赤水烏骨雞不同產蛋期CHRDL1 基因表達差異研究

羅 韋 ，李 輝*，陳 林，葉 濤，肖 濤，黃錫陽，司宗貴，周 迪，張小玉

（1.高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州貴陽 550025；3.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽 550025；4.貴州竹香雞養(yǎng)殖有限公司，貴州遵義 564708；5.貴州省種畜禽種質測定中心，貴州貴陽 550025）

腱蛋白樣蛋白1（Chordin-Like1，CHRDL1）基因位于雞的4 號染色體上，是一種分泌性骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）拮抗劑[1]。BMPs 是轉化生長因子β（TGF-β）超家族中的一員[2]，其中BMP4 與誘導胚胎分化、指導神經干細胞分化密切相關[3]。研究發(fā)現(xiàn)，BMP4 在造血組織、皮膚附屬物形成和分化以及腎臟、肝臟及神經系統(tǒng)發(fā)育中起一定的作用[4]，BMP4基因在小鼠卵巢組織中高表達，可促進原始卵泡的發(fā)育以及向初級卵泡轉化[5]。在對雞BMP4的基因結構與功能進行分析時發(fā)現(xiàn)，BMP4具有信號肽和潛在的糖基化、磷酸化位點，表明該生長因子在原始卵泡發(fā)育、早期胚胎發(fā)育中有著重要作用[6]。喻世剛等[7]研究發(fā)現(xiàn)，CHRDL1基因與沐川黑雞膚色性狀相關，且其SNP 位點c.-949T＞C 與膚色呈顯著相關。目前，關于CHRDL1基因的研究鮮有報道。

赤水烏骨雞主要分布于“楠竹之鄉(xiāng)”赤水市，該雞具有產綠殼蛋、耐粗飼、適應性強等特性[8]。綠殼蛋具有低膽固醇、低脂肪、富含硒和鋅等特點[9]，受到越來越多的關注。陳林[10]對360 日齡赤水烏骨雞蛋殼腺進行轉錄組測序分析發(fā)現(xiàn)，CHRDL1基因為蛋殼顏色深淺的下調基因，雖然已確定SLCO1B3基因為綠殼蛋的綠殼主效基因，在實際生產中盡管純合子的綠殼蛋雞都產綠殼蛋，但蛋殼的綠色程度深淺不一[11]。為探究CHRDL1基因對蛋殼綠色的影響，本研究檢測不同產蛋期赤水烏骨雞肝臟和蛋殼腺中CHRDL1基因的表達量，以豐富綠殼基因的研究結果，為赤水烏骨雞的選育提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取180、360、540 日齡的赤水烏骨雞母雞各100 只，根據(jù)基因型和蛋殼顏色分為6 類：純合型深綠色、純合型淺綠色、純合型淡綠色、雜合型深綠色、雜合型淺綠色、雜合型淡綠色。每種類型各個產蛋期隨機選取3 只母雞，共54 只，在其產蛋前2.5～3 h 屠宰，采集肝臟和蛋殼腺。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計 在GenBank 中檢索到CHRDL1基因和SLCO1B3基因的mRNA 序列分別是NM_204171.1和NM_001318449.1，利用Primer Premier 5 進行引物設計，引物由貴陽春滿谷生物科技有限公司合成，具體信息見表1。

表1 引物信息

1.2.2 綠殼基因分型 采集180、360、540 日齡赤水烏骨雞母雞各100 只血液2～3 mL，翅下采血，EDTA 抗凝，使用血液基因組DNA 提取試劑盒（購自北京天根生化科技有限公司）提取血樣中的DNA，采用雙重PCR 對SLCO1B3基因進行分型，分為綠殼純合型、綠殼雜合型和純合非綠殼。雙重PCR 反應體系為（20 μL）：Taq PCR Mastermix（購自北京天根生化科技有限公司）10 μL（0.1 U/μL），上下游引物各 1 μL（10 μmol/L），DNA 模板1 μL（200 ng/μL），加ddH2O 補足20 μL。反應程序：94℃預變性5 min，35 個循環(huán)（94℃變性30 s、51.3℃退火40 s、72℃延伸40 s），72℃延伸10 min，4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產物，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察基因型。

連續(xù)7 d 觀察各日齡純合型和雜合型母雞每天所產蛋的顏色，將產蛋顏色均勻的母雞做好標記，并收集180 日齡純合型和雜合型產蛋顏色均勻的母雞所產的蛋，測其蛋殼中膽綠素的含量，并按照蛋殼中膽綠素含量的高低將綠殼蛋分為深綠色、淺綠色、淡綠色，并以此作為實驗動物分類的參照，結合基因型和蛋殼顏色將實驗動物分為純合型深綠色、純合型淺綠色、純合型淡綠色、雜合型深綠色、雜合型淺綠色、雜合型淡綠色6 類。

蛋殼膽綠素測定方法參考劉敬壽[12]和卜小雁[13]的方法。稱取原卟啉36 mg、膽綠素26 mg 溶解于6 mL溶劑中，溶劑由濃鹽酸和甲醇按1:2 的比例配制而成，漩渦振蕩，避光保存18 h，分別制成原卟啉和膽綠素的標準原液[11]。將原液稀釋成8、16、32、64、128、256、512 倍，利用紫外分光光度計分別測定在412 nm和680 nm 處蛋殼溶解液的吸光值[12]。測定不同綠色深淺蛋殼中膽綠素含量時發(fā)現(xiàn)，膽綠素含量越高其蛋殼綠色越深。周玉[14]研究發(fā)現(xiàn)，可以采用NR 型蛋殼顏色色差計測量蛋殼顏色，不同綠色深淺的蛋殼其數(shù)值不同，蛋殼綠色越深其數(shù)值越小。

1.2.3 RNA 的提取 采集不同產蛋期的赤水烏骨雞的蛋殼腺和肝臟，采用Trizol 法提取組織樣的總RNA，經紫外分光光度計檢測，OD260/OD280的比值介于1.9～2.1之間，平均濃度達到3 000 ng/μL，具體步驟按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 實時熒光定量PCR 擴增體系及程序 為測定不同產蛋期的赤水烏骨雞蛋殼腺和肝臟中CHRDL1基因的表達量，本實驗采用實時熒光定量PCR 的方法測定，反應體系采用20 μL 體系：SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）10 μL（1 x），上下游引物各0.6 μL（10 μmol/L），cDNA 1 μL（1 000 ng/μL），ddH2O 7.8 μL；反應條件按照SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）說明書進行。

1.2.5 統(tǒng)計分析 運用SPSS 22.0 軟件對本實驗所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析，并進行t檢驗。表中數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標準差表示，以P＜0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1SLCO1B3基因PCR 擴增結果 檢測結果如圖1 所示，綠殼純合子（SL/SL）產物片段大小為884 bp，綠殼雜合子（SL/W）產物片段大小為884 bp 和732 bp，非綠殼純合子（W/W）產物片段大小為732 bp。3 種基因型的凝膠電泳產物片段大小與目的片段大小一致，表明該分型結果可以用于赤水烏骨雞的基因分型。

圖1 SLCO1B3 基因PCR 擴增結果圖

2.2 蛋殼膽綠素含量分析 由表2 可知，180 日齡時，基因型相同時，深綠色的蛋殼膽綠素含量極顯著高于淺綠色及淡綠色，淺綠色的蛋殼膽綠素含量極顯著高于淡綠色。相同蛋殼顏色的情況下，純合型與雜合型間膽綠素含量不存在顯著差異，但是純合型的蛋殼膽綠素含量略高于雜合型。對CHRDL1基因的表達量與蛋殼中膽綠素含量進行相關系數(shù)計算，結果顯示相關系數(shù)為-0.888 3，呈極顯著負相關。

表2 180 日齡不同綠色蛋殼的膽綠素含量

2.3CHRDL1基因的差異表達分析

2.3.1 赤水烏骨雞蛋殼腺中CHRDL1基因的表達情況CHRDL1基因在蛋殼腺中不同顏色間的表達情況如表3所示，180 日齡時，純合型的情況下，深綠色極顯著低于淡綠色，淺綠色與其他兩者之間無顯著差異，雜合型的情況下，深綠色極顯著低于淺綠色，淺綠色極顯著低于淡綠色；360 日齡時，純合型的情況下，深綠色和淺綠色間不存在顯著差異，深綠色和淺綠色均極顯著低于淡綠色，雜合型的情況下，深綠色極顯著低于淺綠色，淺綠色極顯著低于淡綠色；540 日齡時，純合型的情況下，深綠色極顯著低于淺綠色和淡綠色，淺綠色和淡綠色間不存在顯著性差異，雜合型的情況下，深綠色和淺綠色間不存在顯著差異，均極顯著低于淡綠色。

當?shù)皻ゎ伾嗤瑫r，CHRDL1基因在不同基因型的赤水烏骨雞蛋殼腺中的表達情況為：180 日齡、360日齡和540 日齡時，都表現(xiàn)為在淡綠色蛋殼的情況下，純合型極顯著低于雜合型，其他蛋殼顏色情況下純合型與雜合型間不存在顯著性差異。

表3 CHRDL1 基因在蛋殼腺中的表達情況

如圖2 所示，CHRDL1基因在不同日齡的赤水烏骨雞蛋殼腺中的表達量不存在顯著差異。

圖2 不同日齡的赤水烏骨雞蛋殼腺中CHRDL1 基因的差異表達

2.3.2CHRDL1基因在肝臟中表達量的情況 由表4 可知，同一產蛋期CHRDL1基因在純合型赤水烏骨雞肝臟中的表達情況為深綠色極顯著低于淺綠色和淡綠色，180 日齡時淡綠色與淺綠色間不存在顯著差異；在雜合型赤水烏骨雞肝臟中的表達情況為深綠色極顯著低于淺綠色和淡綠色，淺綠色極顯著低于淡綠色。

表4 CHRDL1 基因在肝臟中的表達情況

在蛋殼顏色相同時，CHRDL1基因在不同基因型的赤水烏骨雞肝臟中的表達情況為：180 日齡、360 日齡和540 日齡時，都表現(xiàn)為在淡綠色蛋殼的情況下，純合型中的表達量極顯著低于雜合型，540 日齡淺綠色情況下，純合型中的表達量顯著低于雜合型，其他蛋殼顏色情況下不存在顯著性差異。

不同日齡的赤水烏骨雞肝臟中CHRDL1基因的差異表達情況如圖3 所示，純合型深綠色、純合型淺綠色的條件下，180 日齡和540 日齡的赤水烏骨雞肝臟中CHRDL1基因的表達量顯著低于360 日齡，純合型淡綠色的情況下，180 日齡和540 日齡極顯著低于180 日齡；雜合型淡綠色的條件下180 日齡和540 日齡顯著低于360 日齡，其余情況下不同日齡的赤水烏骨雞肝臟中CHRDL1基因的表達量不存在顯著性差異。

圖3 不同日齡的赤水烏骨雞肝臟中CHRDL1 基因的差異表達

3 討 論

本實驗發(fā)現(xiàn)，隨著蛋殼綠色的加深，CHRDL1基因的表達量降低，與轉錄組測序和相關分析的結果一致，認為CHRDL1基因可能是影響蛋殼綠色深淺的微效基因。目前對CHRDL1基因的功能及分子調控機制的研究較少。本實驗發(fā)現(xiàn)CHRDL1基因的表達量與蛋殼綠色深淺存在規(guī)律性，因此推測CHRDL1基因可能與綠殼蛋的蛋殼色素沉積有關，將會對其進一步研究。

相關研究表明蛋殼膽綠素是在肝臟中合成并由殼腺部分泌的[14]，360 日齡為產蛋的高峰期，此時肝臟中色素合成的速度加快[15]。本次實驗發(fā)現(xiàn)，360 日齡的赤水烏骨雞肝臟中CHRDL1基因的表達量高于180 日齡和540 日齡，因此推測CHRDL1基因可能與色素的合成有關。

相關研究表明蛋殼色素有殼腺部合成和血液中合成2 種途徑[15]，Polin[16]研究發(fā)現(xiàn)子宮組織合成卟啉量為肝組織的2 倍，且不隨組織重量的增加而變化；Li 等[17]采用熒光定量PCR 對產深淺褐殼蛋母雞肝臟及蛋殼腺的基因表達量進行研究，發(fā)現(xiàn)卟啉-Ⅸ在蛋殼腺中合成。原卟啉和膽綠素是2 種主要的蛋殼色素[18]。本實驗采集360 日齡赤水烏骨雞的蛋殼腺做了轉錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)CHRDL1基因為蛋殼綠色的下調基因[10]，為了驗證轉錄組測序的結果，本實驗利用qPCR 技術檢測了CHRDL1基因在不同產蛋期的赤水烏骨雞肝臟和蛋殼腺中的表達量，驗證了CHRDL1基因為蛋殼綠色的下調基因這一測序結果。

4 結 論

本實驗結果顯示，CHRDL1基因在赤水烏骨雞肝臟和蛋殼腺中的表達量表現(xiàn)為雜合子的表達量高于純合子，在不同基因型都表現(xiàn)為隨蛋殼顏色變深CHRDL1基因的表達量降低，與本課題組前期轉錄組測序的結果顯示CHRDL1基因為負調控基因相符合，并且與本研究相關分析結果顯示的CHRDL1基因表達量與蛋殼膽綠素含量呈極顯著負相關一致。推測該基因可能為蛋殼顏色的負調控基因，其作用機理有待進一步研究。