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    放線菌篩選及降解光氧化褐煤工藝條件研究

    2020-12-21 10:39:12李建濤劉向榮莊肅凱
    潔凈煤技術(shù) 2020年6期
    關(guān)鍵詞:煤量褐煤放線菌

    李建濤,劉向榮,石 晨,莊肅凱

    (1.商洛學(xué)院 化學(xué)工程與現(xiàn)代材料學(xué)院,陜西 商洛 726000;2.陜西省尾礦綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 商洛 726000;3.西安科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院,陜西 西安 710054)

    0 引 言

    煤的微生物降解是繼煤液化、氣化之后的新技術(shù),是具有發(fā)展前景的低階煤清潔高效利用的途徑之一[1-3]。煤的微生物降解(或稱微生物溶煤,煤的微生物轉(zhuǎn)化)指利用真菌、細(xì)菌和放線菌等微生物作用來(lái)實(shí)現(xiàn)煤的溶解、降解、液化或氣化,以獲取清潔燃料和其他化學(xué)品[4-5]。20世紀(jì)80年代,F(xiàn)akoussa R M[6]和Cohen M S[7]研究表明假單胞菌和白腐菌能夠降解煤。經(jīng)過(guò)近40年的發(fā)展,煤的微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)取得了較大成果,但也存在很多難題,如:微生物對(duì)煤的降解率低、缺乏高效降解菌、煤的預(yù)處理方式有待改進(jìn)、降解產(chǎn)物難以分離、高附加值利用途徑少、降解機(jī)理不明等,在一定程度上阻礙了煤微生物降解技術(shù)的工業(yè)化進(jìn)程。其中,微生物對(duì)煤的降解率低、高效降解菌缺乏是最基本的問(wèn)題[8-10]。袁紅莉等[11]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),自然界褐煤在風(fēng)化降解過(guò)程中,不同時(shí)期微生物類群存在明顯的演替現(xiàn)象,即放線菌為褐煤風(fēng)化初期的主要作用菌,隨之是細(xì)菌,真菌在褐煤風(fēng)化后期起主要作用??梢?,煤的微生物降解是分步進(jìn)行的,多種菌在不同階段起不同作用的協(xié)同過(guò)程。

    本文設(shè)想建立煤的微生物分級(jí)降解方法,以實(shí)現(xiàn)微生物對(duì)煤的協(xié)同作用和高效降解。首先篩選出能夠降解低階煤的放線菌菌株,并利用單因素方法研究降解條件,為低階煤分級(jí)降解方法的建立提供支撐。

    1 試 驗(yàn)

    1.1 煤樣及預(yù)處理

    試驗(yàn)用煤樣為內(nèi)蒙勝利褐煤(SLH)、云南昭通褐煤(ZTH)、山西渾源褐煤(HYH)和內(nèi)蒙元寶山褐煤(YBH),各煤樣在60 ℃下烘干3 h,經(jīng)破碎、粉磨、篩分得到粒度為0.150~0.075 mm 的煤樣。由于微生物對(duì)原煤的降解效果較差,因此在降解前需現(xiàn)對(duì)原煤進(jìn)行預(yù)處理,以提高煤的含氧量,從而提高煤的微生物可降解性。本文利用自行設(shè)計(jì)加工的旋轉(zhuǎn)床光化學(xué)反應(yīng)器[12]分別對(duì)各煤樣進(jìn)行光氧化預(yù)處理,預(yù)處理最佳條件為:加煤量20 g,煤樣粒度0.150~0.075 mm,紫外光強(qiáng)度150 W,馬達(dá)轉(zhuǎn)速120 r/min,氧化時(shí)間42 h,通氧時(shí)間40 min,得到光氧化后的煤樣,分別記為GSLH、GZTH、GHYH和GYBH。光氧化褐煤的工業(yè)分析和元素分析結(jié)果見表1。對(duì)各光氧化煤樣進(jìn)行低溫氮吸附檢測(cè),GSLH、GZTH、GHYH和GYBH的比表面積分別為4.156 8、3.636 3、3.399 3、3.796 9 m2/g。

    表1 煤樣的工業(yè)分析和元素分析

    1.2 菌株及復(fù)壯

    1)菌株及培養(yǎng)基

    試驗(yàn)用5株放線菌購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC,表2),培養(yǎng)基為高氏一號(hào)培養(yǎng)基:可溶性淀粉20 g,KNO31 g,K2HPO40.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,NaCl 0.5 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g,固體培養(yǎng)基加瓊脂15 g,蒸餾水 1 000 mL,pH=7.4~7.6。

    表2 試驗(yàn)菌種

    2)菌株活化及復(fù)壯

    將4 ℃甘油保藏的放線菌(黃微綠鏈霉菌(SF)、綠孢鏈霉菌(SV)、奇跡絲束放線菌(AM)、細(xì)黃鏈霉菌(SM)和菲律賓擬孢囊菌(KP))分別接種至裝有10 mL高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基的試管中,將試管放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱,在28 ℃、振蕩頻率160 r/min條件下培養(yǎng)4 d;然后在預(yù)先倒好的高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板上分別劃線,倒置于人工氣候培養(yǎng)箱,在28 ℃、相對(duì)濕度80%條件下培養(yǎng)4 d,觀察無(wú)雜菌后,分別用接種針挑少量菌體放入50 mL無(wú)菌水中充分振蕩,用接種環(huán)蘸取一孔接種于裝有10 mL高氏一號(hào)培養(yǎng)基的試管中,將試管放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱,在28 ℃、振蕩頻率160 r/min條件下培養(yǎng)4 d后,用接種環(huán)蘸取一孔接種至裝有100 mL高氏一號(hào)培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱,相同條件培養(yǎng)4 d,得到5種放線菌菌液作為篩選試驗(yàn)?zāi)妇骸?/p>

    1.3 菌-煤匹配篩選試驗(yàn)

    取試管若干,每個(gè)試管中裝高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基20 mL,分別做無(wú)菌的空白對(duì)照試驗(yàn)和5種放線菌對(duì)4種光氧化褐煤的降解試驗(yàn)。除空白以外的試管,分別用接種環(huán)蘸取復(fù)壯好的5種放線菌一孔接種,放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱,溫度28 ℃,振蕩頻率160 r/min,培養(yǎng)4 d,接種的培養(yǎng)基變渾濁。試管分別加(0.16±0.000 2)g、粒度為0.150~0.075 mm的煤樣,放入恒溫培養(yǎng)箱,繼續(xù)振蕩培養(yǎng)20 d,每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3組平行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)束后,3組平行試驗(yàn)的降解產(chǎn)物分別離心(10 000 r/min,10 min),上清液過(guò)濾,濾液過(guò)0.22 μm微孔濾膜,以去離子水為參比,利用TU-1900型紫外-可見分光光度計(jì)檢測(cè)濾液在450 nm處的吸光度,求得3組平行試驗(yàn)的A450平均值,作為指標(biāo)。比較5種放線菌對(duì)光氧化褐煤降解液吸光度,A450最大者為優(yōu)勢(shì)菌株。

    煤樣經(jīng)微生物降解后,液體中含有煤降解產(chǎn)物而呈黑色,其對(duì)光束存在一定的散射和吸收作用,因此,利用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定黑色降解液在波長(zhǎng)為450 nm處的吸光度A450,并以此作為降解效果指標(biāo),對(duì)微生物降解煤的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)降解液的A450值來(lái)判斷微生物降解煤的效果是基于大量的紫外連續(xù)掃描數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)方法得到,而不是煤炭微生物降解所得液體產(chǎn)物的特征吸收波長(zhǎng)[13-15]。

    1.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    影響微生物液體降解煤效果的因素繁多,其中最重要的影響因素有煤種、菌種、煤樣預(yù)處理方式、加煤量、煤樣粒度、接種量、培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間(降解時(shí)間)、培養(yǎng)溫度(降解溫度)和培養(yǎng)箱振蕩頻率等。選用GSLH,煤樣預(yù)處理方式采用光氧化預(yù)處理。菌種為1.3篩選的優(yōu)勢(shì)放線菌,培養(yǎng)基為高氏一號(hào)培養(yǎng)基,煤樣粒度為光氧化預(yù)處理過(guò)程確定的最佳粒度(0.150~0.075 mm),培養(yǎng)溫度為CGMCC提供的該微生物生長(zhǎng)的最適宜溫度28 ℃,對(duì)加煤量、接種量、培養(yǎng)時(shí)間和振蕩頻率4個(gè)條件進(jìn)行探討,確定最佳值。

    1)加煤量的確定

    分別稱取0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 g GSLH煤樣,稱準(zhǔn)至0.000 2 g,煤樣粒度0.150~0.075 mm,液體培養(yǎng)基20 mL接種SV母菌液2.0 mL,培養(yǎng)箱溫度28 ℃,振蕩頻率為160 r/min,培養(yǎng)14 d,每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3組平行試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束后,3組平行試驗(yàn)的降解產(chǎn)物分別離心(10 000 r/min,15 min),上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,以去離子水為參比,檢測(cè)濾液在450 nm處的吸光度A450,求得3組平行試驗(yàn)的A450平均值作為指標(biāo)。A450最大者對(duì)應(yīng)的加煤量確定為最佳加煤量。

    2)接種量的確定

    取最佳加煤量,煤樣粒度0.150~0.075 mm,液體培養(yǎng)基20 mL接種SV母菌液,接種量分別取1.0、1.4、2.0、2.4、3.0、3.4和4.0 mL,培養(yǎng)箱溫度28 ℃,振蕩頻率160 r/min,培養(yǎng)14 d,每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3組平行試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束后,3組平行試驗(yàn)的降解產(chǎn)物分別離心(10 000 r/min,15 min),上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,檢測(cè)濾液在450 nm處的吸光度,求得3組平行試驗(yàn)的A450平均值作為指標(biāo)。A450最大者對(duì)應(yīng)的接種量確定為最佳接種量。

    3)培養(yǎng)時(shí)間的確定

    取最佳加煤量,液體培養(yǎng)基20 mL接種SV母菌液,取最佳接種量,煤樣粒度0.150~0.075 mm,培養(yǎng)箱溫度28 ℃,振蕩頻率160 r/min,培養(yǎng)時(shí)間分別確6、8、10、12、14和16 d,每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3組平行試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束后,3組平行試驗(yàn)的降解產(chǎn)物分別離心(10 000 r/min,15 min),上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,檢測(cè)濾液在450 nm處的吸光度,求得3組平行試驗(yàn)的A450平均值作為指標(biāo)。A450最大者對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間確定為最佳培養(yǎng)時(shí)間。

    4)振蕩頻率的確定

    分別取最佳的加煤量、接種量和培養(yǎng)時(shí)間,液體培養(yǎng)基20 mL接種SV母菌液,煤樣粒度0.150~0.075 mm,培養(yǎng)箱溫度28 ℃,培養(yǎng)箱振蕩頻率分別取60、110、160、210和260 r/min,每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3組平行試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束后,3組平行試驗(yàn)分別離心(10 000 r/min,15 min),上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,檢測(cè)降解液在450 nm處的吸光度,求得3組平行試驗(yàn)的A450平均值作為指標(biāo),A450最大者對(duì)應(yīng)的振蕩頻率確定為最佳振蕩頻率。

    1.5 3種褐煤的降解試驗(yàn)

    利用菌株篩選試驗(yàn)確定的降解菌,根據(jù)單因素確定的菌株降解GSLH的最佳工藝條件對(duì)GZTH、GHYH和GYBH進(jìn)行降解試驗(yàn),每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3組平行試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束后,3組平行試驗(yàn)分別離心(10 000 r/min,15 min),上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,以去離子水為參比,檢測(cè)降解液在450 nm處的吸光度,求得3組平行試驗(yàn)的A450平均值作為指標(biāo),評(píng)價(jià)降解效果。

    2 結(jié)果及討論

    2.1 菌株篩選結(jié)果

    圖1為菌-煤匹配試驗(yàn)結(jié)果,其中C表示培養(yǎng)基對(duì)光氧化褐煤在相同條件下的溶煤液吸光度A450,SF、SV、AM、SM和KP表示5種放線菌對(duì)GSLH、GZTH、GHYH和GYBH的降解液吸光度A450。

    圖1 5種放線菌降解褐煤結(jié)果

    由圖1可見,4種光氧化褐煤在培養(yǎng)基中的溶解均較少,5種放線菌對(duì)GSLH的降解能力強(qiáng)弱順序?yàn)镾V>AM>SF>SM>KP,對(duì)GZTH的降解能力強(qiáng)弱順序?yàn)镾V>AM>SF>SM>KP,對(duì)GHYH的降解能力強(qiáng)弱順序?yàn)镾V>KP>AM>SF>SM,對(duì)GYBH的降解能力強(qiáng)弱順序?yàn)镾V>AM>SM>SF>KP。由此可見,雖然降解能力的變化程度不一,順序略有差別,但5種放線菌對(duì)4種光氧化褐煤的降解能力最強(qiáng)者均為綠孢鏈霉菌(SV)。因此確定綠孢鏈霉菌(SV)為光氧化低階煤的優(yōu)勢(shì)放線菌菌株(圖2)。將1.2節(jié)中活化復(fù)壯的綠孢鏈霉菌母菌液在530 nm處的吸光度[16-17],代入已確定的菌濃度-吸光度關(guān)系方程,計(jì)算得到菌濃度為3.7105cfu/mL。

    圖2 綠孢鏈霉菌形貌

    2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    1)加煤量

    圖3為加煤量對(duì)綠孢鏈霉菌降解光氧化內(nèi)蒙勝利褐煤降解液吸光度的影響,可知,隨著加煤量增加,A450值先增后減,加煤量為0.2 g(以20 mL培養(yǎng)基計(jì),下同)時(shí),A450達(dá)最大值,為2.437,加煤量大于0.3 g后,A450值急劇下降。可能是因?yàn)榧用毫枯^少時(shí),菌株分泌的降解煤活性物質(zhì)與煤中相應(yīng)的活性點(diǎn)充分作用后還有剩余,雖然降解率達(dá)極大值,但降解產(chǎn)物濃度相對(duì)較低;當(dāng)加煤量為0.2 g時(shí),菌株生長(zhǎng)過(guò)程中分泌的降解煤活性物質(zhì)與煤中的活性點(diǎn)相互作用程度較充分,雖可能未達(dá)到加煤量為0.1 g時(shí)的降解率,但由于二者相互作用充分,使相同體積情況下的降解產(chǎn)物濃度較大,故而A450值較大;繼續(xù)增大加煤量,由于煤漿濃度過(guò)大會(huì)抑制菌株的生長(zhǎng),導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)不旺盛,分泌降解煤活性物質(zhì)減少,引起A450值減小。因此,20 mL培養(yǎng)基的最佳加煤量為0.2 g。

    圖3 加煤量對(duì)降解液吸光度的影響

    2)接種量

    圖4為接種量對(duì)綠孢鏈霉菌降解光氧化內(nèi)蒙勝利褐煤降解液吸光度的影響,可以看出,隨著接種量增大,降解液的吸光度A450迅速增大,當(dāng)接種量達(dá)2.0 mL 時(shí),降解液的A450值達(dá)2.541,繼續(xù)增大接種量,A450值增加緩慢,接種量達(dá)3.0 mL后,A450值變化甚微,故最佳接種量確定為3.0 mL。

    圖4 接種量對(duì)降解液吸光度的影響

    3)培養(yǎng)時(shí)間

    圖5為培養(yǎng)時(shí)間對(duì)綠孢鏈霉菌降解光氧化內(nèi)蒙勝利褐煤降解液吸光度的影響,可見,隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),降解液的吸光度A450值逐漸增大,10 d后,繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)降解液吸光度的影響不大,因此最佳培養(yǎng)時(shí)間確定為10 d。

    圖5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)降解液吸光度的影響

    4)振蕩頻率

    圖6為培養(yǎng)箱振蕩頻率對(duì)綠孢鏈霉菌降解光氧化內(nèi)蒙勝利褐煤降解液吸光度的影響,可見,隨著振蕩頻率增大,A450值先增大后減小,最大值2.624出現(xiàn)在轉(zhuǎn)速160 r/min。這可能是因?yàn)殡S著振蕩頻率增大,培養(yǎng)基的氣液界面交替更頻繁,使培養(yǎng)基中溶解的氧相對(duì)較多,有利于綠孢菌的生長(zhǎng)繁衍,綠孢菌可分泌出較多的活性物質(zhì),有利于煤的降解;此外,振蕩頻率越大,降解煤活性物質(zhì)與煤中的活性作用點(diǎn)接觸更充分。振蕩頻率過(guò)大時(shí),雖有利于氧氣的溶解及降解煤活性物質(zhì)與煤中活性點(diǎn)的充分接觸,但劇烈的振蕩可能導(dǎo)致綠孢菌生長(zhǎng)的不適應(yīng),從而使得綠孢菌產(chǎn)生降解煤活性物的能力降低,降解效果變差。因此,培養(yǎng)箱振蕩頻率確定為160 r/min。

    圖6 振蕩頻率對(duì)降解液吸光度的影響

    2.3 3種褐煤的降解效果

    圖7為在單因素確定的最佳工藝條件下,綠孢鏈霉菌對(duì)GZTH、GHYH和GYBH降解試驗(yàn)結(jié)果??梢?,綠孢鏈霉菌對(duì)3種光氧化褐煤的降解液吸光度分別為2.937、2.062和1.649,比菌煤匹配試驗(yàn)對(duì)應(yīng)的降解液吸光度(2.779、1.798和1.464)均有提高。經(jīng)單因素試驗(yàn)確定的綠孢鏈霉菌降解GSLH的最佳條件是綠孢鏈霉菌降解GZTH、GHYH和 GHYH的較優(yōu)工藝條件,該工藝條件具有一定的普適性。

    圖7 3種光氧化褐煤的降解液450 nm吸光度值

    3 結(jié) 論

    1)菌-煤匹配試驗(yàn)篩選出的降解光氧化褐煤的優(yōu)勢(shì)放線菌菌株為綠孢鏈霉菌。

    2)經(jīng)單因素試驗(yàn)確定的綠孢鏈霉菌降解光氧化內(nèi)蒙勝利褐煤的最佳工藝條件為:20 mL培養(yǎng)基的加煤量和接種量分別為0.2 g和3.0 mL,降解時(shí)間為10 d,培養(yǎng)箱振蕩頻率為160 r/min,煤樣粒度為0.150~0.075 mm,降解溫度為28 ℃。

    3)按照單因素確定的最佳工藝條件,利用綠孢鏈霉菌對(duì)光氧化云南昭通褐煤、光氧化山西渾源褐煤和光氧化內(nèi)蒙元寶山褐煤進(jìn)行降解試驗(yàn),結(jié)果表明降解效果均有一定程度的提升,可見該條件是這3種光氧化褐煤的較優(yōu)降解條件。

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