液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中喹噁啉類藥物的不確定度評價

賈 錚，李 蘭，趙根龍，周 劍，肖志明，李 陽，樊 霞

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，國家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（北京），北京 100081）

喹噁啉類化合物（Quinoxaline，QELs）是一類具有抗菌活性的物質(zhì)，代表性藥物主要有喹乙醇、卡巴氧、乙酰甲喹和喹烯酮，均屬于化學(xué)合成喹噁啉-1，4-二氧化合物[1]，自20 世紀(jì)70 年代以來已被廣泛用于畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中[1]。隨著人們對喹噁啉類化合物認識的深入，其毒性作用對動物帶來的損害以及造成食品安全的風(fēng)險越來越受到廣泛的關(guān)注[2]。2017 年“3.15”媒體曝光了部分廠商存在超范圍、超劑量使用藥物飼料添加劑，其中喹乙醇榜上有名。為配合農(nóng)業(yè)行政主管部門迅速、有效地打擊飼料生產(chǎn)和養(yǎng)殖環(huán)節(jié)違法使用喹噁啉類獸用抗菌藥物的行為，有必要對飼料中此類藥物檢測方法的不確定度進行準(zhǔn)確評定，以提高測量的準(zhǔn)確性和精密度，為此類藥物的監(jiān)管提供相應(yīng)的技術(shù)支撐。

喹噁啉類物質(zhì)含量的檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[3-4]和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCMS/MS）[5-8]，本文參考《化學(xué)分析測量不確定度評定》（JJF 1135-2005）[9]和《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1-2012）[10]，在采用標(biāo)準(zhǔn)方法《飼料中卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（農(nóng)業(yè)部2086 號公告-5-2014）[11]進行試驗的基礎(chǔ)上，優(yōu)化試驗操作步驟，并對配合飼料中4 種喹噁啉類藥物含量進行添加回收試驗，對檢測方法的不確定度來源、評價、合成以及量值結(jié)果進行探討，建立該方法的測量不確定度模型，對方法不確定度進行定量計算，為相應(yīng)檢測數(shù)據(jù)的正確評價提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑 色譜級乙腈、甲醇、甲酸（Fisher 公司）；鹽酸、二甲亞砜、磷酸二氫鉀均為分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；HLB 固相萃取小柱（200 mg，6 mL）（美國Waters 公司）；標(biāo)準(zhǔn)品卡巴氧（Carbdox）（純度≥99%）、喹乙醇（Laguindox）（純度≥99%）、喹烯酮（Qaincetone）（純度≥98.5%）（Sigma-Aldrich 公司），乙酰甲喹（Meguindox）（純度≥99.8%）（加拿大TRC公司）。

1.1.2 主要儀器 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：Finnigan TSQ Quantum Discovery Max（美國Thermo 公司）、3K15型離心機（美國Sigma 公司）、Eyela MG-2200 型氮吹儀（東京理化器械株式會社）、BP310s 型電子天平（賽多利斯公司）、BP211D 型電子天平（賽多利斯公司）、Q2-866 型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、SK3300 型超聲清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇各10 mg（精確至0.01 mg）于100 mL棕色容量瓶中，加入20 mL 二甲亞砜使固體溶解完全，之后用乙腈定容至刻度，混勻，轉(zhuǎn)移至試劑瓶，于-20℃冰箱內(nèi)避光保存。作為4 種喹噁啉類獸藥的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，該溶液中卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇濃度均為100 μg/mL，準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL 于100 mL 容量瓶內(nèi)，用乙腈稀釋至刻度作為混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，該溶液中4 種化合物濃度為1 μg/mL。

1.3 樣品提取 準(zhǔn)確稱取飼料樣品2 g（精確至0.001g），置于50 mL 聚乙烯離心管中，加入0.1%甲酸-乙腈溶液10 mL，渦旋混合1 min，超聲提取10 min，取出后放入離心機以9 000 r/min 離心5 min，收集上清液于50 mL聚乙烯離心管中；按照上述步驟重復(fù)提取1 次，合并提取液，混勻。準(zhǔn)確量取5.0 mL 提取液（為分取液）于10 mL 試管中，60℃下氮氣吹至約2 mL，加入4.0 mL 0.1 mol/L 磷酸二氫鉀充分溶解，備用。

1.4 樣品凈化 選用6 cc HLB 固相萃取柱對提取液進行凈化，分別用3 mL 甲醇、3 mL 水活化固相萃取柱，將1.3 樣品提取液過柱，控制過柱速度在1 mL/min 以內(nèi)，以3 mL 0.02 mol/L 鹽酸和3 mL 5%甲醇溶液淋洗固相萃取柱，擠干，以5 mL 甲醇洗脫2 次，收集并合并2次洗脫液，于60℃下氮氣吹干。準(zhǔn)確加入20%乙腈溶液1 mL，超聲5 min，渦旋振蕩1 min，過0.22 μm 濾膜，待測。

1.5 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液 稱取空白配合飼料樣品，按1.3～1.4 步驟操作制得1 mL 空白基質(zhì)樣品溶液，分別移取適量的卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，60℃下氮氣吹干后，加入1 mL 空白基質(zhì)樣品溶液溶解，配制成濃度為200 ng/mL 的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，超聲5 min 溶解殘余物，渦旋1 min，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.6 儀器分析條件

1.6.1 液相色譜條件 色譜柱：C18 柱，50 mm×2 mm，2.1 μm，美國Thermo 公司；柱溫：30℃；流動相：A 為0.1%甲酸水溶液，B 為0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.2 mL/min；進樣量：10 μL。

1.6.2 質(zhì)譜條件 離子源：ESI；電噴霧電壓：4 000 V；霧化溫度：350℃；輔助氣流速：8 L/min；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：SRM。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型 對基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣，以峰面積為縱坐標(biāo)、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，采用單點法對樣品進行定量。以試驗前處理步驟和儀器條件對添加一定濃度各化合物的配合飼料樣品進行測定，平行測定6 次得到各化合物含量的平均值分別為卡巴氧0.334 mg/kg、乙酰甲喹0.342 mg/kg、喹乙醇0.455 mg/kg、喹烯酮0.379 mg/kg。

試樣中待測物質(zhì)含量X（mg/kg）的計算公式：

式中，A為試樣溶液中待測藥物的峰面積；As為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液中待測藥物的峰面積；Cs為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液中待測藥物濃度（μg/mL）；V為溶解殘余物的體積（mL）；m為樣品的質(zhì)量（g）；V1為分取液體積（mL）；V2為提取液總體積（mL）。

2.2 不確定度來源分析 從檢測方法可以判斷，引入不確定度因素主要有樣品質(zhì)量、樣品前處理、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、檢測儀器、樣品的回收率以及測量重復(fù)性等，各不確定度來源因果關(guān)系見圖1。

圖1 配合飼料中4 種喹啉類獸藥含量測定的不確定來源

各影響因素相互獨立，且計算公式中各量值為乘除關(guān)系，因此合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度可以表征：

2.3 不確定度評定

2.3.1 樣品質(zhì)量m引入的不確定度 樣品質(zhì)量m引入的不確定度主要包括天平校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度u1（m）和天平重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度u2（m），試驗中使用的電子天平鑒定證書給出的重復(fù)性為1 mg，最大允許誤差為5 mg，按均勻分布考慮，6 次樣品稱量的平均值是2.019 g，則校準(zhǔn)產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.3.2 樣品提取、凈化過程溶液體積V引入的不確定度

2.3.2.1 提取液體積 在環(huán)境溫度為20℃條件下，10 mL移液器吸取10 mL 溶液時容量允許誤差為±0.6%，則校準(zhǔn)不確定度為：u1（V1000）=α/k=10 000×0.6%/ √—3=34.64 μL，溫度引入的不確定度：提取液為0.1% 甲酸乙腈溶液（4+6），在95%的置信系數(shù)下，溫度引起的體積變化：ΔV=V×液體膨脹系數(shù)×ΔT=7.92×0.002 07×3+0.08×0.001 03×3+12×0.001 37×3=0.098 7 mL，溫度引入的不確定度計算公式：u2（V1000）=α/k=0.098 7/1.96=50.35 μL；則10 mL 移液器引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

由此可以計算出提取液總體積V2的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：urel（V2）

2.3.2.2 分取液體積 過固相萃取柱的提取液體積 使用了5 mL可調(diào)節(jié)移液器，其不確定度：u1（V5000）=α/k=，溫度引入的不確定度：ΔV=V× 液體膨脹系數(shù)× ΔT=1.98×0.002 07×3+0.02×0.001 03×3+3×0.001 37×3=0.024 7 mL，溫度引入的不確定度計算公式：u2（V5000）=α/k=0.024 7/1.96=12.6 μL，則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.2.3 定容體積 定容體積V使用了1 mL 可調(diào)節(jié)移液器，其不確定度：u1（V5000）=α/k=1 000×0.6%/√—3 =3.464 μL，溫度引入的不確定度：ΔV=V×液體膨脹系數(shù)×ΔT=0.80×0.001 80×3+0.20×0.001 37×3=0.005 12 mL，溫度引入的不確定度計算公式為：u2（V5000）=α/k=0.005 12/1.96=2.61 μL，則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

因此，樣品在提取、凈化過程中由體積變化引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度 引入的不確定度

2.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度 由對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書查得，卡巴氧、喹乙醇、喹烯酮的相對擴展不確定度均為±1.0%，包含因子k=2，則其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：urel（p）=1.0%/2=0.005；乙酰甲喹的相對擴展不確定度為0.3%，包含因子k=2，則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度： urel（V3）=0.3%/2=0.001 5。

2.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品稱量m引入的不確定度 包括天平校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度u1（ms）和天平重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度u2（ms），試驗中使用的電子天平鑒定證書給出的重復(fù)性為0.05 mg，最大允許誤差為0.05 mg，按均勻分布考慮，則校準(zhǔn)產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.3.3.3 定容體積引入的不確定度 包括容量瓶校準(zhǔn)引入的不確定度u1（V100）、溫度引入的不確定度u2（V100）、容量瓶估讀誤差引入的不確定度u3（V100）。根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196-2006）[12]規(guī)定，100 mL容量瓶的允差為±0.10 mL，按均勻分布考慮，引入的不確定度：u1（V100）=0.10 mL/=0.057 7 mL。

用水對100 mL 容量瓶進行10 次的定容和稱量試驗，得到標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.06 mL，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度：u（1V100）

測定時的試驗環(huán)境為23℃，與容量瓶校準(zhǔn)時的溫度（20℃）相差3℃，乙腈的膨脹系數(shù)（20℃）為0.001 37，在95%的置信系數(shù)下，溫度引起的體積變化：ΔV=V×液體膨脹系數(shù)×ΔT=100×0.001 37×3=0.411 mL，溫度引入的不確定度：u2（V100）=α/k=0.411/1.96=0.209 7 mL；從而得到100 mL 容量瓶的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：urel（V100）=u（V100）/100=0.217/100=0.002 183。

2.3.3.4 稀釋引入的不確定度 根據(jù)《移液器計量檢定規(guī)程》（JJG 646-2006）[13]，在環(huán)境溫度為20℃條件下，1 mL移液器吸取1 mL 溶液時容量允許誤差為±1.0%，則校準(zhǔn)不確定度：u1（V1）=α/k=1 000×1.0%/=5.775 μL。

溫度引入的不確定度計算公式：u2（V1）=α/k=100×0.001 37×3/1.96=0.209 7 μL。

則1 mL 移液器引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：ure（lV1）=5.779/1000=0.005 779。

100 mL 容量瓶體積的不確定度分析同2.3.3.3 中容量瓶體積不確定度的計算，得到urel（V100）=0.002 183 mL。

稀釋過程按1:100 稀釋，引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

經(jīng)過計算，得到因標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的卡巴氧、喹乙醇、喹烯酮的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（Cs）=0.010 27，乙酰甲喹urel（Cs）=0.009 103。

2.3.4 重復(fù)性引入的不確定度 測量重復(fù)性引入的不確定度主要受實驗人員的熟練程度、儀器自身性能等因素影響，包括稱量的重復(fù)性、樣品提取和凈化過程中溶液體積變化的重復(fù)性、儀器檢測的重復(fù)性等，均屬于A類不確定度。本試驗將6 次平行測定的各組分含量值帶入貝塞爾公式，計算4 種化合物的標(biāo)準(zhǔn)偏差、標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，結(jié)果見表1。

2.3.5 添加回收率R 引入的不確定度 由表2 可見，6 次樣品添加回收試驗得到的卡巴氧、乙酰甲喹、喹乙醇和喹烯酮的添加回收率分別在80.7%～89.5%、80.9%～96.0%、87.2%～94.4%、85.5%～101.3%。

采用t檢驗法對各化合物平均回收率與1.0 進行顯著性檢驗，代入公式t=/－ 1.0//S（R）計算各化合物t值，與t（0.05,5）=2.015 比較以確定回收率是否計入含量的計算中。4 種化合物的t值分別為卡巴氧：t=4.53，乙酰甲喹：t=2.21，喹乙醇：t=2.59，喹烯酮：t=0.82，由計算結(jié)果可知，卡巴氧、乙酰甲喹和喹乙醇3 種化合物須采用回收率因子R修正結(jié)果。

2.3.5 合成不確定度、擴展不確定度及結(jié)果表示 由公式ure（lX）=計算得到4 種喹噁啉類藥物的合成不確定度，根據(jù)《化學(xué)分析測量不確定度評定》（JJF 1135-2005）中規(guī)定的一般正態(tài)分布、95%的置信區(qū)間對應(yīng)的k=2，則各化合物的擴展不確定度為U=urel××2，從而計算得到采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法測定配合飼料中4 種喹噁啉類藥物含量不確定度的結(jié)果，見表3。

3 結(jié) 論

本研究對液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定配合飼料中4種喹噁啉類獸藥含量的測量不確定度的評定結(jié)果表明，影響測量不確定度的主要因素是測量重復(fù)性、添加回收率，其次是標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和提取、凈化過程的溶劑體積變化，而樣品稱量過程引入的不確定度較小。因此，在實際操作過程中可以從試驗操作能力、儀器設(shè)備、測量重復(fù)性等方面考慮，通過培訓(xùn)提高操作人員的檢化驗水平、增加平行樣測定次數(shù)、定期檢定儀器設(shè)備、保持HPLC-MS/MS 的靈敏度和穩(wěn)定性以及嚴(yán)格控制實驗室環(huán)境等方式，盡量減小測量不確定度，從而保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

表1 含量測定結(jié)果數(shù)據(jù)

表2 回收率測定結(jié)果數(shù)據(jù)

表3 各組分?jǐn)U展不確定度及結(jié)果表示