副豬嗜血桿菌病研究進展

張昆麗，李春玲

（廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站，廣東 廣州 510640）

副豬嗜血桿菌病又稱格拉澤氏?。℅l?sser's disease），是由副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis, HPS）引起的豬全身性炎癥反應，主要表現(xiàn)為急性滲出性纖維素炎、多發(fā)性纖維素性漿膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎等。Gl?sser于1910年首次發(fā)現(xiàn)豬漿液性纖維素性胸膜炎、心包炎和腦膜炎的病料中存在一種革蘭氏陰性菌，但由于該菌在外界死亡速度較快，對培養(yǎng)和保存條件要求苛刻，很大程度上阻礙了人們對該病的研究，直到1922年Schermer和Ehrlich首次從病料中分離到該菌。該菌由于生長過程中需要V因子和X因子，1931年被命名為豬副流感（Haemophilus influenza suis），1943年Hj?rre和Wramby又將其命名為豬嗜血桿菌（Haemophilus suis），之后證明該菌生長僅需V因子，最終更名為副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis）。2020年，經(jīng)過詳細的系統(tǒng)發(fā)育分析，副豬嗜血桿菌被重新命名為Glaesserella parasuis，但該命名尚未在國際上統(tǒng)一使用［1］。

副豬嗜血桿菌病在全球范圍內(nèi)廣泛流行，歐洲、大洋洲以及美國、加拿大、日本等國均有報道，在我國不同地區(qū)也普遍流行。2020年Ni等［2］綜合分析了PubMed、中國知網(wǎng)等5個國內(nèi)外數(shù)據(jù)庫中關于HPS血清流行病學及病原流行病學的數(shù)據(jù)，結果顯示，2005—2019年，HPS在我國豬群中的綜合平均陽性率約27.8%，其中血清流行病學陽性率為29.8%，病原流行病學陽性率為12.5%；2011—2015年綜合平均陽性率高達41.0%；該病全年發(fā)病，秋冬季節(jié)陽性率為35.4%，春夏季節(jié)約21.8%，且全年齡段的豬均易感?？梢?，在我國豬群中HPS感染較為常見。副豬嗜血桿菌病的發(fā)生通常與動物應激密切相關，多呈散發(fā)，隨著生產(chǎn)模式的轉(zhuǎn)變和免疫抑制病毒的出現(xiàn)，HPS常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒、偽狂犬病毒、鏈球菌、大腸桿菌等混合感染，加上長期濫用抗生素，使HPS的耐藥性嚴重，導致該病成為當前生豬養(yǎng)殖過程中常見、多發(fā)且危害嚴重的豬呼吸系統(tǒng)重要傳染性疾病之一［3-4］?？股厥沁^去治療和預防HPS感染最常見的手段，但由于抗生素的耐藥性對公共衛(wèi)生安全具有重大的隱患，減少抗生素使用已成為全球共識。自2020年7月1日起，我國開始全面執(zhí)行在飼料中禁止添加抗生素、在養(yǎng)殖過程中減少抗生素使用的政策，替代抗生素的防控策略將成為副豬嗜血桿菌病防控的主要方案。本文總結了國內(nèi)外關于HPS的致病機制、診斷方法和疫苗的研究進展，以期為副豬嗜血桿菌病的防控提供參考。

1 副豬嗜血桿菌的致病機理研究

1.1 血清型

HPS是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD）依賴的非運動、多形態(tài)、有莢膜的革蘭氏陰性小桿菌，為豬的上呼吸道常駐菌，一般在仔豬出生2 d后就能在鼻腔中檢測到。該菌血清型眾多，且各菌株間毒力差距較大，非毒力菌株是仔豬鼻腔中正常微生物菌群的一部分，毒力菌株則是引起副豬嗜血桿菌病的主要病原。HPS呈地方性流行，不同地區(qū)、國家的流行毒株不盡相同。研究發(fā)現(xiàn)，HPS至少有15個血清型，且部分分離株的血清型仍不確定，其中血清4型、5型是目前全球流行最廣泛的菌株。2007—2015年間，我國南方以4型（25.17%）、5型（23.15%）、12型（20.47%）和13型（6.04%）為主要流行血清型［5］；2014—2017年，5型（26.6%）、4型（22.4%）、7型（9.1%）、13型（6.3%）、12型（5.6%） 和不能分型的HPS菌株（8.4%）為我國的優(yōu)勢流行血清型［6］；廣東地區(qū)的HPS也以4型、5型和12型為主要流行血清型［7］。HPS菌株血清型還與毒力相關，其中血清1型、5型、10型、12型、13型、14型為強毒力菌株，血清2型、4型、8型、15型為中等毒力菌株，3型、6型、7型、9型和11型為無毒力型菌株［8］。

1.2 致病機制與毒力因子

細菌的致病機制主要包括病原菌對宿主粘附、入侵，逃避宿主的免疫防御體系，細菌在體內(nèi)繁殖和對組織損傷等多種方式。HPS通過附著在黏液層和下層上皮細胞而定植在粘膜上。毒力菌株和無毒力菌株均可在上呼吸道定植，一旦進入氣管及下呼吸道，毒力菌株就表現(xiàn)出更高的定植能力。毒力菌株的成功定植與其逃避宿主免疫球蛋白IgA的殺傷作用相關。IgA是宿主粘膜防御功能中一道重要防線，通過結合病原菌，捕獲病原及其產(chǎn)物，阻斷粘附素和細胞受體的相互作用而抑制病原菌的定植。研究表明，一些HPS菌株可以切割豬源IgA，這些菌株可能通過IgA蛋白酶的作用克服宿主粘膜的防御機制，從而向各組織侵入，但目前尚未發(fā)現(xiàn)與HPS編碼IgA蛋白酶相關的基因［9］。此外，HPS在引起肺炎感染時，與生物被膜形成相關的基因siaB、htrA、fumC、gcpE和acrR表達上調(diào)［10］，表明HPS在粘膜表面的定植能力與體外生物被膜的形成相關。

肺部的天然免疫系統(tǒng)是控制呼吸道病原感染最重要的防線，逃避宿主肺組織的天然免疫反應是HPS導致全身感染的另一關鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，與非毒力菌株相比，在感染早期，毒力菌株能夠逃避肺泡巨噬細胞的吞噬，其中HPS三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白家族中的VtaA8、VtaA9及生物被膜形成在這過程中具有重要作用［11-12］。致病性HPS進入血液能夠逃避抗體依賴補體介導的殺傷作用，在血液中存活且隨著血液流動導致全身性感染。引起豬全身性感染的HPS分離株普遍具有血清抗性，而從健康豬鼻腔分離的菌株則對血清的殺菌效應十分敏感，表明HPS菌株的血清抗性是其致病的重要特性之一。目前發(fā)現(xiàn)HPS外膜蛋白OmpP2、脂寡糖庚糖轉(zhuǎn)移酶（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）、調(diào)節(jié)LOS末端唾液酸化的α-2'3'唾液酸轉(zhuǎn)移酶（lsgB）、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（GalU）、UDP-葡萄糖-4表異構酶（GalE）、多糖合成蛋白（CapD），以及細胞致死膨脹毒素（CDTs）等表面結構與血清抗性相關［13-17］。

炎癥反應和細胞因子的產(chǎn)生是病原微生物感染后進一步介導宿主損傷的關鍵環(huán)節(jié)。HPS感染誘導新生仔豬氣管細胞（NPTR）、豬腦微血管內(nèi)皮細胞（PBMEC）、PK-15細胞產(chǎn)生IL-6、IL-8等細胞因子，6-磷酸葡萄糖脫氫酶（6PGD）、脂寡糖（LOS）等毒力因子在此過程中發(fā)揮重要作用［18］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，HPS通過MyD88依賴途徑和TRIF依賴途徑激活PK-15細胞的NF-κB、p38和JNK MAPK信號通路，誘導IL-8、CCL4及RANTES表達［19-21］。此外，HPS感染PK-15和NPTR細胞，激活與細胞膜移動性和粘附性相關的Wnt/β-catenin信號通路，且HPS感染后導致細胞膜上E-cadherin表達下調(diào)，并使β-catenin和E-cadherin的相互作用減弱，破壞細胞的黏附連接［22］。此外，HPS感染氣管上皮細胞后，通過誘導Caspase3依賴的細胞調(diào)亡，促進氣管粘膜的破壞。在病原微生物感染過程中，病原微生物與機體免疫反應的相互博弈推動疾病的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸。

綜上，HPS主要通過降解粘膜表面的IgA、抵抗巨噬細胞吞噬和血清中補體介導的殺菌作用來逃避天然免疫，在宿主中持續(xù)存在，進而引發(fā)廣泛的炎癥反應，這可能是導致副豬嗜血桿菌病的重要原因。但關于HPS如何突破血腦屏障導致腦膜炎，如何進入血液循環(huán)系統(tǒng)形成菌血癥，以及HPS感染導致全身性漿膜炎、纖維素炎等的具體分子機制仍不清楚。

2 副豬嗜血桿菌的實驗室診斷研究

對病原微生物準確、高效地診斷是防控細菌性疫病的關鍵措施之一。病原診斷包括臨床診斷、病理剖檢和實驗室診斷。HPS感染的臨床癥狀通常并非特異性的，如發(fā)熱、咳嗽、腹部呼吸、關節(jié)腫脹和跛行，以及側壓、蹬車和震顫等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的癥狀。剖檢急性死亡的仔豬可見特有的纖維性多漿膜炎，偶爾還會出現(xiàn)膿性卡他性肺炎，慢性感染則表現(xiàn)出生長減緩和纖維性多漿膜炎病變。但由于目前豬病混合感染嚴重，通過臨床癥狀和病理剖檢很難對疾病進行診斷，而要弄清病原乃至病原的血清型必須依靠實驗室診斷。常用實驗診斷方法包括細菌分離鑒定、血清學診斷和分子生物學檢測等。

2.1 細菌分離鑒定

細菌分離鑒定是HPS診斷的金標準。利用金色葡萄球菌給HPS生長提供NAD的原理，用接種金色葡萄球菌的TSA/PPLO培養(yǎng)基進行HPS分離培養(yǎng)，HPS在金色葡萄球菌周圍生長呈“衛(wèi)星現(xiàn)象”；巧克力瓊脂平板、添加NAD的PPLO/TSA培養(yǎng)基也常用于HPS分離培養(yǎng)［23-24］。由于HPS是豬上呼吸道的常在菌，鼻咽試紙、扁桃體等分離到的HPS往往不能代表致病性HPS，因此對副豬嗜血桿菌病的診斷，通常選擇具有呼吸道癥狀豬的心、肝、脾、腎、腦等內(nèi)臟組織病料，且分菌病料必須保證無菌采樣、新鮮，離體時間過長，長期冷凍的病料往往很難分離到HPS。對分離到的疑似菌株還必須結合生化鑒定結果，與其他不溶血的NAD依賴菌（如吲哚放線桿菌、豬放線桿菌和小放線桿菌）相區(qū)別。

2.2 血清學診斷

臨床上應采用補體結合試驗（Complement fixation test, CF）、平板凝集試驗、間接血凝試驗（Indirect hemagglutination test, IHA）及酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）檢測HPS的抗體水平。Nielsen等［8］早已證實，在補體結合試驗中各種血清型之間具有廣泛的交叉反應性，無法區(qū)分待檢HPS血清型。平板凝集試驗常用于評估HPS疫苗免疫的抗體水平，如魏子貢等［25］通過醛化鞣酸化的綿羊紅細胞凝集4型、5型抗原的間接血球凝集試驗，得到免疫2周后的豬群抗體檢出率達89%，且特異性和重復性良好。ELISA具有簡便、快捷、適用場景廣泛等優(yōu)點，是目前研發(fā)較多的HPS血清學檢測方法。以HPS的保護性抗原外膜蛋白P2（OPP2）和P5（OPP5）作為ELISA檢測抗原，已建立了多種不同的檢測方法［26-29］；馮小明等［30］以超聲波裂解的HPS作為抗原，建立了間接ELISA抗體檢測方法，與間接血凝方法比較，具有簡單、快速、敏感等特點；宋帥等［31］以OPP5的特異性單克隆抗體作為捕獲抗體、HPS的兔多克隆抗體作為檢測抗體，建立了檢測靈敏度達1 ×106CFU/mL的雙抗夾心ELISA檢測方法。與CF和IHA相比，ELISA檢測方法敏感性較高，穩(wěn)定性較好，易于自動化操作，檢測效率較高，是一種良好的早期診斷方法。

2.3 分子生物學檢測

分子生物學診斷方法主要針對病原核酸，利用不同的檢測原理，準確診斷樣品中是否含有病原的特異性基因序列，具有特異性好、靈敏度高、快速、簡便的優(yōu)點。HPS的分子生物學診斷方法，主要有PCR法、環(huán)介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）、交叉引物擴增核酸試紙條法等。目前已經(jīng)建立的HPS分子生物學檢測方法主要針對16S rRNA、infB、OmpP2、PalA、wzs5基因，其中16S rRNA、infB是最常用的檢測靶標基因。普通PCR檢測方法具有操作簡單、成本低等優(yōu)點，但檢測靈敏度不足。目前已建立的HPS普通PCR檢測方法特異性較好，對DNA的檢測下限為 10-5～10-6μg/mL［32］。靈敏度較高的SYBR Green或Taq Man探針的熒光定量PCR檢測方法的檢測下限為10～100 copies/μL，該類方法敏感性高、特異性好，且較為穩(wěn)定，是目前HPS實驗室診斷和定量分析的常用方法［33-34］。由于PCR、熒光定量PCR檢測方法必須借助儀器才能對病原進行診斷，而LAMP和交叉引物擴增核酸試紙條法這類核酸等溫擴增技術則不需要特殊儀器，在恒溫條件下即可進行快速反應，并呈現(xiàn)可視化的反應結果，比較適用于基層的臨床檢測和進出口岸的通關檢測。HPS的LAMP法檢測下限為10-5～10-7μg/mL，其敏感度與普通PCR相近甚至高于普通PCR的100倍，結果的靈敏度往往與反應體系、可視化判斷結果標準相關［35］。由于LAMP的結果主要通過肉眼對液體的濁度和熒光亮度進行判定，存在一定的主觀性，不利于可疑樣品的精確判斷。交叉引物擴增核酸試紙條法是通過設計特異的交叉引物和探針，并進行特殊的生物標記后將等溫擴增和核酸試紙條技術相結合的一種簡單快速的檢測方法。Gou等［36］針對HPS的wzs5基因建立的交叉引物擴增核酸試紙條檢測方法，60℃恒溫反應1 h，即可通過帶有垂直流可視化的反應條帶，對14 CFU以上的HPS進行檢測。此外，由于臨床上HPS常與豬鏈球菌、偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等混合感染，多重PCR或多重熒光定量PCR等方法相繼建立，如賈愛卿等［37］根據(jù)HPS和豬鏈球菌的16S rRNA保守區(qū)建立了雙重鑒別診斷PCR檢測方法，實現(xiàn)一次檢驗即可高效快速地鑒定兩個病原。

分子血清分型是HPS分子生物學診斷一大研究熱點。根據(jù)腸桿菌基因間重復序列（ERIC）核心序列設計反向引物，經(jīng)PCR擴增出HPS基因組結構特征條帶，對臨床菌株進行血清型分型。HPS的ERIC-PCR基因分型可為地方性暴發(fā)的HPS遺傳背景及種源追溯提供重要的參考依據(jù)，比血清分型更適合流行病學分析［38］。從眾多HPS菌株中區(qū)分出毒力菌株，很有可能從根本上改變副豬嗜血桿菌病的診斷。根據(jù)VtaA基因與菌株毒力的相關性，Galofre-Mila等通過PCR擴增VtaA基因的先導序列預測菌株的毒力［39-40］；Howell等［41］采用全基因組關聯(lián)分析（GWAS）對200個HPS分離菌株進行分析，優(yōu)選出10個可能與HPS致病性相關的基因，并通過建立多重PCR篩選高致病性菌株。上述鑒定毒力菌株的PCR方法，通過呼吸道樣品就能夠為養(yǎng)豬場中副豬嗜血桿菌病的風險評估提供重要依據(jù)，但仍需要對更多臨床菌株作進一步分析才能完全驗證這些技術的準確性。

3 副豬嗜血桿菌病疫苗的研究

控制副豬嗜血桿菌病3個關鍵要素分別是科學的種群管理、合理使用抗菌藥物和有效的免疫接種。母豬是HPS在豬群中傳播的源頭，因此母豬是該病的重要防控群體。隨著對濫用抗生素危害的認識，我國和世界各國已相繼出臺相關減抗、禁抗政策法規(guī)，抗生素將逐步退出HPS的防控環(huán)節(jié)。因此疫苗接種將成為防控該病的最主要措施。

HPS是一種胞外病原體，體液免疫反應產(chǎn)生的抗體在豬群感染發(fā)病中發(fā)揮重要作用［42］。仔豬在哺乳期間與母豬接觸后，獲得HPS定植，同時通過初乳獲得母源抗體，建立定植和免疫之間的平衡?？贵w能夠促進巨噬細胞吞噬并殺死HPS，且抗體對補體的殺傷作用影響較小。但經(jīng)商品化ELISA試劑盒和PCR檢測抗體與抗原陰性的豬仍能抵抗高致病性菌株，表明機體可能還存在除抗體以外的其他免疫保護性機制。疫苗是目前已知的用于防控病原微生物最直接、經(jīng)濟、高效的方式，接種疫苗和免疫抗體通常被認為是控制副豬嗜血桿菌病最有效的手段。目前研發(fā)的HPS疫苗主要包括滅活疫苗、亞單位疫苗和菌影疫苗。

3.1 滅活疫苗

滅活疫苗在全球副豬嗜血桿菌病的防控中發(fā)揮了重要作用。細菌滅活疫苗通常用37℃甲醛溶液處理48 h滅活，用高速離心將細菌培養(yǎng)物制粒后，再用無菌的磷酸鹽緩沖液重懸，然后用適當?shù)淖魟┤绲V物油、氫氧化鋁或蜂膠配制。目前HPS的商品化疫苗均為滅活疫苗，相同血清型保護效果較好，但不同血清型間的交叉保護效果較差，甚至沒有保護力。因此，目前商品化的HPS疫苗以多價苗為主。疫苗菌株通常是從臨床感染的強毒株中篩選出來，主要以血清1型、4型、5型為主［43］。目前，市場上流通的HPS疫苗有7種，分別是西班牙海博萊生物大藥廠生產(chǎn)的預防血清1型和6型二價滅活苗、美國勃林格殷格翰公司生產(chǎn)的Z-1517株滅活苗、山東濱州沃華生物公司等生產(chǎn)的1型LC株+5型LZ株滅活苗、普萊柯生物公司生產(chǎn)的4型JS株+5型ZJ株滅活苗、武漢科前生物公司生產(chǎn)的二價滅活苗以及共同預防豬鏈球菌感染的二聯(lián)滅活苗，以及山東華宏生物公司生產(chǎn)的預防血清4型、5型、12型和13型的四價蜂膠滅活苗［44］。廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所針對廣東地區(qū)HPS的主要流行血清型，通過動物模型篩選出臨床優(yōu)勢強毒株，成功研制出HPS的4型、5型和12型三價滅活疫苗［45-48］。該疫苗對HPS的同型菌株具有80%的免疫保護力，對其他血清型具有一定交叉免疫保護作用，目前已獲得三類新獸藥證書。

HPS滅活疫苗通常在母豬產(chǎn)前接種，誘導母體產(chǎn)生持續(xù)3周左右的高濃度抗體，仔豬斷奶前接種可持續(xù)保護豬群。雖然副嗜血桿菌的滅活疫苗有眾多優(yōu)勢，在市場上也具有較好的應用前景，但存在一些局限性。首先，滅活疫苗不可能包含區(qū)域內(nèi)傳播的所有毒力血清型；其次，礦物油和氫氧化鋁等現(xiàn)有佐劑，在含有多種抗原的疫苗中很難保持相同的注射劑量和相同的保護水平，接種時缺乏其中一種抗原都很可能導致接種動物免疫失敗，暴發(fā)副豬嗜血桿菌病，故開發(fā)更有效的佐劑可能是改進HPS疫苗的新途徑；第三，免疫保護期短，需要多次免疫才能產(chǎn)生長期的保護作用；第四，無法區(qū)分自然感染和疫苗接種的動物。

3.2 亞單位疫苗

亞單位疫苗是含有特異HPS抗原分子，通過對致病性菌株中存在的共同表位進行免疫反應，達到免疫保護的效果。這類疫苗不含有病原微生物的核酸等遺傳物質(zhì)，對豬群無安全隱患。此外，該類疫苗穩(wěn)定性好、易儲存和運輸，能區(qū)分自然感染與免疫接種的動物，因此更適合作為一種新型疫苗的研究方向，并成為未來防治HPS感染的理想疫苗。

亞單位疫苗的設計通常根據(jù)免疫蛋白質(zhì)組學和基因組序列聯(lián)合分析，選擇可能具有免疫原性的表面蛋白和分泌蛋白。成功表達重組蛋白、獲取高效的蛋白產(chǎn)量以及蛋白折疊充分是亞單位疫苗研發(fā)必須逐一突破的關鍵環(huán)節(jié)。近期已鑒定到的具有高效免疫原性的重組蛋白有超氧化物歧化酶、Omp26、VacJ、HAPS 0742、HxuC、HxuB、TolC、LppC、HAPS_0926、Omp16、HbpA、OppA、HPS-04307、AfuA 和 HktE［49-52］。其中用 TolC、LppC、HAPS_0926的重組蛋白免疫后，小鼠抗原特異性IgG滴度和淋巴增殖反應顯著升高，外周血中CD4+、CD8+T細胞上升，IL-2、IL-4和IFN-γ分泌水平顯著增加；在HPS全血殺菌試驗中，這3個抗原的抗血清能有效抑制細菌存活，且多蛋白聯(lián)合免疫能誘導機體產(chǎn)生更明顯的免疫反應，免疫保護效果與單一蛋白免疫效果相比顯著上升［50］；在豚鼠模型中，Omp26、VacJ和HAPS 0742重組蛋白分別免疫后，用致死劑量的HPS感染豚鼠，具有顯著的保護作用［53］；Li等［53-54］研究發(fā)現(xiàn)，重組表達HbpA、OppA、HPS-04307、AfuA、OmpP2蛋白免疫小鼠后，能誘導小鼠產(chǎn)生強烈的體液免疫和細胞免疫反應，有效抑制了HPS在小鼠體內(nèi)的增殖并給予小鼠40%～80%的保護。但上述新發(fā)現(xiàn)的蛋白是否能有效地保護豬還需要進一步驗證。與毒力菌株高效反應的特異性抗原表位決定了亞單位疫苗免疫保護的效率。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)氨酸酶、VtaA和TbpAB蛋白的特異性抗原表位在抗HPS特定血清型感染中發(fā)揮了重要作用，但這些抗原表位對HPS其他血清型的交叉保護作用仍不理想，通用抗原表位的發(fā)現(xiàn)很可能是解決HPS亞單位疫苗交叉保護力差的一種途徑［55-57］。

外膜囊泡（Outer membrane vesicles，OMVs）是革蘭氏陰性菌在自然環(huán)境下分泌的一種雙層膜泡狀囊泡，由脂多糖、磷脂、肽聚糖、外膜蛋白、細胞壁成分、核酸（DNA、RNA）和離子代謝物等多種生物活性物質(zhì)組成，直徑在20～250 nm之間［58］。OMVs不僅具有較好的免疫原性，能有效激活機體的免疫反應，還能作為免疫佐劑使用。隨著腦膜炎奈瑟菌B群OMVs疫苗的上市，OMVs被認為是極具潛力的候選亞單位疫苗或者疫苗載體。McCaig等［59］研究發(fā)現(xiàn)，HPS（Nagasaki株）的OMVs免疫無母源抗體的仔豬后，用致死劑量的同菌株經(jīng)滴鼻感染仔豬，免疫組14 d內(nèi)的保護率達100%。豚鼠模型試驗表明，經(jīng)滴鼻免疫OMVs的后，豚鼠粘膜免疫水平顯著上升［60］。但HPS自然分泌的OMVs產(chǎn)量較少，純化過程復雜，且缺乏精確定性標準，如何高效提升OMVs的產(chǎn)量和控制OMVs的質(zhì)量，是OMVs亞單位疫苗能否成為商品化疫苗的關鍵技術瓶頸。

雖然上述多種實驗性亞單位疫苗已在豬模型中顯示出保護作用，但仍未能解決血清型間交叉保護的問題。高效交叉保護性疫苗是今后HPS亞單位疫苗研制的方向，該類疫苗的研發(fā)有賴于更加詳細的HPS致病機制的闡明，以及更多毒力因子和交叉保護性抗原的揭示。

3.3 菌影疫苗

“細菌幽靈”是革蘭氏陰性菌在噬菌體PhiX174的裂解基因E作用下，在細菌膜上形成一個直徑為40～200 nm的特異性跨膜孔道，由于滲透壓的差異，胞質(zhì)內(nèi)容物經(jīng)孔道排出，形成無細胞漿和核酸的細菌空殼［61］。菌影疫苗正是以這種細菌空殼作為抗原免疫動物，以獲得對該菌的免疫保護力。與其他類型的疫苗相比，菌影疫苗具有完整的細菌膜和相關免疫原性蛋白，可有效遞送抗原和誘導較強免疫應答；而且“細菌幽靈”中含有的脂多糖和肽聚糖等成分均可作為天然佐劑；“細菌幽靈”還可以作為載體，表達其他細菌或病毒抗原，制備多聯(lián)多價疫苗。此外，由于“細菌幽靈”特殊的遺傳滅活方式，疫苗中不含核酸等遺傳物質(zhì)，具有良好的生物安全性，且可常溫儲藏與運輸，因此可降低生產(chǎn)成本。目前研究表明，大腸桿菌、幽門螺旋桿菌、胸膜肺炎防線桿菌、多殺性巴氏桿菌、嗜血桿菌等在裂解基因E的作用下均能產(chǎn)生“細菌幽靈”。胡明明［62］以血清5型HPS為載體，成功制備了HPS菌影，發(fā)現(xiàn)該菌影疫苗對仔豬具有較好的免疫保護力，為HPS新型高效菌影疫苗的研制開發(fā)與應用提供了支持。胡本鋼［63］利用抗菌肽聯(lián)合超高壓方法成功制備的HPS菌影，對小鼠具有100%免疫保護力，為HPS菌影疫苗的大規(guī)模制備和工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎。

4 展望

副豬嗜血桿菌可感染斷奶到屠宰任何階段的豬群，且廣泛地與多種病毒、細菌、支原體混合感染，是導致豬呼吸系統(tǒng)疾病的重要病原。在全球限制抗生素使用和我國減抗、禁抗政策實行的背景下，副豬嗜血桿菌病的流行很可能更加普遍，多血清型、多病原的混合感染將更加嚴重，發(fā)病特征也將更加模糊，給疾病的診斷與治療造成更大困難。因此，如何高效防控HPS感染將成為現(xiàn)代化、集約化養(yǎng)殖需要解決的關鍵問題。精準的病原監(jiān)控與診斷、良好的生物安全措施和合理的疫苗接種計劃是控制副豬嗜血桿菌病的關鍵。深入開展HPS的致病機制研究，闡明不同分子在HPS感染中的作用，揭示HPS的毒力因子，準確鑒別毒力菌株與非毒力菌株，推動HPS診斷方法的發(fā)展和疫苗設計至關重要。隨著各種檢測方法不斷改進，對于HPS的診斷已更加靈敏、準確、客觀和迅速，但目前HPS的確診主要依賴實驗室診斷，且目前用于血清分型的檢測方法操作、分析繁瑣，仍需開發(fā)更多適用于不同場景的簡便、快速、特異性強的檢測方法，這對HPS早期感染的及時診斷、新菌株的發(fā)現(xiàn)和流行病學調(diào)查具有重要意義。

疫苗免疫是今后細菌性疾病防控的主要手段，但目前HPS商品化疫苗僅滅活疫苗一類，且血清型間交叉保護效率差，現(xiàn)有的滅活疫苗技術又無法包含所有血清型，這很可能成為HPS防控的漏洞。多種亞單位疫苗、菌影疫苗等研究雖已取得較好試驗結果，但仍未解決疫苗交叉保護力差這一難題。由于流行疫病較多，仔豬在較短的免疫期內(nèi)往往需要進行多次不同病原的疫苗接種，導致多次應激、免疫力下降、疾病暴發(fā)的風險增加，且疫苗間可能存在相互影響而降低免疫效果，直接增加了生產(chǎn)成本。因此，研究新的安全高效佐劑、不同疫苗接種途經(jīng)和具有高效交叉保護作用的疫苗，以及推動單針疫苗的研制是今后HPS疫苗研發(fā)的重點。