HPLC法同時測定細(xì)葉亞菊中綠原酸和異綠原酸A的含量

裴榮冠,林鵬程

(1.青海民族大學(xué) 藥學(xué)院，青海 西寧 810007；2.青海省藥物分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810007；3.青海省青藏高原植物資源化學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810007)

細(xì)葉亞菊(Ajaniatenuifolia(Jacq.) Tzvel)菊科，亞菊屬,為多年生草本植物，主要分布在青海、四川西北部、西藏東部海拔2 000～4 580米處[1].菊科植物一般富含黃酮和酚酸類成分[2-3]，可通過HPLC-MS進(jìn)行鑒定.細(xì)葉亞菊中含有金絲桃苷、槲皮素、異槲皮素苷、木犀草素、新綠原酸、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B等成分[3].其中綠原酸和異綠原酸A是細(xì)葉亞菊的主要化學(xué)成分.綠原酸和異綠原酸A具有良好的藥理活性.綠原酸具有心血管保護(hù)、抗誘變、抗癌、抗白血病、抗菌及抗病毒作用，還能降脂、免疫調(diào)節(jié)、降糖等[4-7].異綠原酸A可抑制白細(xì)胞遷移和炎癥過程超氧陰離子的產(chǎn)生，具有良好的體外抗炎作用[8-9].目前，細(xì)葉亞菊中綠原酸的含量已由薛敬[10]等測定為9.457 mg/g，細(xì)葉亞菊異綠原酸A尚未建立測定方法.筆者在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，建立了HPLC法同時測定細(xì)葉亞菊中綠原酸和異綠原酸A含量的方法[11-12].該方法準(zhǔn)確、簡便，可用于細(xì)葉亞菊中綠原酸和異綠原酸A含量的同時測定.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器

Aglient1200型高效液相色譜儀， METTLER AL204電子天平，昆山潔力美超聲儀器有限公司(KQ-800E)超聲波清洗器.

1.1.2 試驗(yàn)材料

綠原酸對照品(四川省維克奇生物科技有限公司,批號wkq19010201)；異綠原酸A對照品(四川省維克奇生物科技有限公司,批號wkq19022505);乙腈(山東禹王和天下新材料有限公司)；磷酸(天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠)均為色譜純；水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水.細(xì)葉亞菊采于青海省貴德江拉林場,經(jīng)青海民族大學(xué)林鵬程教授鑒定為菊科亞菊屬細(xì)葉亞菊.

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6×250 mm 5 μm);流動相:乙腈-0.1%磷酸水溶液(19︰81)；流速為1 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長330 nm;樣品進(jìn)樣量10 μL.該色譜條件下綠原酸和異綠原酸A可達(dá)到基線分離.

1.2.2 溶液配制

供試液的制備:取細(xì)葉亞菊粉末1 .0 g，加甲醇50 mL，超聲提取1 h，提取兩次.合并濾液，甲醇補(bǔ)足，定容50 mL容量瓶中，即得供試液.

對照品溶液制備:取綠原酸和異綠原酸A對照品1.0 mg，精密稱定，加甲醇制成1 mL含50 μg的溶液.

1.2.3 樣品的測定

取上述對照品、供試品溶液各 10 μL，在“1.2.1”色譜條件下分別注入液相色譜儀，色譜圖見圖1.

1.2.4 線性關(guān)系

精密吸取異綠原酸A對照品溶液1、2、4、8、10、16 μL，以峰面積(Y)對進(jìn)樣量(μg)進(jìn)行線性回歸，得綠原酸回歸方程為Y= 39.673X + 15.788，r=0.998 4，異綠原酸A回歸方程為Y= 147.79X- 5.8167，r=0.999 8.結(jié)果表明，綠原酸和異綠原酸A進(jìn)樣量在0.05～0.8 μg的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系(見圖2).

1.2.5 精密度試驗(yàn)

取綠原酸和異綠原酸A對照品溶液，記錄其峰面積(Y)，測得綠原酸和異綠原酸A的峰面積的RSD分別為0.4%、0.32%(n=6)，說明該儀器精密度良好，結(jié)果見圖1.

圖1細(xì)葉亞菊供試品 圖2綠原酸和異綠原酸A

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，以“1.2.1”項(xiàng)色譜條件取同一份供試品溶液，室溫下分別在0、2、4、8、12 h進(jìn)樣測定，綠原酸和異綠原酸A平均含量的RSD分別為0.32%、0.34%.結(jié)果表明，供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定.

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號樣品6份，每份約1 g，精密稱定，于“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測定峰面積(Y)，計(jì)算綠原酸和異綠原酸A的平均含量分別為8.37 mg/g、 5.51 mg/g，RSD為0.40%、0.15%.結(jié)果表明,本方法重復(fù)性良好,見表1.

1.2.8 回收率試驗(yàn)

分別精密稱取樣品6份(每份約1.0 g)，加標(biāo)量為所測含量的1倍，綠原酸的平均回收率為98.46%，異綠原酸A的平均回收率為99.52%.

表1 異綠原酸A加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

1.2.9 樣品的測定

在“1.2.1和1.2.2”項(xiàng)的色譜條件下測得細(xì)葉亞菊中綠原酸含量為8.37 mg/g，RSD為0.40%(n=6)，異綠原酸A的含量為5.51 mg/g,RSD為0.15%(n=6).

2 討論

2.1 波長選擇

通過對綠原酸和異綠原酸A的全波譜掃描及相關(guān)文獻(xiàn)查詢[8,11-12]，綠原酸和異綠原酸A最大吸收波長為330 nm(見圖3、圖4),故選取330 nm作為紫外檢測器檢測波長.

圖3 綠原酸光譜掃描圖 圖4 異綠原酸A光譜掃描圖

2.2 提取溶劑選擇

綠原酸和異綠原酸A母核結(jié)構(gòu)由咖啡酰與奎尼酸構(gòu)成，其分子結(jié)構(gòu)中有酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚三個不穩(wěn)定部分，不易進(jìn)行熱提取.綠原酸和異綠原酸A難溶于水，可溶于有機(jī)試劑，且細(xì)葉亞菊中含有大量黃酮[3].大量的黃酮會影響綠原酸和異綠原酸A含量的測定，故未選取不同濃度的乙醇進(jìn)行提取[10].又因甲醇較為廉價(jià)且毒性較低，故選取甲醇為提取溶劑.

2.3 流動相選擇

綠原酸極性較大，易造成色譜峰拖尾，通過使用0.1%磷酸水溶液可改善峰型，減少色譜峰拖尾現(xiàn)象.

3 結(jié)論

綠原酸和異綠原酸A的峰在20 min內(nèi)出峰完畢，能夠?qū)崿F(xiàn)科學(xué)、規(guī)范、簡單、快捷的分析要求.經(jīng)測定證明，細(xì)葉亞菊中綠原酸和異綠原酸A含量較高.該方法準(zhǔn)確、簡便，可用于細(xì)葉亞菊中綠原酸和異綠原酸A含量的同時測定.