觀察環(huán)境中分離的銅綠假單胞菌噬菌體對燒傷感染小鼠的治療作用

張歡歡

（河南醫(yī)學高等?？茖W校檢驗系，河南 鄭州 451191）

在醫(yī)院感染病原菌中，銅綠假單胞菌占有重要地位，在呼吸科革蘭陰性菌中位居首位。近年來，銅綠假單胞菌耐藥性在大量應用各種廣譜抗菌藥的作用下日益提升。在我國，在所有醫(yī)院感染革蘭陰性桿菌中，銅綠假單胞菌位居首位，對碳青霉烯類抗生素的耐藥性已經(jīng)在30%以上，具有極為復雜的耐藥機制。相關(guān)醫(yī)學統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示[1]，合并銅綠假單胞菌感染的死亡燒傷患者占總數(shù)的50%。因此，臨床很有必要深入研究噬菌體療法這一抗感染治療方法。本研究觀察了燒傷感染小鼠環(huán)境中分離的銅綠假單胞菌噬菌體的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

購買上海新興化工試劑研究所生產(chǎn)的瓊脂粉，杭州天和廠生產(chǎn)的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，Amersco公司生產(chǎn)的CsCl，自行配置LB培養(yǎng)液；河南省人民醫(yī)院檢驗科分離并鑒定的21株銅綠假單胞菌；從龍湖鎮(zhèn)居民生活用水下水道中分離噬菌體，經(jīng)噬菌斑、電鏡觀察鑒定。擴增培養(yǎng)噬菌體后離心，途徑為經(jīng)CsCl密度梯度，并純化、生理鹽水稀釋，對滴度進行測定，在此過程中將噬菌斑充分利用起來，稀釋到1×1010PFU/ml待用，稀釋過程中將生理鹽水充分利用起來；購買鄭州大學實驗動物中心提供的健康雌性SPF級ICR小鼠，周齡6～8周，平均（7.0±1.0）周；體重18-22g，平均（20.0±2.0）g。

1.2 方法

1.2.1 燒傷感染模型建立

在10 ml LB培養(yǎng)液中按1:100比例稀釋新鮮培養(yǎng)的銅綠假單胞菌，繼續(xù)培養(yǎng)到對數(shù)生長期，濃度為1×108CFU/ml，A50為0.5左右。分實驗小組為7組，每組5只，將其背部毛剃掉，面積為小鼠體表面積的10%，直徑為2.5 cm的圓形，讓小鼠吸入乙醚對其進行麻醉，待其無足趾反射后在鼠夾上固定小鼠，用90℃的熱水將其燙傷，持續(xù)10 s，為了對燙傷引發(fā)的體液丟失進行補充，將0.1 ml不同濃度的銅綠假單胞菌皮下注射到燒傷部位，同時給予其皮下注射0.5 ml生理鹽水，將燒傷感染模型建立起來，給予對照組注射等量生理鹽水，對小鼠進行5 d觀察，將最小致死劑量（LD100）設定為1組小鼠全部死亡的最小劑量，并將其設定為燒傷動物模型的感染劑量。

1.2.2 噬菌體療效觀察

分實驗小鼠為6組，每組5只，開始計時時間為建立燒傷感染模型后，感染后即刻、3 h、6 h、12 h、24 h分別給予其腹腔注射0.1 ml效價為1×1010PFU/ml的噬菌體。每組均將對照組設置出來，給予其注射等劑量生理鹽水，將小鼠生存率記錄下來。

1.2.3 滅活噬菌體的治療作用分析

加熱噬菌體30 min，條件為在90℃的溫度下，效價為1×1010PFU/ml，滅活。分實驗小鼠為3組，每組5只，分別給予其注射0.1 ml噬菌體、滅活噬菌體、給予其注射等量生理鹽水（對照組），時間為燒傷感染后即刻。

1.2.4 非宿主菌感染小鼠噬菌體的治療作用分析

分實驗小鼠為3組，分別給予其注射0.1 ml生理鹽水+0.1 ml該噬菌體宿主菌（對照組）、0.1 ml噬菌體+0.1 ml噬菌體宿主菌、0.1 ml噬菌體+0.1 ml噬菌體宿主譜以外的銅綠假單胞菌，時間為燒傷后，將小鼠生存率記錄下來。

1.2.5 噬菌體體內(nèi)代謝研究

給予實驗小鼠腹腔注射1 ml高濃度噬菌體，時間為開始計時前，分別在第1 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h將血液從小鼠斷尾取出，對噬菌體效價進行測定，在此過程中運用噬菌斑法，重復實驗3次，將濃度時間曲線繪制出來。

1.3 統(tǒng)計學分析

計數(shù)資料用率表示，用x2檢驗。采用SPSS 21.0，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 噬菌體分離鑒定

將宿主菌設定為銅綠假單胞菌，將3株銅綠假單胞菌噬菌體從下水道中分離出來，其中寬噬噬菌體1株，電鏡觀察為短尾噬菌體，直徑、尾長分別為45 nm、50 nm，裂解譜、噬菌斑大小分別為6株銅綠假單胞菌、2 mm，命名其為Pap-co1，將1株從6株宿主菌、宿主譜以外的銅綠假單胞菌選取出來，分別命名為Pap-co1、Pap-co2，，在實驗研究中應用。

2.2 細菌最小致死劑量確定

對燒傷小鼠進行感染，途徑為稀釋新鮮培養(yǎng)的細菌Papco1為1×103-1×108PFU/ml，然后將第2 d、5 d小鼠的生存率選取出來，其中第5 d 1×106-1×108CFU/ml劑量組小鼠均死亡，因此絕對最小致死劑量為1×106CFU/ml。

2.3 滅活噬菌體Pap-co1療效分析

滅活噬菌體組、對照組小鼠第2 d、5 d的生存率80.0%、20.0%，80.0%、0均顯著低于正常噬菌體組100.0%、100.0%（P＜0.05），但滅活噬菌體組、對照組小鼠第2 d、5 d的生存率之間的差異均不顯著（P＞0.05）。

2.4 Pap-co2燒傷感染小鼠噬菌體的治療作用分析

Pap-co2組、對照組小鼠第2 d、5 d生存率60.0%、0,80.0%、0均顯著低于Pap-co1組100.0%、100.0%（P＜0.05），但Pap-co2組、對照組小鼠第2 d、5 d生存率之間的差異均不顯著（P＞0.05）。

2.5 噬菌體Pap-co1體內(nèi)代謝動力學觀察

給予小鼠腹腔注射噬菌體Pap-co1，其第一時間被吸收，1 h內(nèi)達到最高峰，24 h內(nèi)維持噬菌體濃度在104左右，維持在一定濃度范圍內(nèi)一定時間后逐漸降低。

3 討 論

相關(guān)醫(yī)學研究表明[2-3]，在燒傷感染小鼠的治療中，寬噬噬菌體具有顯著的作用，同時具有較低的抗原性，能夠?qū)嶒炓罁?jù)提供給抗感染治療中進一步將生物制劑設定為噬菌體。本研究結(jié)果表明，對燒傷小鼠進行感染，途徑為稀釋新鮮培養(yǎng)的細菌Pap-co1為1×103-1×108PFU/ml，然后將第2d、5d小鼠的生存率選取出來，其中第5 d 1×106-1×108CFU/ml劑量組小鼠均死亡，因此絕對最小致死劑量為1×106CFU/ml。滅活噬菌體組、對照組小鼠第2 d、5 d的生存率80.0%、20.0%，80.0%、0均顯著低于正常噬菌體組100.0%、100.0%（P＜0.05），但滅活噬菌體組、對照組小鼠第2 d、5 d的生存率之間的差異均不顯著（P＞0.05）。Pap-co2組、對照組小鼠第2d、5d生存率60.0%、0,80.0%、0均顯著低于Pap-co1組100.0%、100.0%（P＜0.05），但Pap-co2組、對照組小鼠第2 d、5 d生存率之間的差異均不顯著（P＞0.05）。給予小鼠腹腔注射噬菌體Pap-co1后第一時間被吸收，1 h內(nèi)達到最高峰，24 h內(nèi)維持噬菌體濃度在104左右，維持在一定濃度范圍內(nèi)一定時間后逐漸降低，和上述研究結(jié)果一致，說明噬菌體可以作為一種生物制劑，在抗感染治療中優(yōu)勢獨特顯著。但是，其對宿主菌具有特異性，因此在臨床的應用受到了限制?；诖?，在抗感染治療中，在對噬菌體生物制劑進行應用時，為了顯著提升噬菌體的抗感染治療價值，應該將一個噬菌體庫建立起來，其基礎(chǔ)為細菌的噬菌體分型，并將有效依據(jù)提供給臨床進一步深入研究抗感染治療[4]。

綜上所述，燒傷感染小鼠環(huán)境中分離的銅綠假單胞菌寬噬噬菌體的治療作用明顯，同時具有較低的抗原性。