(jù)SNP命名方法將其命名為8：g.114967878A>G.且該SNP位點與產(chǎn)活仔數(shù)性狀顯著相關(guān)。豬DKK2基因的新SNP位點8：g.114967878A>G對豬的產(chǎn)活仔數(shù)性狀存在潛在的調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞：豬;DKK2;SNP;產(chǎn)仔數(shù)

中圖分類號：S828;Q343.1+5

文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114[ 2020） 20-0138-03

DOl：10.1408 8/j .cnki.issn0439-8114.2020.20.031

母豬生產(chǎn)力直接影響豬場經(jīng)濟效益，產(chǎn)仔數(shù)性狀是衡量母豬生產(chǎn)力的一個主要指標。然而總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)的遺傳力只有0.09，屬于低遺傳力性狀[1]，導(dǎo)致母豬繁殖性狀常規(guī)選擇進展緩慢。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，常規(guī)育種與標記輔助選擇（MAS）相結(jié)合的方法有效地加快了豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的選擇進展。通過候選基因法和基因組掃描的方法篩選出多個與產(chǎn)仔數(shù)性狀相關(guān)的分子標記，如雌激素受體（Estrogen receptor，ESR）、卵泡刺激素p亞基（Follicle stimulating hormone p subunit， FSH[3）和視黃醇結(jié)合蛋白4（ Retinol binding protein 4，RBP4）基因等[2-4]，但仍然有很多與產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SNP位點有待挖掘。

DKK（Dickkopf）蛋白家族是WNT信號通路的負調(diào)控因子，主要成員有DKK1、DKK2、DKK3和DKK4。DKK2和DKK4蛋白可結(jié)合LRP5/6，抑制WNT信號[5]。研究發(fā)現(xiàn)DKK2在上皮性卵巢癌細胞中顯著下調(diào)，且在上皮性卵巢癌細胞中DKK2具有更高甲基化水平，超表達DKK2顯著抑制卵巢癌細胞的生長和遷移[6]。DKK2在出生后2ld內(nèi)的小鼠卵巢中表達，但在完全生長卵母細胞、排出卵母細胞以及發(fā)育早期胚胎中不表達，說明了DKK2是由顆粒細胞合成，且在卵母細胞與顆粒細胞對話中起著重要作用[7]。

研究表明，利用Affyetrix公司豬基因組芯片檢測大白豬和二花臉豬排卵前卵泡中差異表達的基因[8]，發(fā)現(xiàn)DKK2基因呈現(xiàn)差異表達，通過性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)DKK2基因啟動子區(qū)的c.-1130 T>C與中國瘦肉豬新品系產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān);通過雙熒光、EM-SA、ChIP驗證DKK2 c.-1130 T>C位點影響C/EBP[3與DKK2啟動子的結(jié)合能力，位點為T時，DKK2基因啟動子活性極顯著增強，抑制WNT通路基因表達[9]。本研究以DKK2基因為研究對象，探究DKK2基因內(nèi)與產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SNP位點，為母豬產(chǎn)仔數(shù)的遺傳改良提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

采集湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所和湖北天之力優(yōu)質(zhì)豬育種有限公司聯(lián)合培育的黑豬新品系417頭母豬的耳組織樣品，且所有個體均記錄了總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)。使用標準苯酚氯仿萃取法提取基因組DNA，保存于-20℃。

1.2 PCR擴增

根據(jù)豬DKK2基因的基因組序列（GenBank：NC_010450.4）設(shè)計引物，引物序列見表1。50 μLPCR反應(yīng)體系為：100 ng模板DNA、lOxBuffer（含Mg2+）5 μL、上下游引物各0.5 μmol/L、2.5 μmol/LdNTPs、1 UTaq DNA聚合酶，ddH2O補足至50 μL。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45 s，35個循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用生工生物工程（上海）股份有限公司的Gel Extraction Kit試劑盒進行純化;將回收后的PCR產(chǎn)物交由北京奧科鼎盛生物科技有限公司i井行SANGER測序。

1.3 群體關(guān)聯(lián)分析

采用SAS 9.1軟件中一般線性模型將417頭黑豬新品系DKK2基因8：g.114967878A>C位點的基因型與產(chǎn)仔數(shù)性狀進行關(guān)聯(lián)分析。同時采用REC程序計算基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)，并進行顯著性檢驗，所采用模型為Yij=+ Gi+Fj+ei，其中，Yij為性狀表型值，μ為平均值，G為基因型效應(yīng)（包括基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng);加性效應(yīng)用1、0和一1分別代表AA、AC和CC基因型，顯性效應(yīng)用1、一1和1分別代表AA、AG和CC基因型）;Fj為豬場綜合效應(yīng);eij為殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DKK2基因8：g.114967878A>G位點在黑豬新品系中的等位基因頻率

通過SANCER測序檢測417頭黑豬新品系DNA樣品中DKK2基因的SNP位點，在DKK2基因第二內(nèi)含子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一個新的A>C突變的SNP位點（圖1），將其命名為8：g.114967878A>G，并計算該位點的基因型頻率和等位基因頻率。結(jié)果（表2）表明，在黑豬新品系中DKK2基因8：g.114967878A>C位點表現(xiàn)為AA、AG或GG 3種基因型，A等位基因頻率為0.9，是優(yōu)勢等位基因，通過卡方檢驗發(fā)現(xiàn)8：g.114967878A>G位點在黑豬新品系中均符合哈代溫伯格平衡（P>0.05）。2.2 DKK2基因8：g.114967878A>G位點與產(chǎn)仔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析

417頭黑豬新品系DKK2基因8：g.114967878A>C位點的基因型與產(chǎn)仔數(shù)性狀進行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果（表3）表明，黑豬新品系中8：g.114967878A>C位點的GG基因型的產(chǎn)活仔數(shù)顯著少于AA基因型和AG基因型（P<0.05），且顯性效應(yīng)達到顯著水平（P<0.05），但該SNP位點在黑豬新品系中與總產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)性不顯著。

3 討論

母豬生產(chǎn)力直接影響豬場經(jīng)濟效益，產(chǎn)仔數(shù)性狀是衡量母豬生產(chǎn)力的一個主要指標。豬DKK2基因是通過基因芯片及EST策略鑒定的新基因，且在大白豬和二花臉豬排卵前卵泡中差異表達[8]。豬DKK2基因定位在8號染色體長臂末端SSC8： 123，274， 617-123， 279， 223（ Ensembl Sscrofa10.2）.通過pig QTL database查詢，在DKK2基因附近（SSC8的107.5 cM）存在排卵數(shù)性狀的QTL，加性效應(yīng)為3.07[10，11]。因此，DKK2可能為該排卵率QTL的位置候選基因。性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)DKK2基因啟動子區(qū)的c.-1130 T>C與中國瘦肉豬新品系產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān);且該SNP位點通過影響DKK2基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控卵泡發(fā)育。

本研究通過SANCER測序方法鑒定出DKK2基因第二內(nèi)含子內(nèi)的一個新SNP位點，并將其與產(chǎn)仔數(shù)性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)該SNP位點的CC基因型的產(chǎn)活仔數(shù)顯著少于AA基因型和AG基因型（P<0.05），且顯性效應(yīng)達到顯著水平（P<0.05），為母豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的遺傳改良提供了新靶點。

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作者簡介：周佳偉（1989-），男，江西瑞昌人，助理研究員，博士，主要從事豬遺傳育種研究，（電話）18674037082（電子信箱）422374839@qq.com;

通信作者，彭先文（1974-），男，研究員，主要從事豬遺傳育種研究，（電子信箱）pXWPal@163.com。