放線菌篩選及降解光氧化褐煤工藝條件研究

李建濤，劉向榮，石 晨，莊肅凱

(1.商洛學(xué)院 化學(xué)工程與現(xiàn)代材料學(xué)院，陜西 商洛 726000；2.陜西省尾礦綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 商洛 726000；3.西安科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 西安 710054)

0 引 言

煤的微生物降解是繼煤液化、氣化之后的新技術(shù)，是具有發(fā)展前景的低階煤清潔高效利用的途徑之一[1-3]。煤的微生物降解(或稱微生物溶煤，煤的微生物轉(zhuǎn)化)指利用真菌、細(xì)菌和放線菌等微生物作用來(lái)實(shí)現(xiàn)煤的溶解、降解、液化或氣化，以獲取清潔燃料和其他化學(xué)品[4-5]。20世紀(jì)80年代，F(xiàn)akoussa R M[6]和Cohen M S[7]研究表明假單胞菌和白腐菌能夠降解煤。經(jīng)過(guò)近40年的發(fā)展，煤的微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)取得了較大成果，但也存在很多難題，如：微生物對(duì)煤的降解率低、缺乏高效降解菌、煤的預(yù)處理方式有待改進(jìn)、降解產(chǎn)物難以分離、高附加值利用途徑少、降解機(jī)理不明等，在一定程度上阻礙了煤微生物降解技術(shù)的工業(yè)化進(jìn)程。其中，微生物對(duì)煤的降解率低、高效降解菌缺乏是最基本的問(wèn)題[8-10]。袁紅莉等[11]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，自然界褐煤在風(fēng)化降解過(guò)程中，不同時(shí)期微生物類群存在明顯的演替現(xiàn)象，即放線菌為褐煤風(fēng)化初期的主要作用菌，隨之是細(xì)菌，真菌在褐煤風(fēng)化后期起主要作用?？梢?，煤的微生物降解是分步進(jìn)行的，多種菌在不同階段起不同作用的協(xié)同過(guò)程。

本文設(shè)想建立煤的微生物分級(jí)降解方法，以實(shí)現(xiàn)微生物對(duì)煤的協(xié)同作用和高效降解。首先篩選出能夠降解低階煤的放線菌菌株，并利用單因素方法研究降解條件，為低階煤分級(jí)降解方法的建立提供支撐。

1 試 驗(yàn)

1.1 煤樣及預(yù)處理

試驗(yàn)用煤樣為內(nèi)蒙勝利褐煤(SLH)、云南昭通褐煤(ZTH)、山西渾源褐煤(HYH)和內(nèi)蒙元寶山褐煤(YBH)，各煤樣在60 ℃下烘干3 h，經(jīng)破碎、粉磨、篩分得到粒度為0.150～0.075 mm 的煤樣。由于微生物對(duì)原煤的降解效果較差，因此在降解前需現(xiàn)對(duì)原煤進(jìn)行預(yù)處理，以提高煤的含氧量，從而提高煤的微生物可降解性。本文利用自行設(shè)計(jì)加工的旋轉(zhuǎn)床光化學(xué)反應(yīng)器[12]分別對(duì)各煤樣進(jìn)行光氧化預(yù)處理，預(yù)處理最佳條件為：加煤量20 g，煤樣粒度0.150～0.075 mm，紫外光強(qiáng)度150 W，馬達(dá)轉(zhuǎn)速120 r/min，氧化時(shí)間42 h，通氧時(shí)間40 min，得到光氧化后的煤樣，分別記為GSLH、GZTH、GHYH和GYBH。光氧化褐煤的工業(yè)分析和元素分析結(jié)果見表1。對(duì)各光氧化煤樣進(jìn)行低溫氮吸附檢測(cè)，GSLH、GZTH、GHYH和GYBH的比表面積分別為4.156 8、3.636 3、3.399 3、3.796 9 m2/g。

表1 煤樣的工業(yè)分析和元素分析

1.2 菌株及復(fù)壯

1)菌株及培養(yǎng)基

試驗(yàn)用5株放線菌購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC，表2)，培養(yǎng)基為高氏一號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，固體培養(yǎng)基加瓊脂15 g，蒸餾水 1 000 mL，pH=7.4～7.6。

表2 試驗(yàn)菌種

2)菌株活化及復(fù)壯

將4 ℃甘油保藏的放線菌(黃微綠鏈霉菌(SF)、綠孢鏈霉菌(SV)、奇跡絲束放線菌(AM)、細(xì)黃鏈霉菌(SM)和菲律賓擬孢囊菌(KP))分別接種至裝有10 mL高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基的試管中，將試管放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱，在28 ℃、振蕩頻率160 r/min條件下培養(yǎng)4 d；然后在預(yù)先倒好的高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板上分別劃線，倒置于人工氣候培養(yǎng)箱，在28 ℃、相對(duì)濕度80%條件下培養(yǎng)4 d，觀察無(wú)雜菌后，分別用接種針挑少量菌體放入50 mL無(wú)菌水中充分振蕩，用接種環(huán)蘸取一孔接種于裝有10 mL高氏一號(hào)培養(yǎng)基的試管中，將試管放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱，在28 ℃、振蕩頻率160 r/min條件下培養(yǎng)4 d后，用接種環(huán)蘸取一孔接種至裝有100 mL高氏一號(hào)培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱，相同條件培養(yǎng)4 d，得到5種放線菌菌液作為篩選試驗(yàn)?zāi)妇骸?/p>

1.3 菌-煤匹配篩選試驗(yàn)

取試管若干，每個(gè)試管中裝高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基20 mL，分別做無(wú)菌的空白對(duì)照試驗(yàn)和5種放線菌對(duì)4種光氧化褐煤的降解試驗(yàn)。除空白以外的試管，分別用接種環(huán)蘸取復(fù)壯好的5種放線菌一孔接種，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱，溫度28 ℃，振蕩頻率160 r/min，培養(yǎng)4 d，接種的培養(yǎng)基變渾濁。試管分別加(0.16±0.000 2)g、粒度為0.150～0.075 mm的煤樣，放入恒溫培養(yǎng)箱，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)20 d，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3組平行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)束后，3組平行試驗(yàn)的降解產(chǎn)物分別離心(10 000 r/min，10 min)，上清液過(guò)濾，濾液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，以去離子水為參比，利用TU-1900型紫外-可見分光光度計(jì)檢測(cè)濾液在450 nm處的吸光度，求得3組平行試驗(yàn)的A450平均值，作為指標(biāo)。比較5種放線菌對(duì)光氧化褐煤降解液吸光度，A450最大者為優(yōu)勢(shì)菌株。

煤樣經(jīng)微生物降解后，液體中含有煤降解產(chǎn)物而呈黑色，其對(duì)光束存在一定的散射和吸收作用，因此，利用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定黑色降解液在波長(zhǎng)為450 nm處的吸光度A450，并以此作為降解效果指標(biāo)，對(duì)微生物降解煤的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)降解液的A450值來(lái)判斷微生物降解煤的效果是基于大量的紫外連續(xù)掃描數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)方法得到，而不是煤炭微生物降解所得液體產(chǎn)物的特征吸收波長(zhǎng)[13-15]。

1.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

影響微生物液體降解煤效果的因素繁多，其中最重要的影響因素有煤種、菌種、煤樣預(yù)處理方式、加煤量、煤樣粒度、接種量、培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間(降解時(shí)間)、培養(yǎng)溫度(降解溫度)和培養(yǎng)箱振蕩頻率等。選用GSLH，煤樣預(yù)處理方式采用光氧化預(yù)處理。菌種為1.3篩選的優(yōu)勢(shì)放線菌，培養(yǎng)基為高氏一號(hào)培養(yǎng)基，煤樣粒度為光氧化預(yù)處理過(guò)程確定的最佳粒度(0.150～0.075 mm)，培養(yǎng)溫度為CGMCC提供的該微生物生長(zhǎng)的最適宜溫度28 ℃，對(duì)加煤量、接種量、培養(yǎng)時(shí)間和振蕩頻率4個(gè)條件進(jìn)行探討，確定最佳值。

1)加煤量的確定

分別稱取0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 g GSLH煤樣，稱準(zhǔn)至0.000 2 g，煤樣粒度0.150～0.075 mm，液體培養(yǎng)基20 mL接種SV母菌液2.0 mL，培養(yǎng)箱溫度28 ℃，振蕩頻率為160 r/min，培養(yǎng)14 d，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3組平行試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束后，3組平行試驗(yàn)的降解產(chǎn)物分別離心(10 000 r/min，15 min)，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，以去離子水為參比，檢測(cè)濾液在450 nm處的吸光度A450，求得3組平行試驗(yàn)的A450平均值作為指標(biāo)。A450最大者對(duì)應(yīng)的加煤量確定為最佳加煤量。

2)接種量的確定

取最佳加煤量，煤樣粒度0.150～0.075 mm，液體培養(yǎng)基20 mL接種SV母菌液，接種量分別取1.0、1.4、2.0、2.4、3.0、3.4和4.0 mL，培養(yǎng)箱溫度28 ℃，振蕩頻率160 r/min，培養(yǎng)14 d，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3組平行試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束后，3組平行試驗(yàn)的降解產(chǎn)物分別離心(10 000 r/min，15 min)，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，檢測(cè)濾液在450 nm處的吸光度，求得3組平行試驗(yàn)的A450平均值作為指標(biāo)。A450最大者對(duì)應(yīng)的接種量確定為最佳接種量。

3)培養(yǎng)時(shí)間的確定

取最佳加煤量，液體培養(yǎng)基20 mL接種SV母菌液，取最佳接種量，煤樣粒度0.150～0.075 mm，培養(yǎng)箱溫度28 ℃，振蕩頻率160 r/min，培養(yǎng)時(shí)間分別確6、8、10、12、14和16 d，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3組平行試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束后，3組平行試驗(yàn)的降解產(chǎn)物分別離心(10 000 r/min，15 min)，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，檢測(cè)濾液在450 nm處的吸光度，求得3組平行試驗(yàn)的A450平均值作為指標(biāo)。A450最大者對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間確定為最佳培養(yǎng)時(shí)間。

4)振蕩頻率的確定

分別取最佳的加煤量、接種量和培養(yǎng)時(shí)間，液體培養(yǎng)基20 mL接種SV母菌液，煤樣粒度0.150～0.075 mm，培養(yǎng)箱溫度28 ℃，培養(yǎng)箱振蕩頻率分別取60、110、160、210和260 r/min，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3組平行試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束后，3組平行試驗(yàn)分別離心(10 000 r/min，15 min)，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，檢測(cè)降解液在450 nm處的吸光度，求得3組平行試驗(yàn)的A450平均值作為指標(biāo)，A450最大者對(duì)應(yīng)的振蕩頻率確定為最佳振蕩頻率。

1.5 3種褐煤的降解試驗(yàn)

利用菌株篩選試驗(yàn)確定的降解菌，根據(jù)單因素確定的菌株降解GSLH的最佳工藝條件對(duì)GZTH、GHYH和GYBH進(jìn)行降解試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3組平行試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束后，3組平行試驗(yàn)分別離心(10 000 r/min，15 min)，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，以去離子水為參比，檢測(cè)降解液在450 nm處的吸光度，求得3組平行試驗(yàn)的A450平均值作為指標(biāo)，評(píng)價(jià)降解效果。

2 結(jié)果及討論

2.1 菌株篩選結(jié)果

圖1為菌-煤匹配試驗(yàn)結(jié)果，其中C表示培養(yǎng)基對(duì)光氧化褐煤在相同條件下的溶煤液吸光度A450，SF、SV、AM、SM和KP表示5種放線菌對(duì)GSLH、GZTH、GHYH和GYBH的降解液吸光度A450。

圖1 5種放線菌降解褐煤結(jié)果

由圖1可見，4種光氧化褐煤在培養(yǎng)基中的溶解均較少，5種放線菌對(duì)GSLH的降解能力強(qiáng)弱順序?yàn)镾V>AM>SF>SM>KP，對(duì)GZTH的降解能力強(qiáng)弱順序?yàn)镾V>AM>SF>SM>KP，對(duì)GHYH的降解能力強(qiáng)弱順序?yàn)镾V>KP>AM>SF>SM，對(duì)GYBH的降解能力強(qiáng)弱順序?yàn)镾V>AM>SM>SF>KP。由此可見，雖然降解能力的變化程度不一，順序略有差別，但5種放線菌對(duì)4種光氧化褐煤的降解能力最強(qiáng)者均為綠孢鏈霉菌(SV)。因此確定綠孢鏈霉菌(SV)為光氧化低階煤的優(yōu)勢(shì)放線菌菌株(圖2)。將1.2節(jié)中活化復(fù)壯的綠孢鏈霉菌母菌液在530 nm處的吸光度[16-17]，代入已確定的菌濃度-吸光度關(guān)系方程，計(jì)算得到菌濃度為3.7105cfu/mL。

圖2 綠孢鏈霉菌形貌

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

1)加煤量

圖3為加煤量對(duì)綠孢鏈霉菌降解光氧化內(nèi)蒙勝利褐煤降解液吸光度的影響，可知，隨著加煤量增加，A450值先增后減，加煤量為0.2 g(以20 mL培養(yǎng)基計(jì)，下同)時(shí)，A450達(dá)最大值，為2.437，加煤量大于0.3 g后，A450值急劇下降。可能是因?yàn)榧用毫枯^少時(shí)，菌株分泌的降解煤活性物質(zhì)與煤中相應(yīng)的活性點(diǎn)充分作用后還有剩余，雖然降解率達(dá)極大值，但降解產(chǎn)物濃度相對(duì)較低；當(dāng)加煤量為0.2 g時(shí)，菌株生長(zhǎng)過(guò)程中分泌的降解煤活性物質(zhì)與煤中的活性點(diǎn)相互作用程度較充分，雖可能未達(dá)到加煤量為0.1 g時(shí)的降解率，但由于二者相互作用充分，使相同體積情況下的降解產(chǎn)物濃度較大，故而A450值較大；繼續(xù)增大加煤量，由于煤漿濃度過(guò)大會(huì)抑制菌株的生長(zhǎng)，導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)不旺盛，分泌降解煤活性物質(zhì)減少，引起A450值減小。因此，20 mL培養(yǎng)基的最佳加煤量為0.2 g。

圖3 加煤量對(duì)降解液吸光度的影響

2)接種量

圖4為接種量對(duì)綠孢鏈霉菌降解光氧化內(nèi)蒙勝利褐煤降解液吸光度的影響，可以看出，隨著接種量增大，降解液的吸光度A450迅速增大，當(dāng)接種量達(dá)2.0 mL 時(shí)，降解液的A450值達(dá)2.541，繼續(xù)增大接種量，A450值增加緩慢，接種量達(dá)3.0 mL后，A450值變化甚微，故最佳接種量確定為3.0 mL。

圖4 接種量對(duì)降解液吸光度的影響

3)培養(yǎng)時(shí)間

圖5為培養(yǎng)時(shí)間對(duì)綠孢鏈霉菌降解光氧化內(nèi)蒙勝利褐煤降解液吸光度的影響，可見，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，降解液的吸光度A450值逐漸增大，10 d后，繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)降解液吸光度的影響不大，因此最佳培養(yǎng)時(shí)間確定為10 d。

圖5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)降解液吸光度的影響

4)振蕩頻率

圖6為培養(yǎng)箱振蕩頻率對(duì)綠孢鏈霉菌降解光氧化內(nèi)蒙勝利褐煤降解液吸光度的影響，可見，隨著振蕩頻率增大，A450值先增大后減小，最大值2.624出現(xiàn)在轉(zhuǎn)速160 r/min。這可能是因?yàn)殡S著振蕩頻率增大，培養(yǎng)基的氣液界面交替更頻繁，使培養(yǎng)基中溶解的氧相對(duì)較多，有利于綠孢菌的生長(zhǎng)繁衍，綠孢菌可分泌出較多的活性物質(zhì)，有利于煤的降解；此外，振蕩頻率越大，降解煤活性物質(zhì)與煤中的活性作用點(diǎn)接觸更充分。振蕩頻率過(guò)大時(shí)，雖有利于氧氣的溶解及降解煤活性物質(zhì)與煤中活性點(diǎn)的充分接觸，但劇烈的振蕩可能導(dǎo)致綠孢菌生長(zhǎng)的不適應(yīng)，從而使得綠孢菌產(chǎn)生降解煤活性物的能力降低，降解效果變差。因此，培養(yǎng)箱振蕩頻率確定為160 r/min。

圖6 振蕩頻率對(duì)降解液吸光度的影響

2.3 3種褐煤的降解效果

圖7為在單因素確定的最佳工藝條件下，綠孢鏈霉菌對(duì)GZTH、GHYH和GYBH降解試驗(yàn)結(jié)果?？梢?，綠孢鏈霉菌對(duì)3種光氧化褐煤的降解液吸光度分別為2.937、2.062和1.649，比菌煤匹配試驗(yàn)對(duì)應(yīng)的降解液吸光度(2.779、1.798和1.464)均有提高。經(jīng)單因素試驗(yàn)確定的綠孢鏈霉菌降解GSLH的最佳條件是綠孢鏈霉菌降解GZTH、GHYH和 GHYH的較優(yōu)工藝條件，該工藝條件具有一定的普適性。

圖7 3種光氧化褐煤的降解液450 nm吸光度值

3 結(jié) 論

1)菌-煤匹配試驗(yàn)篩選出的降解光氧化褐煤的優(yōu)勢(shì)放線菌菌株為綠孢鏈霉菌。

2)經(jīng)單因素試驗(yàn)確定的綠孢鏈霉菌降解光氧化內(nèi)蒙勝利褐煤的最佳工藝條件為：20 mL培養(yǎng)基的加煤量和接種量分別為0.2 g和3.0 mL，降解時(shí)間為10 d，培養(yǎng)箱振蕩頻率為160 r/min，煤樣粒度為0.150～0.075 mm，降解溫度為28 ℃。

3)按照單因素確定的最佳工藝條件，利用綠孢鏈霉菌對(duì)光氧化云南昭通褐煤、光氧化山西渾源褐煤和光氧化內(nèi)蒙元寶山褐煤進(jìn)行降解試驗(yàn)，結(jié)果表明降解效果均有一定程度的提升，可見該條件是這3種光氧化褐煤的較優(yōu)降解條件。